Sıçan Yağ Dokusu Mezenkimal Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Hücrelere Farklılaşması İçin İzolasyonu

Mezenkimal stromal hücreler olarak da bilinen mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), rejeneratif tıp için en yaygın kullanılan hücre tipleri arasındadır ^1,2. Yetişkin kök hücreler olarak sınıflandırılırlar ve çok soylu farklılaşma potansiyeli ve kendini yenileme kapasitesi³ ile karakterize edilirler. MSC'ler izole edilebilir ve yağ dokusu, kemik iliği, periferik kan, göbek kordonu dokusu ve kan, saç kökleri ve dişler dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan elde edilebilir ^4,5.

Kök hücrelerin yağ dokusundan izole edilmesi, kolay erişim, in vitro hızlı genişleme ve yüksek verim⁶ nedeniyle hem çekici hem de umut verici olarak görülmektedir. Yağ dokusundan türetilen mezenkimal kök hücreler (Ad-MSC'ler) insanlar, sığırlar, fareler, sıçanlar ve daha yakın zamanda keçiler gibi farklı türlerden izole edilebilir⁷. Ad-MSC'lerin artık doku mühendisliği ve gen/hücre tedavisi için potansiyel adaylar olduğu ve yumuşak doku hasarı veya defektlerinin uzun süreli onarımı için otolog bir alternatif geliştirmek için bile kullanılabileceği kanıtlanmıştır ^7,8.

Uluslararası Hücre ve Gen Terapisi Derneği (ISCT), tam karakterizasyon için MSC'ler tarafından sergilenmesi gereken üç minimum kriter tanımlamıştır⁹. İlk olarak, plastik yapışkan olmalıdırlar. İkincisi, MSC'ler CD73, CD90 ve CD105 gibi mezenkimal kök hücre yüzey belirteçlerini eksprese etmeli ve hematopoetik belirteçler CD45, CD34, CD14 veya CD11b, CD79α veya CD19 ve HLA-DR'nin ekspresyonundan yoksundur. Son olarak, MSC'ler üç mezenkimal soya farklılaşma yeteneğini sergilemelidir: adipositler, osteositler ve kondrositler. İlginç bir şekilde, MSC'ler nöronal hücreler, kardiyomiyositler, hepatositler ve epitel hücreleri^10,11 gibi diğer soylara da farklılaşabilir.

Aslında, MSC'ler, farklı hastalıklar için rejeneratif tedavide potansiyel terapötik ajanlar olarak uygulanmalarını sağlayan benzersiz özelliklere sahiptir. MSC'ler, terapötik faydalar sağlayan immünomodülatör bir ortamı indüklemek için çözünür faktörleri salgılayabilir¹². Ek olarak, MSC'ler hedefe yönelik tedavi sunmak için yaralanma bölgelerine ve tümör mikro ortamlarına doğru göç edebilir; ancak, mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır¹³. Ek olarak, MSC'ler, son zamanlarda MSC'lerin çeşitli hastalıklardaki terapötik potansiyelinin yeni bir mekanizması olarak ortaya çıkan kodlanmamış RNA'lar, protein ve çözünür faktörlerden oluşan bir kargo taşıyan nano ölçekte eksozomları, hücre dışı vezikülleri salgılama yeteneğine sahiptir¹⁴.

Daha da önemlisi, MSC'ler, genetik modifikasyon 15,16 veya in vitro ¹⁷ kültür ortamında çeşitli dışsal indükleyici faktörler kullanarak^, insülin üreten hücrelere (IPC'ler) farklılaşma potansiyelleri için belirgin bir dikkat çekmiştir. IPC indüksiyon periyodu, kullanılan indüksiyon protokolüne ve kullanılan dışsal faktörlere bağlı olduğu için büyük ölçüde değişir. Farklılaşma süreci günlerden aylara kadar sürebilir ve farklı aşamalarda eklenmesi ve / veya geri çekilmesi gereken eksojen indükleyici faktörlerin bir kombinasyonunu gerektirir. Endokrin pankreas farklılaşması için kullanılan bu faktörlerin çoğu, insülin salgılayan β hücrelerinin proliferasyonunu veya farklılaşmasını / neogenezini teşvik ettiği ve / veya IPC'lerin insülin içeriğini arttırdığı gösterilen biyolojik olarak aktif bileşiklerdir 18,19,20,21. Burada, MSC'lerin diyabette ve komplikasyonlarında, sekretomları da dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar yoluyla terapötik etkilere ve ayrıca çok çeşitli immüno-modülatör etkilere sahip oldukları bildirilmiştir^22,23,24.

Bu protokolde, Ad-MSC'lerin sıçan epididim yağından izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir aşamalı protokol ve ardından Ad-MSC'lerden IPC'lerin üretilmesi için basit, nispeten kısa bir protokol sunuyoruz.

