Yöntem makalesi

Sıçan Yağ Dokusu Mezenkimal Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Hücrelere Farklılaşması İçin İzolasyonu

DOI:

10.3791/63348

⸱

29 Ağustos 2022

 ,  ,  , 
1Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2Pharmacology and Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 3Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ dokusundan türetilmiş mezenkimal kök hücreler (Ad-MSC'ler), insülin üreten hücrelere (IPC'ler) farklılaşan potansiyel bir MSC kaynağı olabilir. Bu protokolde, sıçan epididim Ad-MSC'lerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı adımlar ve ardından aynı sıçan Ad-MSC'lerinden IPC'lerin üretilmesi için basit, kısa bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) - özellikle yağ dokusundan izole edilenler (Ad-MSC'ler) - herhangi bir etik kaygı oluşturmayan yenilenebilir, bol miktarda kök hücre kaynağı olarak özel ilgi görmüştür. Bununla birlikte, Ad-MSC'leri izole etmek için mevcut yöntemler standartlaştırılmamıştır ve özel ekipman gerektiren karmaşık protokoller kullanmaktadır. Ad-MSC'leri Sprague-Dawley sıçanlarının epididim yağından basit, tekrarlanabilir bir yöntem kullanarak izole ettik. İzole Ad-MSC'ler genellikle izolasyondan sonraki 3 gün içinde ortaya çıkar, çünkü yapışkan hücreler fibroblastik morfoloji gösterir. Bu hücreler izolasyondan sonraki 1 hafta içinde% 80 akıcılığa ulaşır. Daha sonra, pasaj 3-5'te (P3-5), CD90, CD73 ve CD105 gibi karakteristik MSC farklılaşma (CD) yüzey belirteçleri kümesi için immünofenotipleme yapılarak izole Ad-MSC'ler için tam bir karakterizasyon gerçekleştirildi ve bu hücrelerin osteojenik, adipojenik ve kondrojenik soylardan farklılaşması indüklendi. Bu da, izole edilmiş hücrelerin çok potansiyelli olduğunu ima eder. Ayrıca, izole Ad-MSC'lerin insülin üreten hücrelere (IPC'ler) doğru farklılaşmasını, yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (HG-DMEM), β-merkaptoetanol, nikotinamid ve eksendin-4'ü dahil ederek basit, nispeten kısa bir protokol yoluyla indükledik. IPC'lerin farklılaşması, ilk olarak, MafA, NKX6.1, Pdx-1 ve Ins1 gibi spesifik β hücre belirteçlerinin ekspresyon seviyelerinin yanı sıra üretilen IPC'ler için ditizon boyaması yoluyla genetik olarak değerlendirildi. İkincisi, değerlendirme fonksiyonel olarak glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonu (GSIS) testi ile gerçekleştirildi. Sonuç olarak, Ad-MSC'ler tüm MSC karakterizasyon kriterlerini sergileyerek kolayca izole edilebilir ve diyabet araştırması için laboratuarda bol, yenilenebilir bir IPC kaynağı sağlayabilirler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal stromal hücreler olarak da bilinen mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), rejeneratif tıp için en yaygın kullanılan hücre tipleri arasındadır 1,2. Yetişkin kök hücreler olarak sınıflandırılırlar ve çok soylu farklılaşma potansiyeli ve kendini yenileme kapasitesi3 ile karakterize edilirler. MSC'ler izole edilebilir ve yağ dokusu, kemik iliği, periferik kan, göbek kordonu dokusu ve kan, saç kökleri ve dişler dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan elde edilebilir 4,5.

Kök hücrelerin yağ dokusundan izole edilmesi, kolay erişim, in vitro hızlı genişleme ve yüksek verim6 nedeniyle hem çekici hem de umut verici olarak görülmektedir. Yağ dokusundan türetilen mezenkimal kök hücreler (Ad-MSC'ler) insanlar, sığırlar, fareler, sıçanlar ve daha yakın zamanda keçiler gibi farklı türlerden izole edilebilir7. Ad-MSC'lerin artık doku mühendisliği ve gen/hücre tedavisi için potansiyel adaylar olduğu ve yumuşak doku hasarı veya defektlerinin uzun süreli onarımı için otolog bir alternatif geliştirmek için bile kullanılabileceği kanıtlanmıştır 7,8.

Uluslararası Hücre ve Gen Terapisi Derneği (ISCT), tam karakterizasyon için MSC'ler tarafından sergilenmesi gereken üç minimum kriter tanımlamıştır9. İlk olarak, plastik yapışkan olmalıdırlar. İkincisi, MSC'ler CD73, CD90 ve CD105 gibi mezenkimal kök hücre yüzey belirteçlerini eksprese etmeli ve hematopoetik belirteçler CD45, CD34, CD14 veya CD11b, CD79α veya CD19 ve HLA-DR'nin ekspresyonundan yoksundur. Son olarak, MSC'ler üç mezenkimal soya farklılaşma yeteneğini sergilemelidir: adipositler, osteositler ve kondrositler. İlginç bir şekilde, MSC'ler nöronal hücreler, kardiyomiyositler, hepatositler ve epitel hücreleri10,11 gibi diğer soylara da farklılaşabilir.

