Yöntem makalesi

Adsorptif Biyoproses, Pseudomonas stutzeri'den Melanin Verimini Artırıyor

1.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63339

⸱

12 Ocak 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

Bu makalede

Özet

Burada, biyolojik bir ürün, özellikle de kendi biyosentezini inhibe eden ve onu üreten mikroorganizmanın büyümesini engelleyen bir pigment üretmek için adsorptif biyoproses hakkında bir protokol sunuyoruz.

Özet

Melaninler doğal pigmentlerdir ve indol halkası ve çok sayıda fonksiyonel grubun varlığı, melanini UV koruyucu maddeler, cilt bakımı, kozmetik vb. gibi birçok uygulama için ideal bir seçim haline getirir. Bir deniz Pseudomonas stutzeri , tirozin ilavesi olmadan melanin üretir. Geri besleme inhibisyonu, melanin üreten bir deniz bakterisi olan Pseudomonas stutzeri'nin kültüründe melanin tarafından gözlendi. Melanin ayrıca mikrobiyal büyüme inhibisyonu gösterdi. Han-Levenspiel modeline dayalı analiz, hücre büyümesi üzerinde melaninin rekabetçi olmayan tip ürün inhibisyonunu tanımladı. Melanin üreten tirozinaz enzimi, melanin tarafından inhibe edildi. Farklı melanin konsantrasyonlarının varlığında enzimatik reaksiyonun çift karşılıklı grafiği, rekabetçi olmayan ürün inhibisyonunu ortaya çıkardı. Melanin tarafından geri besleme inhibisyonunu azaltmak için adsorban bazlı bir adsorptif biyoproses geliştirilmiştir. Melanin adsorpsiyonu için en iyi adsorbanı seçmek için farklı adsorbanlar tarandı. Dozaj miktarı ve süresi, adsorptif biyoprosesi geliştirmek için optimize edildi, bu da deniz bakterileri Pseudomonas stutzeri (153 mg / L ila 1349 mg / L) tarafından tirozin ve maya özütü takviyesi olmadan melanin üretiminde 8.8 kat artış ile sonuçlandı.

Giriş

Melaninler, monomerik birimi indol halkası olan polifenol bileşikleridir. Melaninler, bitkilerin, hayvanların ve mikroorganizmaların siyah, kahverengi ve gri renklerinin çoğundan sorumludur1. En yaygın melaninler, omurgalılarda ve omurgasızlarda yaygın olarak bulunan koyu kahverengi veya siyah pigmentler olan eumelaninlerdir2. Kafadanbacaklılar, bitkiler ve mikroplar melanin3'ün başlıca kaynaklarıdır. Mikroorganizmalardan elde edilen melanin, kafadanbacaklılardan ve bitkilerden elde edilen melanine göre çeşitli avantajları vardır. Büyümeleri hızlıdır ve mevsimsel değişikliklerde herhangi bir soruna neden olmazlar. Ayrıca, büyüme ortamına ve sağlanan çalışma koşullarına göre kendilerini değiştirirler. Tüm bu gerçekler göz önüne alındığında, mikrobiyal kaynaklar, potansiyel ticari uygulamalarla önemli bir melanin kaynağı olarak kullanılmaktadır 4,5,6. Guo ve ark. optimize edilmiş bir ortamda 28.8 g / L'ye kadar melanin üretmek için rekombinant Streptomyces kathirae SC-1 kullandı7. Lagunas-Muñoz ve ark. Rekombinant E. coli8'de yaklaşık 6 g / L melanin elde edildi. Wang ve ark. orta optimizasyondan sonra yaklaşık 4.2 g / L çözünür melanin eldeetti 9. Araştırmacılar ayrıca melanin üretmek için deniz kültürlerini de araştırdılar. Kiran ve ark. denizel Pseudomonas türü10'dan melanin üretti. Kumar ve ark. besin suyunda melanin üreten deniz yosunundan Pseudomonas stutzeri HMGM-7'yi izole etti. Bildirilen tüm melanin üreticileri, melanin üretimi için orta takviyeler, maya özü ve / veya pepton gerektirir ve bu da biyoprosesin ölçeklendirilmesini engelleyebilir. Raman ve ark. pahalı katkı maddeleri gerektirmeyen Aspergillus fumigatus AFGRD105'dan melanin üretimini araştırdı11.