Tüm deneyler onaylanmış kılavuzlara göre gerçekleştirildi ve tüm prosedürler Mısır'daki İngiliz Üniversitesi (BUE), Kahire, Mısır Eczacılık Fakültesi Etik Kurulu tarafından onaylandı. Ad-MSC izolasyon protokolü, Lopez ve Spencer'dan¹⁵ değişiklikle kabul edildi.

1. Ad-MSC'lerin sıçan epididim yağ pedlerinden izolasyonu

1. 1 aylıktan büyük olmayan 250-300 g ağırlığındaki erkek Sprague-Dawley sıçanlarını kullanın (izolasyon başına iki). Hayvanları anestezi altına alın, sonra servikal çıkık ile ötenazi yapın. Ötenazi yapılan hayvana% 70 etanol püskürtün. Karnın alt kısmındaki cildi ve kası tüketin ve ardından epididim yağ pedlerini ortaya çıkarmak için iki testisi dışarı çekin.
2. Epididim yağ pedlerini nazikçe kesin ve kan damarlarını kesmemeye dikkat edin.
3. Epididimsi çevreleyen yağ dokusunu izole edin, ardından fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir Petri kabına yerleştirin.
4. Biyogüvenlik kabininde, bu yağ pedlerini forseps ve neşter kullanarak küçük parçalara ayırın. Bu kesilmiş yağ dokusu parçalarını 10 mL steril PBS içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
5. Kirletici kanı çıkarmak için kıyılmış yağ dokularını her seferinde 10 mL PBS ile 5 kez yıkayın. Aşağıdaki yıkama prosedürleri titizlikle yapılmalıdır.
   1. Dokuya 10 mL PBS ekleyin ve 45 s boyunca iyice karıştırın. Ardından, tüpü iki katmana ayırmak için 5 dakika bekleterek dokunun yerçekimi yoluyla yerleşmesine izin verin.
   2. PBS'yi 10 ml'lik bir şırınga kullanarak infranatanttan aspire edin ve başka bir yıkama için taze 10 mL PBS ile değiştirin.
   3. PBS kandan arındırılana kadar bu yıkama adımını 4-5 kez tekrarlayın. Bu, kanın tamamı olmasa da çoğunun çıkarıldığını gösterir.
6. Yıkadıktan sonra, yağ dokusunu 10 mL kollajenaz çözeltisi içinde (PBS'de% 0.1 kollajenaz tip 1) yeniden askıya alın. Tüpü parafilm ile sıkıca kapatın, ardından doku neredeyse homojen olana kadar sallanan bir su banyosunda (37 ° C, 80 rpm, 45 dakika boyunca) inkübe edin.
   NOT: Dokunun tamamen sindirilmesinden kaçının (çözelti tüm doku kalıntılarının / parçalarının tamamen kaybolmasıyla tamamen homojen hale geldiğinde), çünkü daha sonra hücrelerin kültürlenmesini olumsuz yönde etkiler. Genellikle sindirim 30-45 dakika sürer.
7. Kollajenaz sindirimi yapıldıktan sonra, tüpü 15 s boyunca vorteksleyin, ardından 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Tüpü tekrar 10 saniye boyunca vorteksleyin, ardından 5 dakikalık bir santrifüjleme daha yapın. Daha sonra üç katman gözlenecektir. Stromal vasküler fraksiyon (SVF) peletini bozmadan yağ tabakasını ve ardından sulu tabakayı dikkatlice atın.
   NOT: Adiposit içeren süpernatantı ve kollajenaz çözeltisini çıkarın. İlk olarak, yağ damlacıklarının tamamen çıkarılmasını sağlamak için adipositleri ve beraberindeki yağ tabakasını 10 mL'lik bir pipetle çıkarın, ardından altındaki sulu tabakayı çıkarın.
8. Tüpün altındaki SVF peletini 10 mL steril BSA çözeltisi (PBS'de %1 albümin, sığır serumu Fraksiyon V çözeltisi) içinde yeniden askıya alın, ardından tüpü 300 x g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin.
9. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve SVF peletini Ad-MSC'ler için 8,5 mL komple ortamda askıya alın (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı / Besin Karışımı F-12 [DMEM / F12] ortamından oluşur % 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiştir).
10. Hücreleri 37 °C'de^{25 cm2'lik} bir şişede% 5 CO_{2 altında kültürleyin.} Ertesi gün, ekli hücreleri kontrol edin, askıya alınmış hücreleri çıkarın ve ortamı değiştirin. Daha sonra, medyayı her geçen gün değiştirin.
11. Tripsin-EDTA kullanarak% 80 -% 90 oranında kaynaştıklarında hücreleri her 5-7 günde bir geçirin. Bu protokolde açıklanan sonraki deneyler için 3-5 pasajları arasındaki hücreleri kullanın. Tüm yalıtım adımlarının şematik bir sunumu Şekil 1'de verilmiştir.
    NOT: Genellikle, Trips-EDTA potansiyeli farklı tedarikçiler arasında değişebilir, bu nedenle hücreler üzerindeki toksik etkilerden kaçınmak için tripsinizasyon süresini en aza indirmeye çalışın.