Aslında, MSC'ler, farklı hastalıklar için rejeneratif tedavide potansiyel terapötik ajanlar olarak uygulanmalarını sağlayan benzersiz özelliklere sahiptir. MSC'ler, terapötik faydalar sağlayan immünomodülatör bir ortamı indüklemek için çözünür faktörleri salgılayabilir12. Ek olarak, MSC'ler hedefe yönelik tedavi sunmak için yaralanma bölgelerine ve tümör mikro ortamlarına doğru göç edebilir; ancak, mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır13. Ek olarak, MSC'ler, son zamanlarda MSC'lerin çeşitli hastalıklardaki terapötik potansiyelinin yeni bir mekanizması olarak ortaya çıkan kodlanmamış RNA'lar, protein ve çözünür faktörlerden oluşan bir kargo taşıyan nano ölçekte eksozomları, hücre dışı vezikülleri salgılama yeteneğine sahiptir14.

Daha da önemlisi, MSC'ler, genetik modifikasyon 15,16 veya in vitro 17 kültür ortamında çeşitli dışsal indükleyici faktörler kullanarak, insülin üreten hücrelere (IPC'ler) farklılaşma potansiyelleri için belirgin bir dikkat çekmiştir. IPC indüksiyon periyodu, kullanılan indüksiyon protokolüne ve kullanılan dışsal faktörlere bağlı olduğu için büyük ölçüde değişir. Farklılaşma süreci günlerden aylara kadar sürebilir ve farklı aşamalarda eklenmesi ve / veya geri çekilmesi gereken eksojen indükleyici faktörlerin bir kombinasyonunu gerektirir. Endokrin pankreas farklılaşması için kullanılan bu faktörlerin çoğu, insülin salgılayan β hücrelerinin proliferasyonunu veya farklılaşmasını / neogenezini teşvik ettiği ve / veya IPC'lerin insülin içeriğini arttırdığı gösterilen biyolojik olarak aktif bileşiklerdir 18,19,20,21. Burada, MSC'lerin diyabette ve komplikasyonlarında, sekretomları da dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar yoluyla terapötik etkilere ve ayrıca çok çeşitli immüno-modülatör etkilere sahip oldukları bildirilmiştir22,23,24.

Bu protokolde, Ad-MSC'lerin sıçan epididim yağından izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir aşamalı protokol ve ardından Ad-MSC'lerden IPC'lerin üretilmesi için basit, nispeten kısa bir protokol sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler onaylanmış kılavuzlara göre gerçekleştirildi ve tüm prosedürler Mısır'daki İngiliz Üniversitesi (BUE), Kahire, Mısır Eczacılık Fakültesi Etik Kurulu tarafından onaylandı. Ad-MSC izolasyon protokolü, Lopez ve Spencer'dan15 değişiklikle kabul edildi.