Melanin üretimi için deniz yosunundan izole edilen Pseudomonas stutzeri olarak bilinen bir deniz bakterisi seçildi. Bu mikroorganizma, çözünür melanin üretimi için ek tirozin ve maya özütü takviyesi gerektirmez ve deniz suyu bazlı ortamlarda büyür, böylece içme suyu ayak izini ve orta maliyeti azaltır. Thaira ve ark. önceki bir yayında bu deniz bakterisini kullanarak melanin nanopigment üretimi için hindistancevizi keki unu kullanarak optimize edilmiş bir biyoproses bildirdi12. Üretilen melanin, sentetik yeraltı suyundan ağır metallerin yüksek verimli bir şekilde uzaklaştırılması için kullanıldı. Bununla birlikte, orta optimizasyon sırasında, melaninin büyüme ve ürün oluşumu üzerinde makul geri bildirim inhibisyonu tespit edildi. Bu nedenle, bu protokolde, melaninin geri besleme inhibisyonu, genelleştirilmiş Han-Levenspiel modeli kullanılarak araştırılır ve ölçülür. Geri besleme inhibisyonunu maksimum ölçüde azaltmak için basit ve etkili bir adsorptif biyoproses protokolü geliştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Pseudomonas stutzeri kültürünün büyümesi ve sürdürülmesi.

  1. Pseudomonas stutzeri bakterisini MTCC Chandigarh'dan (dondurularak kurutulmuş ampul olarak verilir) elde edin.
    1. Ampulün yüzeyini alkolle dezenfekte edin (% 70). Ampulü göstergenin ortasına yakın bir yerde işaretleyin ve işaretli alanda kırın.
      NOT: İçindekiler vakumda olduğu için ampulün açılmasına özen gösterilmelidir. Ampulü kırarken önlem alın, çünkü bir çıtçıtlı açıklık pamuklu tapayı bir ucuna çekecek ve aceleci bir açıklık mikrobun liyofilize ince parçacıklarını havaya bırakacaktır.
    2. Pamuklu tıkacı sterilize edilmiş cımbızla dikkatlice çıkarın ve ampule 0,3 mL Luria Bertani (LB) suyu ekleyin. 30 dakika bekletin.
    3. 100 μL süspansiyonu 10 mL LB suyuna (100 mL konik şişede) aşılayın ve 37 °C'de tutulan 180 rpm'de inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin. Aynı anda 100 μL süspansiyonu katı LB agar'a aktarın ve izole koloniler elde etmek için yayın. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Kültür büyüdükten sonra 4 °C'de saklayın.
  3. Her 4 haftada bir, bir koloniyi taze bir LB agar plakasına çizerek ve kolonilerin ortaya çıkması için plakayı gece boyunca 37 ° C'de inkübe ederek alt kültür yapın.

2. Melaninin büyüme ve enzim aktivitesi üzerine inhibisyon çalışmaları

  1. Yapay deniz suyuna sırasıyla 51.4 g/L glikoz, 49.8 g/L hindistan cevizi keki unu, 0.09 g/L, 0.03 g/L ve 0.05 g/LCuS05 G/LCuS04, FeSO4 ve MgS04 ekleyerek kültür ortamını hazırlayın (Malzeme Tablosu). Tüm deneyleri, 200 rpm, 37 °C ve başlangıç pH'ı 7'de 15 mL doldurma hacmine sahip 250 mL'lik bir çalkalama şişesinde gerçekleştirin.
  2. Biyoprosesin başlangıcında her kültür ortamına farklı konsantrasyonlarda melanin (100 mg / L, 200 mg / L, 500 mg / L ve 1000 mg / L) ekleyin.
  3. Eklenen her melanin konsantrasyonu için spesifik büyüme hızını, hücrelerin enzim aktivitesini ve melanini biyoprosesin farklı zaman aralıklarında ölçün (bölüm 3.2).