2. Ad-MSC'lerin akım sitometri analizleri kullanılarak immünofenotipleme ile karakterizasyonu

1. 3. pasajda, hücreleri Tripsin-EDTA kullanarak bölün. PBS ile 2 kez yıkayın ve ardından hücreleri bir hemositometre ile sayın.
2. Floresein-izotiyosiyanat (FITC) ile etiketlenmiş fare anti-sıçan CD90 veya CD105 (mezenkimal belirteçler) veya CD34 (hematopoetik belirteç) monoklonal antikoru ile 20 dakika boyunca karanlıkta 4 ° C'de 100.000 hücreyi inkübe edin.
3. Hücreleri yıkayın ve 500 μL FACS tamponunda askıya alın. Akış sitometrisi ile analiz^{edin 25}.

3. İzole Ad-MSC'lerin çeşitli mezenkimal soylara farklılaşma potansiyelinin değerlendirilmesi

1. Adipojenik farklılaşma
   1. Hücreleri tam ortamda (adım 1.9.'da açıklandığı gibi) yeniden askıya alın, daha sonra hücreleri²⁴ delikli bir doku kültürü plakasında 3.7 x 10 4 hücre / kuyu yoğunluğunda kültürleyin. % 5 CO 2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de_{inkübe edin}. Daha sonra,Hücreler genellikle 3 gün süren neredeyse% 100 akıcılığa ulaşana kadar medyayı her 3 günde bir değiştirin.
   2. Hücreler istenen akıcılığa ulaştığında, adipogenezi indüklemek için proliferasyon ortamını adipojenik farklılaşma ortamı (% 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin ile Mezenkimal Kök Hücreler Fonksiyonel Tanımlama Kiti ile birlikte verilen 1x adipojenik takviye ile desteklenmiş LG-DMEM ortamından oluşan) ile değiştirin. Ardından, medyayı her 3 günde bir değiştirin (0,5 mL/kuyu). Lipid vakuollerini bozmamak için ortam değişimini nazikçe yapmaya özen gösterin.
   3. 21 gün sonra, lipid vakuol görünümünün mikroskobik incelemesi ve Yağ Kırmızısı boyama ile adipojenik farklılaşmayı değerlendirin.
   4. 10 mL izopropanol içinde 30 mg Yağ Kırmızısı lekesini çözerek bir Yağ Kırmızı stok çözeltisi hazırlayın ve daha sonra oda sıcaklığında en az 20 dakika saklayın. Daha sonra, 3 parça stok çözeltisini 2 parça çift damıtılmış su (_{ddH 2}O) ile karıştırarak bir çalışma çözeltisi hazırlayın, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, ardından filtre kağıdı ile süzün.
   5. Adipojenik farklılaşmayı belgelemek için, hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın, ardından 15 dakika boyunca nötr tamponlu formalin% 10 (0.75 ml / kuyu) kullanarak sabitleyin. Bundan sonra, hücreleri 1 mL / kuyucuk kullanarak PBS ile 2 kez yıkayın ve hücreleri her seferinde 5 dakika boyunca inkübe edin. Oil Red çalışma solüsyonunu eklemeden önce PBS'yi tamamen aspire etmek önemlidir.
   6. Son yıkamadan sonra, Kırmızı Yağ çalışma çözeltisini hücrelere ekleyin ve 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, leke solüsyonunu çıkarın ve hücreleri PBS ile 2 kez nazikçe yıkayın. Lekeli lipit damlacıklarını mikroskop altında gözlemleyin.
2. Osteojenik farklılaşma
   1. 24 delikli bir plakada 7,4 x 10³ hücre/kuyu (0,5 mL orta/kuyu) tohumlayın ve bunları 37 °C'de %5 CO_2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde 3 gün boyunca tam ortamda (adım 1.9'da açıklandığı gibi) inkübe ederek neredeyse% 70 akıcılığa ulaşın.
   2. LG-DMEM ortamında% 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş osteojenik takviye (kit ile birlikte verilir) ile hücreleri indükleyin.
   3. Osteojenik indüksiyona 21 gün boyunca devam edin, farklılaşma ortamını her 3 günde bir değiştirin.
   4. 200 mg Alizarin Kırmızı S boyasını 9 mL ddH 2 O içinde çözerek Alizarin Kırmızı S boyasının çalışan bir çözeltisini hazırlayın ve ardından amonyum hidroksit ve HCl kullanarak_pH'ı4.1-4.3'e ayarlayın. Ardından, ses seviyesini ddH 2 O ile 10_mL'yeayarlayın. Bunu takiben, filtre kağıdı kullanarak filtreleme yoluyla çökeltileri temizleyin.
   5. Hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın, ardından 15 dakika boyunca% 10 tamponlanmış formalin (0.75 mL / kuyu) kullanarak sabitleyin. Daha sonra, PBS (1 mL / kuyu) kullanarak hücreleri 2 kez yıkayın. Her seferinde hücreleri 5 dakika kuluçkaya yatırın.
   6. Sabit hücreleri, 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca hazırlanan% 2 Alizarin-Kırmızı S çözeltisi ile inkübe edin.
   7. Bundan sonra, leke çözeltisini çıkarın, hücreleri 2 kez ddH₂O ve bir kez PBS ile yıkayın ve daha sonra mikroskop altında osteojenik farklılaşmayı değerlendirmek için lekeli kalsiyum bakımından zengin hücre dışı matrisi gözlemleyin.
3. Kondrojenik farklılaşma
   1. 24 delikli bir plakada 7.4 x 10 3 hücreli/kuyucuklu (0.5 mL orta/kuyu) tohumlayın ve bunları 37 °C'de %5 CO_2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde³ gün boyunca tam ortamda (adım 1.9'da açıklandığı gibi) inkübe ederek neredeyse% 70 akıcılığa ulaşın.
   2. İstenilen akıcılığa ulaşıldığında, insülin-transferrin selenyum (ITS), kondrojenik takviye (kit ile birlikte verilir), 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin 21 içeren serumsuz DMEM /^F12 ile hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını indükleyin.
   3. Hücreleri 21 gün boyunca kondrojenik medya ile inkübe ederken, kondrojenik farklılaşma ortamını her 3 günde bir değiştirin.
   4. Aşağıdaki gibi Alcian Blue 8GX boyasının çalışma çözeltisini hazırlayın: İlk olarak, 97 mL ddH₂O'ya 3 mL buzul asetik asit ekleyerek ddH₂O'da% 3'lük bir buzul asetik asit çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, 100 mL% 3 buzul asit çözeltisinde 0.1 g karıştırarak Alcian Blue 8GX boyasının çalışan bir çözeltisini hazırlayın ve filtre kağıdı kullanarak filtrasyon yoluyla çökeltileri çıkarın.
   5. Hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın, ardından 15 dakika boyunca% 10 tamponlanmış formalin (0.75 mL / kuyu) kullanarak sabitleyin. Daha sonra, PBS (1 mL / kuyu) kullanarak hücreleri 2 kez yıkayın. Her seferinde hücreleri 5 dakika kuluçkaya yatırın.
   6. Bir sonraki adım, hazırlanan% 0.1 Alcian Blue 8GX boyasındaki hücreleri% 3 buzul asetik asit içinde, 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe etmektir. Lekeli hücreleri 2 kez ddH₂O ve bir kez PBS ile yıkayın ve daha sonra lekeli sülfatlanmış proteoglikanları mikroskop altında gözlemleyin.