1. Ad-MSC'lerin sıçan epididim yağ pedlerinden izolasyonu

  1. 1 aylıktan büyük olmayan 250-300 g ağırlığındaki erkek Sprague-Dawley sıçanlarını kullanın (izolasyon başına iki). Hayvanları anestezi altına alın, sonra servikal çıkık ile ötenazi yapın. Ötenazi yapılan hayvana% 70 etanol püskürtün. Karnın alt kısmındaki cildi ve kası tüketin ve ardından epididim yağ pedlerini ortaya çıkarmak için iki testisi dışarı çekin.
  2. Epididim yağ pedlerini nazikçe kesin ve kan damarlarını kesmemeye dikkat edin.
  3. Epididimsi çevreleyen yağ dokusunu izole edin, ardından fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir Petri kabına yerleştirin.
  4. Biyogüvenlik kabininde, bu yağ pedlerini forseps ve neşter kullanarak küçük parçalara ayırın. Bu kesilmiş yağ dokusu parçalarını 10 mL steril PBS içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  5. Kirletici kanı çıkarmak için kıyılmış yağ dokularını her seferinde 10 mL PBS ile 5 kez yıkayın. Aşağıdaki yıkama prosedürleri titizlikle yapılmalıdır.
    1. Dokuya 10 mL PBS ekleyin ve 45 s boyunca iyice karıştırın. Ardından, tüpü iki katmana ayırmak için 5 dakika bekleterek dokunun yerçekimi yoluyla yerleşmesine izin verin.
    2. PBS'yi 10 ml'lik bir şırınga kullanarak infranatanttan aspire edin ve başka bir yıkama için taze 10 mL PBS ile değiştirin.
    3. PBS kandan arındırılana kadar bu yıkama adımını 4-5 kez tekrarlayın. Bu, kanın tamamı olmasa da çoğunun çıkarıldığını gösterir.
  6. Yıkadıktan sonra, yağ dokusunu 10 mL kollajenaz çözeltisi içinde (PBS'de% 0.1 kollajenaz tip 1) yeniden askıya alın. Tüpü parafilm ile sıkıca kapatın, ardından doku neredeyse homojen olana kadar sallanan bir su banyosunda (37 ° C, 80 rpm, 45 dakika boyunca) inkübe edin.
    NOT: Dokunun tamamen sindirilmesinden kaçının (çözelti tüm doku kalıntılarının / parçalarının tamamen kaybolmasıyla tamamen homojen hale geldiğinde), çünkü daha sonra hücrelerin kültürlenmesini olumsuz yönde etkiler. Genellikle sindirim 30-45 dakika sürer.
  7. Kollajenaz sindirimi yapıldıktan sonra, tüpü 15 s boyunca vorteksleyin, ardından 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Tüpü tekrar 10 saniye boyunca vorteksleyin, ardından 5 dakikalık bir santrifüjleme daha yapın. Daha sonra üç katman gözlenecektir. Stromal vasküler fraksiyon (SVF) peletini bozmadan yağ tabakasını ve ardından sulu tabakayı dikkatlice atın.
    NOT: Adiposit içeren süpernatantı ve kollajenaz çözeltisini çıkarın. İlk olarak, yağ damlacıklarının tamamen çıkarılmasını sağlamak için adipositleri ve beraberindeki yağ tabakasını 10 mL'lik bir pipetle çıkarın, ardından altındaki sulu tabakayı çıkarın.
  8. Tüpün altındaki SVF peletini 10 mL steril BSA çözeltisi (PBS'de %1 albümin, sığır serumu Fraksiyon V çözeltisi) içinde yeniden askıya alın, ardından tüpü 300 x g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin.
  9. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve SVF peletini Ad-MSC'ler için 8,5 mL komple ortamda askıya alın (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı / Besin Karışımı F-12 [DMEM / F12] ortamından oluşur % 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiştir).
  10. Hücreleri 37 °C'de25 cm2'lik bir şişede% 5 CO2 altında kültürleyin. Ertesi gün, ekli hücreleri kontrol edin, askıya alınmış hücreleri çıkarın ve ortamı değiştirin. Daha sonra, medyayı her geçen gün değiştirin.
  11. Tripsin-EDTA kullanarak% 80 -% 90 oranında kaynaştıklarında hücreleri her 5-7 günde bir geçirin. Bu protokolde açıklanan sonraki deneyler için 3-5 pasajları arasındaki hücreleri kullanın. Tüm yalıtım adımlarının şematik bir sunumu Şekil 1'de verilmiştir.
    NOT: Genellikle, Trips-EDTA potansiyeli farklı tedarikçiler arasında değişebilir, bu nedenle hücreler üzerindeki toksik etkilerden kaçınmak için tripsinizasyon süresini en aza indirmeye çalışın.

2. Ad-MSC'lerin akım sitometri analizleri kullanılarak immünofenotipleme ile karakterizasyonu

  1. 3. pasajda, hücreleri Tripsin-EDTA kullanarak bölün. PBS ile 2 kez yıkayın ve ardından hücreleri bir hemositometre ile sayın.
  2. Floresein-izotiyosiyanat (FITC) ile etiketlenmiş fare anti-sıçan CD90 veya CD105 (mezenkimal belirteçler) veya CD34 (hematopoetik belirteç) monoklonal antikoru ile 20 dakika boyunca karanlıkta 4 ° C'de 100.000 hücreyi inkübe edin.
  3. Hücreleri yıkayın ve 500 μL FACS tamponunda askıya alın. Akış sitometrisi ile analizedin 25.

3. İzole Ad-MSC'lerin çeşitli mezenkimal soylara farklılaşma potansiyelinin değerlendirilmesi