3. Melanin inhibisyonu kinetiğinin modellenmesi

  1. Melanin üretiminin inhibisyon kinetiğini modellemek için aşağıdaki genelleştirilmiş Han ve Levenspiel13 denklemini kullanın,
    figure-protocol-1 (1)
    Nerede
    μ = görünür spesifik büyüme oranı (1/h)
    μmaks = maksimum özgül büyüme oranı (1/h)
    p = ürün konsantrasyonu (g/L)
    p *= büyümenin durduğu kritik ürün konsantrasyonu (g/L)
    s = substrat konsantrasyonu (g/L)
    m,n = parametreler
    Yukarıdaki denklem şu şekilde yeniden yazılabilir:
    figure-protocol-2 (2)
    Nerede
    figure-protocol-3 (3)
    ve figure-protocol-4 (4)
    Yukarıdaki denklem, aşağıda verildiği gibi, 1/μ'ye karşı 1/s'lik çift karşılıklı bir arsa olarak yeniden düzenlenebilir
    figure-protocol-5 (5)
  2. Yukarıdaki denklemi kullanarak farklı spesifik büyüme oranları ve substrat konsantrasyonlarının verilerini kullanarak düz bir çizgi çizin. Sırasıyla Y ve X ekseni üzerindeki kesişme noktası, μobs ve Kobs elde etmek için sırasıyla 3. ve 4. eşitlikte ikame edilebilen μmax ve K s verir.
    Denklem (3) şu şekilde yazılabilir:
    figure-protocol-6 (6)
  3. Adım 2.2'de yetiştirilen kültürün spesifik büyüme oranını hesaplayın ve bunu μobs olarak adlandırın.
  4. Denklem (6)'daki adım 3.3'te elde edilen spesifik büyüme oranının değerini kullanın. Verileri doğrusal bir denkleme sığdırın ve eğimi ve kesişim noktasını hesaplayın.
  5. Melanin yokluğunda maksimum spesifik büyüme oranını hesaplamak için denklem (3) kullanın.

4. Adsorptif biyoprosesin geliştirilmesi

  1. Tüm deneyleri, 200 rpm, 37 °C ve başlangıç pH'ı 7'de 15 mL doldurma hacmine sahip 250 mL'lik bir çalkalama şişesinde gerçekleştirin.
  2. Optimize edilmiş son biyoprosesi, 3 L'lik dosyalama hacmine sahip 5 L'lik karıştırılmış bir tank biyoreaktöründe gerçekleştirin. Biyoreaktör çalışmalarında kültürün pH'ını 7-7.5 arasında ve çözünmüş oksijeni doygunluğun P-`'ı arasında tutun.

5. Mevcut farklı adsorbanlardan en iyi adsorbanın seçimi

  1. Kültür suyunu içeren farklı şişelere alümina, zeolit, kelite, fuller's earth ve aktif karbon gibi farklı adsorbanlar ekleyin.
  2. Her bir adsorbanı kültür suyuna 1 g / L'lik bir konsantrasyonda ayrı ayrı ekleyin ve 12 için 150 rpm'de döner bir çalkalayıcıda tutun.
  3. Adsorbanları 10 dakika boyunca 5000 x g'da santrifüjleme ile ayırın ve bir spektrofotometre kullanarak süpernatantın emilimini 400 nm'de ölçün.
  4. Kültür suyundan maksimum miktarda melanini adsorbe eden adsorbanı seçin.

6. Adsorbanın dozaj süresinin etkisi

  1. Biyoprosesi başlatın ve kültürden en yüksek melanin adsorpsiyonunu sağlayan adsorbanı ekleyin (bölüm 5'ten sonra seçilir). İlk adımda seçilen konsantrasyon 1 g/L'dir.
  2. Daha önce yayınlanan protokol12'ye göre maksimum melanin üretimini ölçün.
  3. Biyoprosesin başlamasından 12 saat sonra adsorbanı ekleyerek adım 6.1'i tekrarlayın ve biyoprosesin farklı zamanlarında melanin üretimini ölçün.
  4. Biyoprosesin başlamasından 24 saat, 36 saat ve 48 saat sonra adsorbanı ekleyerek adım 6.3'ü tekrarlayın.
  5. Her bir biyoproses çalışmasında üretilen melanini karşılaştırın ve maksimum melanin üretimi ve geri kazanımı için en iyi dozaj süresini belirleyin.