4. Ad-MSC'lerin IPC'lere farklılaştırılması

1. 3. pasajda, Ad-MSC'leri Tripsin-EDTA kullanarak bölün. İlk önce, ortamı çıkarın, ardından 5 mL PBS ile kültür şişesine hala bağlıyken hücreleri yıkayın. Daha sonra, 75^cm2 şişeye 5 mL Tripsin-EDTA ekleyin ve 3-10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Hücreleri erken pasajlarda, genellikle P3-P5 arasında indüklemeye çalışın, çünkü geç pasajlar hücrelerin özelliklerini ve farklılaşma yeteneklerini olumsuz yönde etkiler^17,24.
2. Daha sonra, hücreleri ayrılma ve tek hücreli bir süspansiyon olup olmadığını kontrol edin. Tripsin hareketini inhibe etmek için şişeye 5 mL tam DMEM/F12 ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve ardından tüpe 5 mL tam DMEM / F12 ortamı ekleyin.
3. Hücreleri peletlemek için hücreleri 300 x g'da 2 dakika boyunca santrifüj yapın.
4. Hücreleri PBS ile bir kez yıkayın, 2 dakika boyunca 300 x g'de tekrar santrifüj yapın ve ardından hücre peletini 3-5 mL tam DMEM / F12 ortamında yeniden askıya alın.
5. Tripan mavisi dışlama boyası ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
6. Daha sonra, hücreleri 6 delikli plakalara (1 x 10 6 hücre / plaka) ve 12 delikli bir plakaya (GSIS testi için; 1 x 10⁶ hücre / plaka) tohumlayın ve neredeyse% 90 akıcıya ulaşmak için 3 gün boyunca tam ortamda (adım 1.9'da açıklandığı gibi) 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatöründe inkübe edin.
7. İndüksiyon gününde, medyayı çıkarın, hücreleri PBS ile yıkayın ve daha sonra hücreleri 2 gün boyunca ön indüksiyon ortamı ile önceden indükleyin (DMEM / F12,% 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM nikotinamid [NA] ve 1mM β-merkaptoetanol [β-ME] ile desteklenir).
8. % 2.5 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM NA ve 1mM β-merkaptoetanol ile desteklenmiş yüksek glikoz DMEM'i (hg-dmem, 4.5g / L glikoz) kullanarak hücreleri 1 gün daha indükleyin. Bu aşamanın sonunda hücre peletlerini toplayın (bu protokolde D3 hücreleri olarak adlandırılır).
9. % 2.5 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM NA, 1mM β-merkaptoetanol ve 10 nM exendin-4 ile desteklenmiş HG-DMEM'den oluşan nihai farklılaşma indüksiyon ortamında hücreleri 7 gün daha inkübe edin.
10. Belirtilen sürenin sonunda, hücre peletlerini toplayın (bu protokolde Final olarak adlandırılır) ve bu protokolde aşağıdaki gibi DTZ boyama ve GSIS testi ile hücrelerin başarılı bir şekilde farklılaşmasını değerlendirin.
11. Aşağıdaki 5. ve 6. adımları izleyerek oluşturulan IPC'leri değerlendirin.