  1. Adipojenik farklılaşma
    1. Hücreleri tam ortamda (adım 1.9.'da açıklandığı gibi) yeniden askıya alın, daha sonra hücreleri24 delikli bir doku kültürü plakasında 3.7 x 10 4 hücre / kuyu yoğunluğunda kültürleyin. % 5 CO 2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'deinkübe edin. Daha sonra,Hücreler genellikle 3 gün süren neredeyse% 100 akıcılığa ulaşana kadar medyayı her 3 günde bir değiştirin.
    2. Hücreler istenen akıcılığa ulaştığında, adipogenezi indüklemek için proliferasyon ortamını adipojenik farklılaşma ortamı (% 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin ile Mezenkimal Kök Hücreler Fonksiyonel Tanımlama Kiti ile birlikte verilen 1x adipojenik takviye ile desteklenmiş LG-DMEM ortamından oluşan) ile değiştirin. Ardından, medyayı her 3 günde bir değiştirin (0,5 mL/kuyu). Lipid vakuollerini bozmamak için ortam değişimini nazikçe yapmaya özen gösterin.
    3. 21 gün sonra, lipid vakuol görünümünün mikroskobik incelemesi ve Yağ Kırmızısı boyama ile adipojenik farklılaşmayı değerlendirin.
    4. 10 mL izopropanol içinde 30 mg Yağ Kırmızısı lekesini çözerek bir Yağ Kırmızı stok çözeltisi hazırlayın ve daha sonra oda sıcaklığında en az 20 dakika saklayın. Daha sonra, 3 parça stok çözeltisini 2 parça çift damıtılmış su (ddH 2O) ile karıştırarak bir çalışma çözeltisi hazırlayın, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, ardından filtre kağıdı ile süzün.
    5. Adipojenik farklılaşmayı belgelemek için, hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın, ardından 15 dakika boyunca nötr tamponlu formalin% 10 (0.75 ml / kuyu) kullanarak sabitleyin. Bundan sonra, hücreleri 1 mL / kuyucuk kullanarak PBS ile 2 kez yıkayın ve hücreleri her seferinde 5 dakika boyunca inkübe edin. Oil Red çalışma solüsyonunu eklemeden önce PBS'yi tamamen aspire etmek önemlidir.
    6. Son yıkamadan sonra, Kırmızı Yağ çalışma çözeltisini hücrelere ekleyin ve 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, leke solüsyonunu çıkarın ve hücreleri PBS ile 2 kez nazikçe yıkayın. Lekeli lipit damlacıklarını mikroskop altında gözlemleyin.
  2. Osteojenik farklılaşma
    1. 24 delikli bir plakada 7,4 x 103 hücre/kuyu (0,5 mL orta/kuyu) tohumlayın ve bunları 37 °C'de %5 CO2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde 3 gün boyunca tam ortamda (adım 1.9'da açıklandığı gibi) inkübe ederek neredeyse% 70 akıcılığa ulaşın.
    2. LG-DMEM ortamında% 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş osteojenik takviye (kit ile birlikte verilir) ile hücreleri indükleyin.
    3. Osteojenik indüksiyona 21 gün boyunca devam edin, farklılaşma ortamını her 3 günde bir değiştirin.
    4. 200 mg Alizarin Kırmızı S boyasını 9 mL ddH 2 O içinde çözerek Alizarin Kırmızı S boyasının çalışan bir çözeltisini hazırlayın ve ardından amonyum hidroksit ve HCl kullanarakpH'ı4.1-4.3'e ayarlayın. Ardından, ses seviyesini ddH 2 O ile 10mL'yeayarlayın. Bunu takiben, filtre kağıdı kullanarak filtreleme yoluyla çökeltileri temizleyin.
    5. Hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın, ardından 15 dakika boyunca% 10 tamponlanmış formalin (0.75 mL / kuyu) kullanarak sabitleyin. Daha sonra, PBS (1 mL / kuyu) kullanarak hücreleri 2 kez yıkayın. Her seferinde hücreleri 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    6. Sabit hücreleri, 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca hazırlanan% 2 Alizarin-Kırmızı S çözeltisi ile inkübe edin.
    7. Bundan sonra, leke çözeltisini çıkarın, hücreleri 2 kez ddH2O ve bir kez PBS ile yıkayın ve daha sonra mikroskop altında osteojenik farklılaşmayı değerlendirmek için lekeli kalsiyum bakımından zengin hücre dışı matrisi gözlemleyin.
  3. Kondrojenik farklılaşma
    1. 24 delikli bir plakada 7.4 x 10 3 hücreli/kuyucuklu (0.5 mL orta/kuyu) tohumlayın ve bunları 37 °C'de %5 CO2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde3 gün boyunca tam ortamda (adım 1.9'da açıklandığı gibi) inkübe ederek neredeyse% 70 akıcılığa ulaşın.
    2. İstenilen akıcılığa ulaşıldığında, insülin-transferrin selenyum (ITS), kondrojenik takviye (kit ile birlikte verilir), 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin 21 içeren serumsuz DMEM /F12 ile hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını indükleyin.
    3. Hücreleri 21 gün boyunca kondrojenik medya ile inkübe ederken, kondrojenik farklılaşma ortamını her 3 günde bir değiştirin.
    4. Aşağıdaki gibi Alcian Blue 8GX boyasının çalışma çözeltisini hazırlayın: İlk olarak, 97 mL ddH2O'ya 3 mL buzul asetik asit ekleyerek ddH2O'da% 3'lük bir buzul asetik asit çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, 100 mL% 3 buzul asit çözeltisinde 0.1 g karıştırarak Alcian Blue 8GX boyasının çalışan bir çözeltisini hazırlayın ve filtre kağıdı kullanarak filtrasyon yoluyla çökeltileri çıkarın.
    5. Hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın, ardından 15 dakika boyunca% 10 tamponlanmış formalin (0.75 mL / kuyu) kullanarak sabitleyin. Daha sonra, PBS (1 mL / kuyu) kullanarak hücreleri 2 kez yıkayın. Her seferinde hücreleri 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    6. Bir sonraki adım, hazırlanan% 0.1 Alcian Blue 8GX boyasındaki hücreleri% 3 buzul asetik asit içinde, 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe etmektir. Lekeli hücreleri 2 kez ddH2O ve bir kez PBS ile yıkayın ve daha sonra lekeli sülfatlanmış proteoglikanları mikroskop altında gözlemleyin.