7. Adsorban dozaj miktarının etkisi

  1. Bölüm 6'da tanımlanan zamanda kültürlere en iyi adsorbanın farklı konsantrasyonlarını (0.5, 1, 2, 4, 6, 8 ve 10 g / L) ekleyin.
  2. Biyoprosesi 10 dakika boyunca 5000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.
  3. Süpernatanı toplayın ve 400 nm'de absorbansı ölçerek melanin miktarını hesaplayın.
  4. Adsorbana bağlı hücreleri ve diğer bileşikleri çıkarmak için adsorban içeren peleti her biri damıtılmış su ve etanol ile iki kez yıkayın. Yıkama adımını 10 dakika boyunca 5000 x g'da santrifüjleme ile gerçekleştirin.
  5. Melanini desorbe etmek için yıkanmış adsorbana 0.1 M NaOH çözeltisi ekleyin.
  6. Karışımı 5000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanttaki melanin miktarını bir spektrofotometre ile 400 nm'de ölçün.
  7. Desorpsiyon işlemini üç kez veya adsorban normal rengine dönene kadar tekrarlayın.
  8. Melanini çökeltmek için manyetik boncuklu bir karıştırıcı kullanarak 1 N HCl ekleyerek bu konsantre desorbe edilmiş melanin çözeltisinin pH'ını 3 veya daha azına düşürün. Gerekirse çökelmeyi artırmak için asidik çözeltiyi buzdolabında 1 saat saklayın.
  9. Bu şekilde elde edilen çökelmiş melanini üç kez damıtılmış su ile 5000 x g'da santrifüjleme ile 10 dakika yıkayın, kurutun ve 4 °C'de saklayın.

8. Biyoprosesin matematiksel modellenmesi

  1. Biyokütle büyüme kinetiği
    1. Aşağıda 14,15,16,17 verilen denklemde açıklandığı gibi, ürün inhibisyonu için geliştirilen aşağıdaki değiştirilmiş Verhulset modelini kullanarak biyokütle büyüme oranını ölçün,
      figure-protocol-7 (7)
      Nerede
      x = biyokütle konsantrasyonu (g/L)
      xm = maksimum biyokütle konsantrasyonu (g/L)
      μOBS = denklem (1) ile verilen maksimum özgül büyüme oranı (2/h)
      Vazques ve ark. (2008) ayrıca denklem (7)'den biyokütle konsantrasyonu için aşağıdaki denklemi türetmiştir
      figure-protocol-8 (8)
      Nerede
      vx = biyokütle büyüme hızı (g/L/h) = μobs·x
      μOBS       = Gözlenen Spesifik Büyüme Oranı (1/h)
      τx = gecikme süresi (h)
      t = zaman (h)
    2. Biyoprosesin farklı zamanlarında biyokütle konsantrasyonunu hesaplamak ve Pseudomonas stutzeri'nin büyüme profilini simüle etmek için Denklem (8) kullanın.
  2. Substrat tüketim kinetiği
    NOT: Substrat, bir biyoproseste biyokütle büyümesi, ürün oluşumu ve bakımı için kullanılır.
    1. Biyoproseste substrat kullanımını dengelemek için aşağıdaki denklemi kullanın,
      figure-protocol-9 (9)
      Glikozun çoğunluğu biyokütle üretimi için kullanılır; Bu nedenle, basitleştirme için, ürün oluşumu için substrat tüketimini ihmal etmek, denklem (9)'u şu şekilde azaltacaktır:
      figure-protocol-10 (10)
      Nerede
      S = substrat konsantrasyonu (g/L)
      YP/S = ürün verim katsayısı, yani melanin verim katsayısı (g/g)
      P = ürün konsantrasyonu (g/L), yani melanin konsantrasyonu (g/L)
      YX/S = biyokütle verim katsayısı (g/g)
      ms = bakım katsayısı (g/g/h)
      Yukarıdaki denklemi t = 0 zamanından t = t zamanına entegre etmek ve denklem (8)'den x'in değerini değiştirmek, substrat konsantrasyon profili17 için aşağıdaki denklemi verir,
      figure-protocol-11 (11)
      Nerede, s0 = ilk substrat konsantrasyonu (g/L) ve x0 = ilk biyokütle konsantrasyonu (g/L)
    2. Biyoprosesin farklı zaman aralıklarında substrat konsantrasyonunu hesaplamak için denklemi (11) kullanın veya substrat konsantrasyonu biliniyorsa, denklemde verilen parametreleri tahmin etmek için aynı denklemi kullanın.
  3. Melanin üretim kinetiği
    1. Melanin üretimini simüle etmek için Ludeking-Pirate denklemini kullanın. Bununla birlikte, melanin büyüme ile ilişkilidir ve bu nedenle, büyüme ile ilişkili olmayan ürün oluşumu terimi ihmal edilir ve basitleştirilmiş denklem şu şekilde yazılabilir:
      figure-protocol-12 (12)
      Nerede
      α = Büyüme ile ilişkili ürün oluşumuna bağlı Ludeking-Pirate sabiti (g/g)
      Denklemi (12) t = 0 zamanından t = t zamanına entegre etmek, ürün konsantrasyon profili için aşağıdaki denklemle sonuçlanır
      figure-protocol-13 (13)
    2. α hesaplamak için denklemi (13) kullanın .
  4. Kinetik parametre tahmini
    1. Yukarıda belirtilen tüm parametreleri, herhangi bir uygun yazılım aracını (örneğin, Microsoft Excel çözücü aracı) kullanarak doğrusal olmayan en küçük kareler parametre tahmini yöntemiyle tahmin edin.
    2. Parametre tahmini için toplu deney verilerini kullanın ve aşağıdaki denklemde verildiği gibi Çözücü aracını kullanarak kare hata (SSE) toplamını en aza indirin,
      Küçült
      figure-protocol-14 (14)
      Nerede
      xsim = simüle edilen değer ve xexp = deneysel değer