5. Ditizon boyama

1. Ditizon (DTZ) leke suyu çözeltisini aşağıdaki gibi hazırlayın: 25 mg DTZ'yi 2.5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde tamamen çözün, alikotlara bölün ve kullanıma kadar karanlıkta -20 ° C'de saklayın.
2. Boyama için, stok çözeltisini tam kültür ortamında seyrelterek 1:100 (hacim / hacim) bir çalışma çözeltisi hazırlayın (HG-DMEM% 5 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiştir). Ardından, çalışma solüsyonunu 0,2 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün.
3. Daha sonra, 6 delikli bir plakadaki belirtilen DTZ boyama kültürü hücreleri için ve kültür ortamını aspire ettikten sonra, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve ardından her bir oyuğa 2 mL DTZ çalışma çözeltisi ekleyin. CO 2 inkübatöründe 37 °C'de en az₂ saat inkübe edin.
4. Hücreleri PBS ile 2 kez dikkatlice yıkayın. Son yıkamadan sonra, her bir kuyucuğa 2 mL PBS ekleyin. Ardından, kırmızı kırmızı lekeli IPC'leri ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin. Kontrol olarak, başlangıçta tam büyüme ortamında (%10 FBS - DMEM/F12) kültürlenmiş indüklenmemiş Ad-MSC'leri kullanın.

6. RT-qPCR ile β hücreli belirteçlerin gen ekspresyonu

1. RNA ekstraksiyonu
   1. Farklılaşmadan sonra, hücre peletlerini toplayın ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın. Her hücre peletini (havuzlanmış bir 6 kuyucuklu plakanın altı kuyucuğundan türetilmiş) 1.5 mL nükleaz içermeyen bir tüpte 1 mL guanidium tiyosiyanat RNA ekstraksiyon reaktifinde askıya alın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yapın. Nükleoprotein komplekslerinin tamamen ayrışmasına izin vermek için lize numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
   2. 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi başına 200 μL kloroform ekleyin ve tüpleri 15 s boyunca elle kuvvetlice çalkalanması için güvenli bir şekilde kapatın. Daha sonra, oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
   3. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 13.800 x g'de santrifüj yapın. Bu, karışımın daha düşük bir kloroform faza, bir interfaza ve renksiz bir üst sulu faza ayrılmasına yol açacak ve RNA sulu fazda kalacaktır.
   4. Üst sulu fazı yeni bir tüpe yerleştirin, interfaza dokunmaktan dikkatlice kaçının.
   5. Sulu faza (1:1 hacim) 600 μL %100 izopropanol ekleyin, ardından numuneleri 25 kez ters çevirerek iyice karıştırın ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
   6. Numuneleri 4 °C'de 30 dakika boyunca 18.800 x g'de santrifüj yapın. Çökeltilmiş RNA, tüp tarafında küçük bir jel benzeri pelet oluşturur.
   7. Süpernatantı çıkarın ve peletleri 1 mL% 80 buz gibi soğuk etanol ile yıkayın. Etanol eklendikten sonra, RNA peletinin 10 s boyunca çoklu pipetlenmesini yavaşça gerçekleştirin.
   8. Numuneleri 4 °C'de 9.600 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve RNA peletlerini 5-10 dakika boyunca havada kurumaya bırakın.
   9. Kuruduktan sonra, RNA peletlerini 25-100 μL RNaz içermeyen suda (ilk pelet boyutuna göre) 1.5 mL nükleaz içermeyen tüplerde tamamen çözünene kadar birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, çözün. RNA peletinin aşırı kurumasını önleyin.
      NOT: Genellikle, pelet kuruduğunda şeffaf hale gelir. Bununla birlikte, bir kez netleştiğinde, peletin aşırı kurumasını önlemek için derhal askıya alın.
   10. Nükleaz içermeyen suyu boş olarak kullanarak 260 nm ve 280 nm'de optik yoğunlukları (OD) belirleyerek RNA'yı ölçün.
   11. Örneklerin OD260/OD280 = 1.8-2.0 olduğundan emin olun.
2. cDNA sentezi
   1. Bir cDNA sentez kiti kullanarak izole edilmiş toplam RNA'dan cDNA'yı sentezleyin.
   2. cDNA sentez reaksiyonunu üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin. 200 μL'lik bir PCR tüpünde, Tablo 1'de gösterilen reaksiyon ana karışımına 0.5 μg toplam RNA içeren bir RNA çözeltisi hacmi ekleyin.
   3. RNA'yı ana karışıma ekledikten sonra, karışımı bir döngü için 30 dakika boyunca 50 ° C'lik bir döngü programından geçirin, ardından bir termal döngü kullanarak 2 dakika boyunca 95 ° C'lik bir inaktivasyon döngüsü izleyin.
   4. cDNA'yı nükleaz içermeyen su kullanarak 2 ng / μL'lik son bir konsantrasyona kadar seyreltin. Sonraki RT-qPCR için -20 ° C'de saklayın.
3. SYBR Green Master Mix kullanan RT-qPCR
   1. Tablo 2'de gösterilen reaksiyon karışımına göre cDNA şablonunu kullanarak her hedef gen için RT-qPCR reaksiyonunu gerçekleştirin. Tüm önlemleri üçlü olarak yapın.
   2. Kullanılan astar kümeleri Tablo 3'te gösterilmiştir. Tüm RT-qPCR prosedürlerini buz üzerinde gerçekleştirin.
   3. RT-qPCR reaksiyonunu varsayılan program ayarlarında gerçek zamanlı bir PCR makinesi kullanarak gerçekleştirin. Termal çevrim koşulları, 10 dakika boyunca 95 ° C'lik ilk denatürasyonu, ardından 45 döngü denatürasyonu (95 ° C, 15 sn) ve kombine tavlama / uzatmayı (60 ° C, 1 dakika) içeriyordu.
   4. C_t değerlerini belirleyin ve ifade seviyelerini ^2-ΔΔCt'ye uygun olarak, iç kontrol olarak β-aktin ile tespit edin.