4. Ad-MSC'lerin IPC'lere farklılaştırılması

  1. 3. pasajda, Ad-MSC'leri Tripsin-EDTA kullanarak bölün. İlk önce, ortamı çıkarın, ardından 5 mL PBS ile kültür şişesine hala bağlıyken hücreleri yıkayın. Daha sonra, 75cm2 şişeye 5 mL Tripsin-EDTA ekleyin ve 3-10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Hücreleri erken pasajlarda, genellikle P3-P5 arasında indüklemeye çalışın, çünkü geç pasajlar hücrelerin özelliklerini ve farklılaşma yeteneklerini olumsuz yönde etkiler17,24.
  2. Daha sonra, hücreleri ayrılma ve tek hücreli bir süspansiyon olup olmadığını kontrol edin. Tripsin hareketini inhibe etmek için şişeye 5 mL tam DMEM/F12 ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve ardından tüpe 5 mL tam DMEM / F12 ortamı ekleyin.
  3. Hücreleri peletlemek için hücreleri 300 x g'da 2 dakika boyunca santrifüj yapın.
  4. Hücreleri PBS ile bir kez yıkayın, 2 dakika boyunca 300 x g'de tekrar santrifüj yapın ve ardından hücre peletini 3-5 mL tam DMEM / F12 ortamında yeniden askıya alın.
  5. Tripan mavisi dışlama boyası ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
  6. Daha sonra, hücreleri 6 delikli plakalara (1 x 10 6 hücre / plaka) ve 12 delikli bir plakaya (GSIS testi için; 1 x 106 hücre / plaka) tohumlayın ve neredeyse% 90 akıcıya ulaşmak için 3 gün boyunca tam ortamda (adım 1.9'da açıklandığı gibi) 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe inkübe edin.
  7. İndüksiyon gününde, medyayı çıkarın, hücreleri PBS ile yıkayın ve daha sonra hücreleri 2 gün boyunca ön indüksiyon ortamı ile önceden indükleyin (DMEM / F12,% 10 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM nikotinamid [NA] ve 1mM β-merkaptoetanol [β-ME] ile desteklenir).
  8. % 2.5 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM NA ve 1mM β-merkaptoetanol ile desteklenmiş yüksek glikoz DMEM'i (hg-dmem, 4.5g / L glikoz) kullanarak hücreleri 1 gün daha indükleyin. Bu aşamanın sonunda hücre peletlerini toplayın (bu protokolde D3 hücreleri olarak adlandırılır).
  9. % 2.5 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B, 2 mM L-glutamin, 10 mM NA, 1mM β-merkaptoetanol ve 10 nM exendin-4 ile desteklenmiş HG-DMEM'den oluşan nihai farklılaşma indüksiyon ortamında hücreleri 7 gün daha inkübe edin.
  10. Belirtilen sürenin sonunda, hücre peletlerini toplayın (bu protokolde Final olarak adlandırılır) ve bu protokolde aşağıdaki gibi DTZ boyama ve GSIS testi ile hücrelerin başarılı bir şekilde farklılaşmasını değerlendirin.
  11. Aşağıdaki 5. ve 6. adımları izleyerek oluşturulan IPC'leri değerlendirin.

5. Ditizon boyama

  1. Ditizon (DTZ) leke suyu çözeltisini aşağıdaki gibi hazırlayın: 25 mg DTZ'yi 2.5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde tamamen çözün, alikotlara bölün ve kullanıma kadar karanlıkta -20 ° C'de saklayın.
  2. Boyama için, stok çözeltisini tam kültür ortamında seyrelterek 1:100 (hacim / hacim) bir çalışma çözeltisi hazırlayın (HG-DMEM% 5 FBS, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiştir). Ardından, çalışma solüsyonunu 0,2 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün.
  3. Daha sonra, 6 delikli bir plakadaki belirtilen DTZ boyama kültürü hücreleri için ve kültür ortamını aspire ettikten sonra, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve ardından her bir oyuğa 2 mL DTZ çalışma çözeltisi ekleyin. CO 2 inkübatöründe 37 °C'de en az2 saat inkübe edin.
  4. Hücreleri PBS ile 2 kez dikkatlice yıkayın. Son yıkamadan sonra, her bir kuyucuğa 2 mL PBS ekleyin. Ardından, kırmızı kırmızı lekeli IPC'leri ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin. Kontrol olarak, başlangıçta tam büyüme ortamında (%10 FBS - DMEM/F12) kültürlenmiş indüklenmemiş Ad-MSC'leri kullanın.