9. Analitik teknikler

  1. Melanin ekstraksiyonu
    1. Biyokütleyi uzaklaştırmak için büyüme kültürünü 5000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
    2. Süpernatanıma eşit hacimde 1 M NaOH ekleyin.
    3. Melanini çökeltmek için 1 N HCl ekleyerek alkali süpernatanı pH 2'ye asitleştirin.
    4. Melanin toplamak için asitlenmiş süpernatanı 12000 x g'da 20 dakika santrifüjleyin.
    5. Toplanan melanini 5 mL damıtılmış su ile üç kez yıkayın, gece boyunca oda sıcaklığında (RT) kurutun ve 4 ° C'de saklayın18.
  2. Melanin miktar tayini
    1. Yapay deniz suyunda (pH 8) uygun miktarda melanini çözerek farklı konsantrasyonlarda melanin çözeltileri (0-500 mg/L) hazırlayın.
    2. Spektrofotometre18 kullanarak absorbansı 400 nm'de ölçün.
    3. Yukarıdaki verileri kullanarak kalibrasyon eğrisini hazırlayın.
    4. Biyokütleyi çıkarmak için büyüme kültürünü 5000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatantın emilimini 400 nm'de ölçün. Adım 9.2.3'te hazırlanan kalibrasyon eğrisini kullanarak büyüme kültüründeki melanin konsantrasyonunu hesaplayın
  3. Tirozinaz testi
    1. Ren ve ark. (2013)19 tarafından geliştirilen tirozinaz enzim testi için aşağıda verilen protokolü takip edin Pseudomonas stutzeri kültür suyundan ekstrakte edilen tirozinazın enzim aktivitesini belirlemek için.
    2. Hücreleri toplamak için bakteri kültürünü 5.000 x g'da santrifüjleyin.
    3. Hücreleri pH 6.5'lik soğuk 100 mM fosfat tamponunda sonikasyon yapın ve homojenatı 15 dakika boyunca 9000 x g'da santrifüjleyin ve bir tirozinaz enzimi kaynağı olan süpernatanı toplayın.
    4. Yukarıdaki adımda elde edilen 0.2 mL enzim çözeltisini, 1 mM L-tirozin (substrat) içeren 2.8 mL 0.1 M sodyum fosfat tamponuna (pH 6.5) ekleyin.
    5. 475 nm'de absorbansı ölçerek dopakrom oluşumunu gözlemleyin.
    6. Tirozinaz aktivitesini aşağıdaki gibi hesaplayın. Bir uluslararası birim (IU) tirozinaz aktivitesi, dakikada 1 μmol L-tirozini dopakroma oksitlemek için gereken enzim miktarı olarak tanımlanır. Bunu, dopakromun molar sönme katsayısını (3600 L·M-1·cm-1) aşağıdaki denklemle kullanarak hesaplayın,
      figure-protocol-15 (15)
  4. Biyokütle tahmini
    1. Steriliteyi koruyarak 5 mL numuneyi Biyogüvenlik kabininde 4 saat aralıklarla toplayın. Kontaminasyon olasılığını azaltmak için numuneleri almadan önce ve sonra şişenin pamuklu tapasını alevlendirin. Tüm bu numuneler için numunelerin optik yoğunluğunu (OD) 660 nm'de ölçün.
      NOT: Aşılanmamış ortam boş görevi görür. Bu okumalar, mikroorganizmaların büyümesini incelemek için kullanılacaktır.
    2. Kültür suyunu 5000 x g'da 10 dakika ve 4 ° C'de santrifüjleyin, hücre peletini toplayın ve kuru hücre kütlesini elde etmek için peleti 60 ° C'de 8 saat boyunca kurutun.
    3. Adım 9.4.1'de ölçülen OD'yi ve adım 9.4.2'de elde edilen karşılık gelen biyokütleyi kullanarak kalibrasyon eğrisini hazırlayın
    4. Herhangi bir zamanda kültür suyunun optik yoğunluğunu ölçerek bilinmeyen biyokütle miktarını ölçmek için kalibrasyon eğrisini (OD = 0.82٠Biyokütle (g/L)) kullanın.
  5. DNA tahmini
    1. 260 nm'de optik yoğunluğu ölçerek numunedeki DNA miktarını tahmin edin.
    2. Aşağıdaki formülü kullanarak DNA'yı hesaplayın,
      figure-protocol-16 (16)
      Nerede
      A260= 260 nm'de absorbans
      0.1 = Numunenin hacmi