Tablo 1: cDNA sentezi ana karışım hacimleri.

Tablo 2: RT-qPCR reaksiyon karışımı.

Tablo 3: İleri ve geri astar dizileri.

7. Glikoz ile uyarılmış insülin sekresyonu

1. Kreb's Ringer bikarbonat (KRB) tamponunun hazırlanması
   1. Kreb'in Ringer bikarbonat (KRB) tampon çözeltisini, glikoz ile uyarılmış insülin sekresyonu (GSIS) testi için hem 2 mM glikoz (düşük glikoz) hem de 20 mM glikoz (yüksek glikoz) konsantrasyonları ile hazırlayın. KRB tampon hazırlama için kullanılan bileşenler Tablo 4'te verilmiştir.
   2. 1 N HCl kullanarak tamponun pH'ını yaklaşık 7,25-7,35'e ayarlayın (yani, istenen pH 7,4'ün 0,1-0,2 birim altında, çünkü filtrasyon sırasında yükselebilir).
   3. Sığır serum albümini (BSA) taze olarak % 0.1'lik bir konsantrasyonda (ağırlık / hacim) ekleyin.
   4. Daha sonra glikoz ekleyin (2 mM düşük glikozlu KRB tamponunu hazırlamak için 50 mL KRB için 18 mg ve 20 mM yüksek glikoz KRB tamponunu hazırlamak için 50 mL KRB için 180 mg).
   5. GSIS testine hazır olmak için hazırlanan LG ve HG KRB tamponlarını 0,2 μm şırınga filtresinden geçirerek sterilize edin.
2. GSIS testi
   1. Başlangıçta 12 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında 1 x 10⁵ hücre / kuyu tohumlayın ve aynı farklılaşma indüksiyon protokolünü kullanarak bu hücreleri indükleyin.
   2. İndüksiyon protokolünün sonunda, üretilen IPC'leri (plaka içinde) PBS ile 2 kez ve bir kez LG-KRB ile nazikçe yıkayın.
   3. Daha sonra, IPC'leri 1 saat boyunca 300 μL LG-KRB / kuyucuk ile inkübe edin ve ardından bu tamponu atın.
   4. Daha sonra, IPC'leri 300 μL 2 mM (LG) veya 20 mM (HG) KRB tamponu ile 1 saat daha inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, süpernatantı toplayın ve ticari bir ELISA kiti kullanarak ve üreticinin talimatlarını izleyerek sonraki salgılanan insülin tahlili için -80 ° C'de saklayın.
      NOT: GSIS tahlili yapılırken PBS ve KRB arabelleğini aspire ederken veya eklerken mümkün olduğunca nazik olmaya çalışın.

Tablo 4: KRB tampon hazırlığı için kullanılan bileşenler.

8. İstatistiksel analiz

1. Tüm verileri ortalamanın standart hatası (SEM) ± olarak ifade edin. Tüm karşılaştırmalar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve istatistiksel yazılım kullanılarak Tukey'in post hoc testi kullanılarak yapıldı. P değerleri ** p ≤ 0.01 ve *p ≤ 0.05 olan sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulundu.