6. RT-qPCR ile β hücreli belirteçlerin gen ekspresyonu

  1. RNA ekstraksiyonu
    1. Farklılaşmadan sonra, hücre peletlerini toplayın ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın. Her hücre peletini (havuzlanmış bir 6 kuyucuklu plakanın altı kuyucuğundan türetilmiş) 1.5 mL nükleaz içermeyen bir tüpte 1 mL guanidium tiyosiyanat RNA ekstraksiyon reaktifinde askıya alın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yapın. Nükleoprotein komplekslerinin tamamen ayrışmasına izin vermek için lize numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
    2. 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi başına 200 μL kloroform ekleyin ve tüpleri 15 s boyunca elle kuvvetlice çalkalanması için güvenli bir şekilde kapatın. Daha sonra, oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 13.800 x g'de santrifüj yapın. Bu, karışımın daha düşük bir kloroform faza, bir interfaza ve renksiz bir üst sulu faza ayrılmasına yol açacak ve RNA sulu fazda kalacaktır.
    4. Üst sulu fazı yeni bir tüpe yerleştirin, interfaza dokunmaktan dikkatlice kaçının.
    5. Sulu faza (1:1 hacim) 600 μL %100 izopropanol ekleyin, ardından numuneleri 25 kez ters çevirerek iyice karıştırın ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    6. Numuneleri 4 °C'de 30 dakika boyunca 18.800 x g'de santrifüj yapın. Çökeltilmiş RNA, tüp tarafında küçük bir jel benzeri pelet oluşturur.
    7. Süpernatantı çıkarın ve peletleri 1 mL% 80 buz gibi soğuk etanol ile yıkayın. Etanol eklendikten sonra, RNA peletinin 10 s boyunca çoklu pipetlenmesini yavaşça gerçekleştirin.
    8. Numuneleri 4 °C'de 9.600 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve RNA peletlerini 5-10 dakika boyunca havada kurumaya bırakın.
    9. Kuruduktan sonra, RNA peletlerini 25-100 μL RNaz içermeyen suda (ilk pelet boyutuna göre) 1.5 mL nükleaz içermeyen tüplerde tamamen çözünene kadar birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, çözün. RNA peletinin aşırı kurumasını önleyin.
      NOT: Genellikle, pelet kuruduğunda şeffaf hale gelir. Bununla birlikte, bir kez netleştiğinde, peletin aşırı kurumasını önlemek için derhal askıya alın.
    10. Nükleaz içermeyen suyu boş olarak kullanarak 260 nm ve 280 nm'de optik yoğunlukları (OD) belirleyerek RNA'yı ölçün.
    11. Örneklerin OD260/OD280 = 1.8-2.0 olduğundan emin olun.
  2. cDNA sentezi
    1. Bir cDNA sentez kiti kullanarak izole edilmiş toplam RNA'dan cDNA'yı sentezleyin.
    2. cDNA sentez reaksiyonunu üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin. 200 μL'lik bir PCR tüpünde, Tablo 1'de gösterilen reaksiyon ana karışımına 0.5 μg toplam RNA içeren bir RNA çözeltisi hacmi ekleyin.
    3. RNA'yı ana karışıma ekledikten sonra, karışımı bir döngü için 30 dakika boyunca 50 ° C'lik bir döngü programından geçirin, ardından bir termal döngü kullanarak 2 dakika boyunca 95 ° C'lik bir inaktivasyon döngüsü izleyin.
    4. cDNA'yı nükleaz içermeyen su kullanarak 2 ng / μL'lik son bir konsantrasyona kadar seyreltin. Sonraki RT-qPCR için -20 ° C'de saklayın.
  3. SYBR Green Master Mix kullanan RT-qPCR
    1. Tablo 2'de gösterilen reaksiyon karışımına göre cDNA şablonunu kullanarak her hedef gen için RT-qPCR reaksiyonunu gerçekleştirin. Tüm önlemleri üçlü olarak yapın.
    2. Kullanılan astar kümeleri Tablo 3'te gösterilmiştir. Tüm RT-qPCR prosedürlerini buz üzerinde gerçekleştirin.
    3. RT-qPCR reaksiyonunu varsayılan program ayarlarında gerçek zamanlı bir PCR makinesi kullanarak gerçekleştirin. Termal çevrim koşulları, 10 dakika boyunca 95 ° C'lik ilk denatürasyonu, ardından 45 döngü denatürasyonu (95 ° C, 15 sn) ve kombine tavlama / uzatmayı (60 ° C, 1 dakika) içeriyordu.
    4. Ct değerlerini belirleyin ve ifade seviyelerini 2-ΔΔCt'ye uygun olarak, iç kontrol olarak β-aktin ile tespit edin.

cDNA sentezi ana karışımıSes seviyesi (μl)
5x cDNA sentez tamponu4
dNTP2
RNA primer1
Verso Enzim Karışımı1
RT arttırıcı1
Nükleaz içermeyen suDeğişken
Toplam RNADeğişken
Toplam Reaksiyon hacmi20

Tablo 1: cDNA sentezi ana karışım hacimleri.

RT-qPCR reaksiyon karışımıSes seviyesi (μl)10 μL'de son konsantrasyon
cDNA22 ng/kuyu
RT-qPCR İleri astar (3 μM)1300 nM
RT-qPCR Ters astar (3 μM)1300 nM
Nükleaz içermeyen su1-------
2x SYBR Yeşil ana karışım51 adet
Toplam reaksiyon hacmi10

Tablo 2: RT-qPCR reaksiyon karışımı.