      1 = 260 nm'de 50 μg/mL konsantrasyonlu DNA standart çözeltisinin emilimi
  6. Protein tahmini
    1. Bir Bradford protein tahmin kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak numunelerdeki protein miktarını tahmin edin.
    2. 0.1 mL süpernatanıma 5 mL Bradford reaktifi ekleyin ve 5 dakika tutun. Süpernatantta bulunan proteinler, renkli bir kompleks oluşturmak için Bradford reaktifi ile reaksiyona girer.
    3. Spektrofotometreyi kullanarak absorbansı 595 nm20'de ölçün.
  7. Toplam indirgeyici şeker tahmini (TRS)
    1. TRS'yi dinitrosalisilik (DNS) yöntem21 ile ölçün.
    2. 1 g DNS'yi 50 mL damıtılmış suda çözerek DNS çözeltisini hazırlayın. Çözeltinin rengi süt sarısı olana kadar bu çözeltiye küçük miktarlarda 30 g sodyum potasyum tartarat ekleyin, ardından 20 mL 2 N NaOH ilavesiyle şeffaf turuncu-sarı ekleyin. Damıtılmış su kullanarak hacmi 100 mL'ye getirin ve karanlıkta saklayın.
    3. Standart bir şişede 180 mg glikozu 100 mL damıtılmış su içinde çözerek glikoz çalışma solüsyonu (0.01 M) hazırlayın.
    4. Standart Glikoz çözeltisini (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ve 1 mL) 5 ayrı test tüpüne pipetleyin. Boş bir çözelti olarak damıtılmış su (1 mL) içeren bir test tüpü kullanın.
    5. Damıtılmış su kullanarak her test tüpünde hacmi 2 mL'ye kadar getirin.
    6. Her test tüpüne 1 mL DNS reaktifi ekleyin ve alüminyum folyo ile kaplayın.
    7. Test tüplerini kaynar su banyosunda 5 dakika ısıtın ve RT'ye soğutun.
    8. Her test tüpüne 9 mL damıtılmış su ekleyin ve iyice karıştırın. Bir spektrofotometre kullanarak içeriğin OD'sini 575 nm'de ölçün.
    9. Konsantrasyonu, X eksenindeki glikoz miktarı ile hazırlanan bir kalibrasyon tablosu kullanarak ve Y ekseninde 575 nm'de (A575) absorbans ile ölçün.
  8. Partikül boyutu analizi
    1. Biyosentezlenmiş melanini bir sonikatör kullanarak damıtılmış suda (1 mL) dağıtın.
    2. Dağınık numune çözeltisini (1 mL) nanopartikül analizörüne ekleyin ve üreticinin protokolüne göre partikül boyutunu ölçün.
  9. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) analizi
    1. Ekstraksiyon sonrası elde edilen melanin tozunu 60 °C'de 8 saat bekleterek kurutun.
    2. Melanin tozunu TEM numune matrisine yükleyin ve operatör protokolünü takip ederek Transmisyon Elektron Mikroskobunu kullanarak boyutu ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1A,B, farklı başlangıç melanin konsantrasyonlarının etkisi altında büyüme ve melanin üretimini göstermektedir. Hücre büyümesi ve melanin üretimi, artan başlangıç melanin konsantrasyonu ile önemli ölçüde azaldı. Ortamdaki 500 mg / L başlangıç melanin konsantrasyonunda, biyokütle ve melanin, kontrolde elde edilen maksimum değerin neredeyse% 50'sine düşmüştür. 1000 mg / L başlangıç melanin konsantrasyonunda marjinal melanin üretimi vardı. Biyokütle büyüme hızı, 1000 mg / ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ürün inhibisyonu, biyoproseste üretkenliğin azalmasına yol açan önemli bir darboğazdır. Ürün inhibisyonunu azaltmak için sürekli biyoproses ve yerinde ürün çıkarma teknikleri gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Bununla birlikte, bu seçenekler mevcut biyoişleme tesisinin 23,24,25,26,27,28 tamamen elden geçirilmesini gerektirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur

Teşekkürler

Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'na (DST/TSG/WP/2014/58), Hindistan'a ve Karnataka Ulusal Teknoloji Enstitüsü'ne yukarıdaki protokolün geliştirilmesi için fon sağladıkları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  Alümina + A15A26A3: A13A3: A16A3: A17HiMediaGRM1909
Aktif karbonHiMediaPCT1001
Yapay Deniz Suyu OrtamıHiMediaM1942
Bradford reaktif kitiHiMediaML106
CeliteHiMediaGRM226
SantrifüjREMICM-8
Santrifüj tüpleriHiMediaPW1207
Dinitrosalisilik asitHiMediaGRM1582
Erlenmeyer şişesiBorosil4980021
dolgun toprakHiMediaGRM232
GlikozHiMediaMB037
HClHiMediaAS004
L-tirozinHiMediaRM069
Microsoft ExcelMicrosoft
Nanopartikül analizörüHORIBA ScientificNanopartica SZ-100
Besin Agar ortamıHiMediaM001
Petri plakasıHiMediaPW054
Fosfat tamponuHiMediaM1452
Sodyum hidroksitHiMediaMB095
SpektrofotometreThermofisherGenesys 10
Karıştırılmış tank biyoreaktörüScigenicsBioferm LS
TE TamponHiMediaML060
Transmisyon Elektron MikroskobuJEOLJEM-2100
ZeolitHiMediaGRM3834