Ad-MSC'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu
Şekil 2'de gösterildiği gibi, yağ dokusundan izole edilen hücreler, izolasyonun ertesi gününden başlayarak heterojen bir yuvarlak ve fibroblast benzeri hücre popülasyonu göstermiştir (Şekil 2A). İzolasyondan 4 gün sonra, fibroblast hücreleri sayı ve boyut olarak artmaya ve 1. pasajla homojen bir popülasyon olarak büyümeye başladı (Şekil 2B, C). Bu hücreler, MSC özelliklerinin ilk kriterini yerine getirerek, pasaj 3'e kadar gösterildiği gibi plastik yapışkan, fibroblastik benzeri hücreler olarak büyümeye devam etti (Şekil 2D). Bu Ad-MSC'ler çok iyi kültür özellikleri gösterdi ve bu protokolün Ad-MSC'leri epididim yağ pedlerinden izole etmek için alakalı, kolay ve nispeten hızlı bir protokol olduğu bulundu.

Bir sonraki adım, izole edilmiş Ad-MSC'leri karakterize etmekti. ISCT'ye göre, MSC'ler üç plastik aderans kriterini, hematopoetik belirteçlerin eksikliği olan mezenkimal CD'lerin ekspresyonunu ve adipositlere, osteositlere ve kondrositlere farklılaşma yeteneğini izlemelidir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, akış sitometrisi analizi, bu hücrelerin çoğunun CD90 ve CD105'i (sırasıyla% 76.4 ve% 73.6) eksprese ettiğini göstermiştir. Bu arada, CD34 için neredeyse negatifti (%0.1).

Dahası, bu hücrelerin farklılaşmasının indüklenmesi üzerine, adipositlere, osteositlere ve kondrositlere farklılaşma yeteneğini gösterdiler. Şekil 3B'de (üst panel) gösterildiği gibi, adipositler, indüklenmemiş hücrelerin kontrolüne kıyasla lipid vakuollerinin Yağ Kırmızısı boyanmasını göstermiştir. Osteositler, kontrol hücrelerine kıyasla karakteristik Alizarin Kırmızısı boyama (Şekil 3B, orta panel) gösterdi. Son olarak, kondrosit kaynaklı hücreler, kontrol edilmemiş hücrelere kıyasla hücre dışı matrisin mavi boyanmasını gösterdi (Şekil 3B, alt panel).

Bu veriler, yağ dokusundan izole edilen hücrelerin sadece iyi kültür özellikleri sergilemekle kalmayıp, aynı zamanda MSC'ler için önerilen tüm kriterleri de sergilediğini açıkça göstermektedir.

Ad-MSC'lerin insülin üreten hücrelere (IPC'ler) farklılaşması
Şekil 4A'da gösterildiği gibi, Ad-MSC'leri IPC'lere ayırmak için nispeten basit, kısa bir protokol kullandık. Farklılaşmanın indüklenmesinden sonra, indüklenen IPC'ler çeşitli şekillerde değerlendirildi. İndüklenen hücreler belirgin morfolojik değişiklikler gösterdi. Şekil 4B'de (üst panel) gösterildiği gibi, indüklenen hücreler, Ad-MSC'lerin normal fibroblastik benzeri morfolojisine kıyasla yuvarlak, küme benzeri morfoloji göstermiştir. İlginç bir şekilde, ditizon ile boyandıktan sonra, bu kümeler β hücreli boyanın çinko granüllerinin bir özelliği olan kırmızı bir leke gösterdi (Şekil 4B, alt panel).

Daha sonra, üretilen IPC'ler, indüklenmemiş kontrol hücrelerine kıyasla spesifik β hücre belirteçlerinin ekspresyonu için genetik olarak değerlendirildi. Şekil 5A-E'de gösterildiği gibi, indüklenen hücreler, IPC'ler üretme yeteneklerini gösteren çeşitli spesifik β hücre belirteçlerini ifade edebildiler. Kesin bir endoderm belirteci olan FOXA2'ye gelince (Şekil 5A'da gösterildiği gibi), kontrolle karşılaştırıldığında D3 farklılaşmasında yüksek oranda eksprese edildi, neredeyse 30 kata ulaştı ve daha sonra son farklılaşmış hücrelerde kontrolün sadece 10 katına düştü (D3: 28.37 ± 0.88; Final: 12.10 ± 1.27; p < 0.05). Pdx-1'e gelince (β hücrelerinin erken bir belirteci olarak kabul edilir), hem D3 hem de nihai farklılaşmış hücrelerde yükselmiş, kontrol edilmemiş hücrelere kıyasla neredeyse 20 kata ulaşmıştır (D3: 22.39 ± 5.14; Final: 17.13 ± 0.342; p < 0,05; Şekil 5B). Diğer β hücreli belirteçler, yani NKX6.1, MafA ve insülin-1 (Ins1) ile ilgili olarak, hepsi D3'ten başlayarak son farklılaşmaya kadar yükselme gösterdi, kontrol edilmemiş hücrelerle karşılaştırıldığında sırasıyla neredeyse 8 kat, 12 kat ve 300 kata ulaştı (NKX6.1: D3: 1.94 ± 0.86, Final: 7.97 ± 1.34, s<0.05; MafA: D3: 6.59 ± 0.4, Final: 11.54 ± 2.40, p < 0.05; ve Ins1: D3: 27.29 ± 20.27, Final: 318.20 ± 76.09, p < 0.05) (Şekil 5C-E). Bu, bu Ad-MSC'lerin β hücre işaretleyicilerini ifade eden IPC'lere farklılaşabileceğini gösterir.