Genİleri astarTers astar
FOXA2GAGCCGTGAAGATGGAAGGATGTTGCCGGAACCACTG
PDX-1ATCCACCTCCCGGACCTTTCCCTCCGGTTCTGCTGCGTAT
NKX6.1ACACCAGACCCACATTCTCCGATCTCGGCTGCGTGCTTCTT
MafATTCAGCAAGGAGGAGGTCATCCGCCAACTTCTCGTATTTC
Ins-1CACCTTTGTGGTCCTCACCTCTCCAGTGCCAAGGTCTGA
β aktinTGGAGAAGATTTGGCACCACAACACAGCCTGGATGGCTAC

Tablo 3: İleri ve geri astar dizileri.

7. Glikoz ile uyarılmış insülin sekresyonu

  1. Kreb's Ringer bikarbonat (KRB) tamponunun hazırlanması
    1. Kreb'in Ringer bikarbonat (KRB) tampon çözeltisini, glikoz ile uyarılmış insülin sekresyonu (GSIS) testi için hem 2 mM glikoz (düşük glikoz) hem de 20 mM glikoz (yüksek glikoz) konsantrasyonları ile hazırlayın. KRB tampon hazırlama için kullanılan bileşenler Tablo 4'te verilmiştir.
    2. 1 N HCl kullanarak tamponun pH'ını yaklaşık 7,25-7,35'e ayarlayın (yani, istenen pH 7,4'ün 0,1-0,2 birim altında, çünkü filtrasyon sırasında yükselebilir).
    3. Sığır serum albümini (BSA) taze olarak % 0.1'lik bir konsantrasyonda (ağırlık / hacim) ekleyin.
    4. Daha sonra glikoz ekleyin (2 mM düşük glikozlu KRB tamponunu hazırlamak için 50 mL KRB için 18 mg ve 20 mM yüksek glikoz KRB tamponunu hazırlamak için 50 mL KRB için 180 mg).
    5. GSIS testine hazır olmak için hazırlanan LG ve HG KRB tamponlarını 0,2 μm şırınga filtresinden geçirerek sterilize edin.
  2. GSIS testi
    1. Başlangıçta 12 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında 1 x 105 hücre / kuyu tohumlayın ve aynı farklılaşma indüksiyon protokolünü kullanarak bu hücreleri indükleyin.
    2. İndüksiyon protokolünün sonunda, üretilen IPC'leri (plaka içinde) PBS ile 2 kez ve bir kez LG-KRB ile nazikçe yıkayın.
    3. Daha sonra, IPC'leri 1 saat boyunca 300 μL LG-KRB / kuyucuk ile inkübe edin ve ardından bu tamponu atın.
    4. Daha sonra, IPC'leri 300 μL 2 mM (LG) veya 20 mM (HG) KRB tamponu ile 1 saat daha inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, süpernatantı toplayın ve ticari bir ELISA kiti kullanarak ve üreticinin talimatlarını izleyerek sonraki salgılanan insülin tahlili için -80 ° C'de saklayın.
      NOT: GSIS tahlili yapılırken PBS ve KRB arabelleğini aspire ederken veya eklerken mümkün olduğunca nazik olmaya çalışın.
ParçaKonsantrasyon
Magnezyum Klorür (Susuz)0.0468 g/L
Potasyum Klorür0,34 g/L
Sodyum Klorür7,00 gr/l
Sodyum Fosfat Dibazik (Susuz)0,1 g/L
Sodyum Fosfat Monobazik (Susuz)0,18 g/L
Sodyum Bikarbonat1,26 g/L
Kalsiyum Klorür0.2997 g/L

Tablo 4: KRB tampon hazırlığı için kullanılan bileşenler.

8. İstatistiksel analiz

  1. Tüm verileri ortalamanın standart hatası (SEM) ± olarak ifade edin. Tüm karşılaştırmalar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve istatistiksel yazılım kullanılarak Tukey'in post hoc testi kullanılarak yapıldı. P değerleri ** p ≤ 0.01 ve *p ≤ 0.05 olan sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulundu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ad-MSC'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu
Şekil 2'de gösterildiği gibi, yağ dokusundan izole edilen hücreler, izolasyonun ertesi gününden başlayarak heterojen bir yuvarlak ve fibroblast benzeri hücre popülasyonu göstermiştir (Şekil 2A). İzolasyondan 4 gün sonra, fibroblast hücreleri sayı ve boyut olarak artmaya ve 1. pasajla homojen bir popülasyon olarak büyümeye başladı (Şekil 2B, C). Bu hücre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, Ad-MSC'lerin sıçan epididim yağından izolasyonu ve bu Ad-MSC'lerin IPC'lere farklılaşması için ayrıntılı bir protokol sunmayı başardık. Aslında, sıçan epididim yağı, Ad-MSC'leri elde etmek için kolayca elde edilebilir bir yağ dokusu kaynağıdır ve ne toplamane de işleme için herhangi bir özel ekipman gerektirmez 15,26,27. İzole edilmiş Ad-MSC'ler mükemmel kültür genişlemesi gösterdi ve MSC'ler olarak tanımlanacak t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm ortak yazarlar bu çalışmayla ilişkili çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Veteriner Uzmanı, Eczacılık Fakültesi, Mısır İngiliz Üniversitesi (BUE) sıçanların diseksiyonuna yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

Ayrıca, Mısır'daki İngiliz Üniversitesi (BUE) Kitle İletişim Fakültesi'nin bu el yazmasının videosunun üretimi ve düzenlenmesi için gösterdiği çabaları kabul etmek ve takdir etmek isteriz.