Kaynaklar

  1. Langfelder, K., Streibel, M., Jahn, B., Haase, G., Brakhage, A. A. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi. Fungal Genetics and Biology. 38 (2), 143-158 (2003).
  2. Riley, P. A. Melanin. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (11), 1235-1239 (1997).
  3. Madaras, F., Gerber, J. P., Peddie, F., Kokkinn, M. J. The effect of sampling methods on the apparent constituents of ink from the squid sepioteuthis australis. Journal of Chemical Ecology. 36 (11), 1171-1179 (2010).
  4. Tran-Ly, A. N., et al. Microbial production of melanin and its various applications. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 36 (11), 170(2020).
  5. Pavan, M. E., López, N. I., Pettinari, M. J. Melanin biosynthesis in bacteria, regulation and production perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (4), 1357-1370 (2019).
  6. Pombeiro-Sponchiado, S. R., Sousa, G. S., Andrade, J. C. R., Lisboa, H. F., Gonçalves, R. C. R. Production of melanin pigment by fungi and its biotechnological applications. Melanin. , IntechOpen Limited. London, UK. 47-77 (2017).
  7. Guo, J., et al. Cloning and identification of a novel tyrosinase and its overexpression in Streptomyces kathirae SC-1 for enhancing melanin production. FEMS Microbiology Letters. 362, 41(2015).
  8. Lagunas-Muñoz, V. H., Cabrera-Valladares, N., Bolívar, F., Gosset, G., Martínez, A. Optimum melanin production using recombinant Escherichia coli. Journal of Applied Microbiology. 101 (5), 1002-1008 (2006).
  9. Wang, L., Li, Y., Li, Y. Metal ions driven production, characterization and bioactivity of extracellular melanin from Streptomyces sp. ZL-24. International Journal of Biological Macromolecules. 123, 521-530 (2019).
  10. Kiran, G. S., Jackson, S. A., Priyadharsini, S., Dobson, A. D. W., Selvin, J. Synthesis of Nm-PHB (nanomelanin-polyhydroxy butyrate) nanocomposite film and its protective effect against biofilm-forming multi drug resistant Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 7, 9167(2017).
  11. Raman, N. M., Shah, P. H., Mohan, M., Ramasamy, S. Improved production of melanin from Aspergillus fumigatus AFGRD105 by optimization of media factors. AMB Express. 5 (1), 72(2015).
  12. Thaira, H., Raval, K., Manirethan, V., Balakrishnan, R. M. Melanin nano-pigments for heavy metal remediation from water. Separation Science and Technology (Philadelphia). 54 (2), 265-274 (2018).
  13. Han, K., Levenspiel, O. Extended monod kinetics for substrate, product, and cell inhibition. Biotechnology and Bioengineering. 32 (4), 430-447 (1988).
  14. Vázquez, J. A., Murado, M. A. Unstructured mathematical model for biomass, lactic acid and bacteriocin production by lactic acid bacteria in batchfermentation. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83 (1), 91-96 (2008).
  15. Rohit, S. G., Jyoti, P. K., Subbi, R. R. T., Naresh, M., Senthilkumar, S. Kinetic modeling of hyaluronic acid production in palmyra palm (Borassus flabellifer) based medium by Streptococcus zooepidemicus MTCC 3523. Biochemical Engineering Journal. 137, 284-293 (2018).
  16. Nair, A. V., Gummadi, S. N., Doble, M. Process optimization and kinetic modelling of cyclic (1→3, 1→6)-β-glucans production from Bradyrhizobium japonicum MTCC120. Journal of Biotechnology. 226, 35-43 (2016).
  17. Reddy Tadi, S. R., Limaye, A. M., Sivaprakasam, S. Enhanced production of optically pure D (-) lactic acid from nutritionally rich Borassus flabellifer sugar and whey protein hydrolysate based-fermentation medium. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (-), 279-289 (2017).
  18. Ganesh Kumar, C., Sahu, N., Narender Reddy, G., Prasad, R. B. N., Nagesh, N., Kamal, A. Production of melanin pigment from Pseudomonas stutzeri isolated from red seaweed Hypnea musciformis. Letters in Applied Microbiology. 57 (4), 295-302 (2013).
  19. Ren, Q., Henes, B., Fairhead, M., Thöny-Meyer, L. High level production of tyrosinase in recombinant Escherichia coli. BMC Biotechnology. 13, 13-18 (2013).
  20. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols Handbooks. , Humana Press. (2002).
  21. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31 (3), 426-428 (1959).
  22. Dutta, A., Diao, Y., Jain, R., Rene, E. R., Dutta, S. Adsorption of cadmium from aqueous solution onto coffee grounds and wheat straw: Equilibrium and kinetic study. Journal of Environmental Engineering. 142 (9), 1-6 (2015).
  23. Dhillon, G. S., Brar, S. K., Verma, M., Tyagi, R. D. Recent advances in citric acid bio-production and recovery. Food and Bioprocess Technology. 4, 505-529 (2011).
  24. Roffler, S. R., Blanch, H. W., Wilke, C. R. In situ recovery of fermentation products. Trends in Biotechnology. 2 (5), 129-136 (1984).
  25. Maiti, S., et al. A re-look at the biochemical strategies to enhance butanol production. Biomass and Bioenergy. 94, 187-200 (2016).
  26. Prakash, G., Srivastava, A. K. Integrated yield and productivity enhancement strategy for biotechnological production of Azadirachtin by suspension culture of Azadirachta indica. Asia-Pacific Journal of Chemical Engineering. 6 (1), 129-137 (2011).
  27. Stark, D., von Stockar, U. In situ product removal (ISPR) in whole cell biotechnology during the last twenty years. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 80, 149-175 (2003).
  28. Kaur, G., Srivastava, A. K., Chand, S. Debottlenecking product inhibition in 1,3-propanediol fermentation by In-Situ Product Recovery. Bioresource Technology. 197, 451-457 (2015).
  29. Arun, G., Eyini, M., Gunasekaran, P. Characterization and biological activities of extracellular melanin produced by Schizophyllum commune (Fries). Indian Journal of Experimental Biology. 53, 380-387 (2015).
  30. Bin, L., Wei, L., Xiaohong, C., Mei, J., Mingsheng, D. In vitro antibiofilm activity of the melanin from Auricularia auricula, an edible jelly mushroom. Annals of Microbiology. 62 (4), 1523-1530 (2012).
  31. Madhusudhan, D. N., Mazhari, B. B. Z., Dastager, S. G., Agsar, D. Production and cytotoxicity of extracellular insoluble and droplets of soluble melanin by Streptomyces lusitanus DMZ-3c. BioMed Research International. 2014, 1-11 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Melanin retimir n nhibisyonuTirozinaz EnzimiMelanin AdsorpsiyonuGeri Besleme nhibisyonuDeniz BakterileriAdsorban TaramasEnzim nhibisyonu
Video yakında

İlgili makaleler