Son olarak, bu hücreler, artan glikoz konsantrasyonları ile karşı karşıya kaldıklarında insülin sekresyonu için değerlendirildi. Şekil 5F'de gösterildiği gibi, 20 mM glikoz ile meydan okunduğunda indüklenen IPC'lerin süpernatantında salgılanan insülin, hücrelere 2 mM glikoz ile meydan okunduğunda salgılanandan anlamlı derecede daha yüksekti (HG: 390 pg / mL ± 33 pg / mL; LG: 234 pg/mL ± 32 pg/mL, p < 0,05; Şekil 5F)

Bu veriler, kullanılan protokolün Ad-MSC'leri genetik ve işlevsel olarak doğrulanan IPC'lere ayırmayı başardığını doğruladı.

Şekil 1: Ad-MSC'lerin yalıtımı ve karakterizasyonu için kullanılan protokol adımlarının şematik bir sunumu. Biorender.com tarafından oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İzole edilmiş Ad-MSC'leri gösteren fotomikrograflar . (A) Plastik yapışık, fibroblast benzeri morfoloji sergileyen izole hücreler, izolasyonu takip eden gün ortaya çıkmaya başlar. (B) Zamanla, bu yapışkan Ad-MSC'ler (fibroblast benzeri morfolojiye sahip) çoğalır ve sayıları artar, (C) P1 ve (D) P3'te daha homojen bir fibroblast benzeri popülasyona ulaşır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ad-MSC'lerin karakterizasyonu. (A) Ad-MSC'lerin akış sitometrik analizi, bu hücrelerin CD34 (üst panel) için neredeyse negatif olduğunu, hücrelerin çoğunluğunun CD90 ve CD105'i (alt panel) eksprese ettiğini göstermektedir. Ad-MSC'ler üç mezenkimal soya farklılaşabilir: (B) adipositler (yağ damlacıklarının yağ kırmızısı ile boyandığı yerlerde), (C) alizarin kırmızısı ile boyanmış osteositler ve (D) Alcian Blue ile boyanmış kondrositler (kontrol edilmemiş hücrelerle karşılaştırıldığında). Kontrol: indüklenmemiş hücreler, Diff: farklılaşmış hücreler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Ad-MSC'lerin IPC'lere farklılaşması. (A) Ad-MSC'lerden IPC'ler üretmek için kullanılan farklılaşma protokolünün, IPC'lere doğru farklılaşmanın indüklenmesi sırasında her aşamada hücreler için fotomikrograflarla birlikte şematik sunumu. Farklılaşma üzerine, hücreler fibroblastik morfolojilerini kaybeder ve süspansiyon ortamında ayrılma ve büyüme eğiliminde olan kümeleri toplama eğilimindedir. (B) Fotomikrograflar, yukarıdaki protokol tarafından üretilen kontrol Ad-MSC'leri ve IPC'leri, indüklenmemiş Ad-MSC'lerin (sol panel), boyanmamış (üst panel) veya DTZ boyalı (alt panel) fibroblast benzeri morfolojisi ile karşılaştırıldığında, yuvarlak küme morfolojik değişikliklerini (sağ panel) gösterir.
Kontrol: indüklenmemiş hücreler; IPC'ler: insülin üreten hücreler; NA: nikotinamid; β-ME: beta merkaptoetanol; D3: IPC'lere doğru farklılaşmanın indüklenmesi sırasında 3. günde indüklenen hücreler; D10: İndüksiyon protokolünün sonundaki son farklılaştırılmış IPC'ler; Ör. 4: exendin-4. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: IPC'ler için β hücreli belirteçlerin ve GSIS'nin göreli ekspresyon düzeyleri. (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA ve (E) Ins-1 için qRT-PCR ile göreceli ifade seviyeleri. (F) Üretilen IPC'lere 2mM glikoz (LG) veya 20mM glikoz (HG) ile meydan okunduğunda süpernatantta salgılanan insülin seviyeleri. Kontrol: indüklenmemiş Ad-MSC'ler, Gün-3: D3'te toplanan farklılaşmış hücreler; Final: nihai farklılaştırılmış IPC'ler; LG: düşük glikoz; HG: yüksek glikoz. a: ortalama, p < 0.05'teki kontrolden farklıdır; b: ortalama, p < 0.05'teki Gün-3'ten farklıdır; *: LG'nin ortalaması 0,05'< p'de HG'den farklıdır; karşılaştırma bağımsız bir örneklem t-testi kullanılarak yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tüm ortak yazarlar bu çalışmayla ilişkili çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.