Makalenin revizyonu ve İngilizce dilinde düzeltilmesi için Mısır'daki İngiliz Üniversitesi (BUE) İngilizce Öğretim Görevlisi Yüksek Lisans Öğrencisi Bayan Fatma Masoud'a teşekkür ederiz.

Bu çalışma kısmen İlaç Araştırma ve Geliştirme Merkezi (CDRD), Eczacılık Fakültesi, Mısır'daki İngiliz Üniversitesi (BUE), Kahire, Mısır tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Albümin, sığır serumu Fraksiyon VMP Biyomedikal
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, ABDA3157
Alizarin Kırmızı SSigma-Aldrich, ABDA5533
Amonyum hidroksitFisher Scientific, Almanya
Sıçan CD90 için Antikor, FITCKök Hücre Teknolojileri60024FI
Sığır serum albüminiSigma AldrichA3912
Kalsiyum KlorürFisher Scientific, Almanya
CD105 Monoklonal Antikor, FITCThermo Fisher Scientific, Invitrogen, ABDMA1-19594
CD34 Poliklonal AntikorThermo Fisher Scientific, Invitrogen, ABDPA5-85917
KloroformFisher Scientific, ABD
Kollajenaz tip I, tozGibco, Thermo Fisher, ABD17018029
D-Glikoz susuz, ekstra safFisher Scientific, AlmanyaG/0450/53
Dimetil sülfoksit (DMSO)Fisher Scientific, AlmanyaBP231-100
Ditizon boyamaSigma-Aldrich, ABDD5130
DMEM - Yüksek Glikoz 4.5 g / LLonza, İsviçre12-604F
DMEM - Düşük Glikoz 1 g / LLonza, İsviçre12-707F
DMEM / F12 ortaLonza, İsviçreBE12-719F
DNAse / RNAse serbest suGibco Thermo Fisher, ABD10977-035
Etanol mutlak, Moleküler biyoloji notuSigma-Aldrich, Almanya24103
Exendin-4Sigma-Aldrich, AlmanyaE7144
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brezilya10270-106
Formaldehit %37Fisher Scientific
Hidroklorik asit (HCl)Fisher Scientific, Almanya
İzopropanol, Moleküler biyoloji sınıfıFisher Scientific, ABDBP2618500
L-GlutaminGibco Thermo Fisher, ABD25030-024
Magnezyum Klorür (Susuz)Fisher Scientific, Almanya
Mezenkimal Kök Hücre Fonksiyonel tanımlama kitiR& D systems Inc., MN, ABDSC006
NikotinamidSigma-Aldrich, AlmanyaN0636
Yağ Kırmızı LekeSigma-Aldrich, ABDO0625
Penisilin-Streptomisin-AmfoterisinGibco Thermo Fisher, ABD15240062
Fosfat tamponlu salin, 1X, Ca / Mg olmadanLonza, İsviçreBE17-516F
Potasyum ChlorideFisher Scientific, Almanya
Sıçan İnsülin ELISA KitiCloud-Clone Corp., ABDCEA682Ra
Sodyum BikarbonatFisher Scientific, Almanya
Sodyum KlorürFisher Scientific, Almanya
Sodyum Fosfat Dibazik (Susuz)Fisher Scientific, Almanya
Sodyum Fosfat Monobazik (Susuz)Fisher Scientific, Almanya
SYBR Green MaximaThermo Scientific, ABDK0221
Şırınga filtresi, 0.2 mikronCorning, ABD431224
TRIzolThermo Scientific, ABD15596026
Tripan mavisiGibco Thermo Fisher, ABD15250061
Tripsin-Versene-EDTA, 1XLonza, İsviçreCC-5012
Verso cDNA sentez kitiThermo Scientific, ABDAB-1453 / A
ve beta; -merkaptoetanolSigma-Aldrich, AlmanyaM3148

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43(2020).
  2. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. Haider, K. H. , Springer. Singapore. 1-28 (2022).
  3. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  4. De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
  5. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  6. Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572(2021).
  7. Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
  8. Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
  9. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  10. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387(2016).
  11. Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345(2016).
  12. Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236(2020).
  13. Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
  14. Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  15. Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
  16. Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
  17. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131(2018).
  18. Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
  19. Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339(2018).
  20. Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
  21. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108(2016).
  22. Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
  23. Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
  24. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221(2020).
  25. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , Hoboken, NJ. 1-12 (2010).
  26. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
  27. Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277(2021).
  28. Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652(2020).
  29. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68(2019).
  30. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
  31. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16(2020).
  32. Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232(2017).
  33. Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838(2016).
  34. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484(2020).
  35. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
  36. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  37. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
  38. Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Adipoz Mezenkimal K k H crelerK k H cre DiferansiyasyonuStromal Vask ler FraksiyonKollagenaz SindirimiCD Y zey MarkerlarGlukozla Stim le ns lin Sal n mDitiyon BoyamaBeta H cre Markerlar

İlgili makaleler