Ksenopus Oositlerinden Boşluk Bağlantı Akımının Kaydedilmesi

Özet

Burada, Xenopus oositlerinde boşluk bağlantı proteinlerini eksprese etmek ve yüksek yan akım ölçüm modunda çift oosit voltaj-kelepçe kayıtları için tasarlanmış ticari bir amplifikatör kullanarak iki appoze oosit arasındaki bağlantı akımını kaydetmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Ksenopus oositlerinde konneksinlerin ve inneksinlerin heterolog ekspresyonu, boşluk kavşaklarının (GJ'ler) biyofiziksel özelliklerini incelemek için güçlü bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, bu yaklaşım teknik olarak zordur, çünkü ortak bir zemini paylaşan iki karşıt oositin diferansiyel voltaj kelepçesini gerektirir. Az sayıda laboratuvar bu tekniği gerçekleştirmeyi başarmış olsa da, esasen hepsi ev yapımı amplifikatörler veya tek oosit kayıtları için tasarlanmış ticari amplifikatörler kullanmıştır. Diğer laboratuvarların bu tekniği uygulaması genellikle zordur. Çift oosit voltaj-kelepçe kayıtları için ticari bir amplifikatöre yüksek yan akım ölçüm modu dahil edilmiş olmasına rağmen, son çalışmamıza kadar uygulanması için bir rapor bulunmamıştır. Oositlerin ve çeşitli elektrotların hassas bir şekilde yerleştirilmesini sağlayan manyetik tabanlı bir kayıt platformunun inşası, banyo çözeltisinin voltaj diferansiyel elektrotlarında iletken olarak kullanılması, referans elektrot olarak ticari bir düşük sızıntılı KCl elektrodunun benimsenmesi dahil olmak üzere çeşitli teknik modifikasyonlar getirerek yüksek taraf akım ölçüm yaklaşımını daha pratik ve kullanışlı hale getirdik. İnce duvarlı cam kılcal damarlardan akım ve gerilim elektrotlarının imalatı ve manyetik tabanlı cihazlar kullanılarak tüm elektrotların konumlandırılması. Burada açıklanan yöntem, iki karşıt Xenopus oositi arasındaki birleşim akımının (I_j) uygun ve sağlam bir şekilde kaydedilmesini sağlar.

Giriş

GJ'ler, komşu hücreler arasında küçük sitozolik moleküllerin akım akışına ve değişimine izin verebilecek hücreler arası kanallardır. Birçok hücre tipinde bulunurlar ve çeşitli fizyolojik işlevleri yerine getirirler. Omurgalılardaki GJ'ler konneksinler tarafından oluşturulurken, omurgasızlardaki GJ'ler inneksinler tarafından oluşturulur. Her GJ, konneksin veya ineksin ^1,2,3 olup olmadıklarına bağlı olarak^, hemikanal başına 6 veya 8 alt üniteye sahip iki yan yana hemikanaldan oluşur. İnsanlarda 21 konneksin geni⁴ bulunurken, yaygın olarak kullanılan omurgasız modeller C. elegans ve Drosophila melanogaster'de sırasıyla 25 ve 8 inteksin geni vardır, ^5,6. Gen transkriptlerinin alternatif olarak eklenmesi, en azından innexins ^7,8 için GJ proteinlerinin çeşitliliğini daha da artırabilir.

GJ'ler moleküler bileşimlere göre üç kategoriye ayrılabilir: homotipik, heterotipik ve heteromerik. Homotipik bir GJ'nin tüm alt birimleri aynıdır. Heterotipik bir GJ'nin iki homomerik hemikanalı vardır, ancak iki hemikanal iki farklı GJ proteini tarafından oluşturulur. Heteromerik bir GJ en az bir heteromerik hemikanal içerir. GJ'lerin moleküler çeşitlilikleri, fizyolojik işlevleri için önemli olan farklı biyofiziksel özellikler kazandırabilir. GJ biyofiziksel özellikleri de düzenleyici proteinler tarafından modüle edilir⁹. GJ'lerin fizyolojik işlevlerini nasıl yerine getirdiklerini anlamak için, moleküler bileşimlerini, biyofiziksel özelliklerini ve düzenleyici proteinlerin işlevlerindeki rollerini bilmek önemlidir.

Heterolog ekspresyon sistemleri genellikle GJ'ler de dahil olmak üzere iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerini ve düzenleyici proteinlerin bunlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılır. Heterolog ekspresyon sistemleri spesifik proteinlerin ekspresyonuna izin verdiğinden, genellikle protein fonksiyonlarının diseksiyonuna, gereksiz fonksiyonlara sahip proteinlerin analizi zorlaştırabileceği doğal dokulardan daha uygundur ve I_j'nin kaydedilmesi mümkün olmayabilir. Ne yazık ki, Neuro-2A hücresi dışında en sık kullanılan hücre hatları, endojen konneksinlerin komplikasyonları nedeniyle GJ biyofiziksel özelliklerini incelemek için uygun değildir. Nöro-2A hücreleri bile bu tür analizler için her zaman uygun değildir. Örneğin, C. elegans ^9,10'daki UNC-9 GJ'lerin işlevi için gerekli olan UNC-1'in (yayınlanmamış) yokluğunda veya varlığında, UNC-7 ve UNC-9 ile transfekte edilen Neuro-2A hücrelerinde herhangi bir I_j tespit edemedik. Öte yandan, Xenopus oositleri GJ'lerin elektrofizyolojik analizleri için yararlı bir alternatif sistemdir. Endojen bir GJ proteini olan konneksin 38 (Cx38)^11'i ifade etmelerine rağmen, spesifik bir antisens oligonükleotid¹² enjekte edilerek potansiyel komplikasyonlardan kolayca kaçınılabilir. Bununla birlikte, Xenopus oositleri ile GJ'lerin analizleri, teknik olarak zor olan yan yana duran iki hücrenin diferansiyel voltaj kelepçesini gerektirir. Kurbağa blastomerlerinin çift voltajlı kelepçesinin en erken başarıları yaklaşık 40 yıl önce^13,14 olarak bildirilmiştir. O zamandan beri, birçok çalışma bu tekniği eşleştirilmiş Xenopus oositlerinde I_j'yi kaydetmek için kullanmıştır. Bununla birlikte, esasen önceki tüm çalışmalar ya ev yapımı amplifikatörler^12,15,16 ya da tek oositler üzerinde kayıtlar için tasarlanmış ticari amplifikatörlerle (GeneClamp 500, AxoClamp 2A veya AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 ile gerçekleştirilmiştir. . Ticari amplifikatörler bile çift oosit voltaj kelepçesi için talimatlar sağlamadığından, yeni veya daha az karmaşık elektrofizyolojik laboratuvarların bu tekniği uygulaması genellikle zordur.

Çift yumurta voltaj kelepçesi için sadece bir ticari amplifikatör, Warner Instruments'tan OC-725C geliştirilmiştir (Malzeme Tablosu, Şekil 1A). Bu amplifikatör, voltaj probundaki iki soketin bağlı olup olmadığına bağlı olarak standart modda (tek oositler için) veya yüksek yan akım ölçüm modunda (tek veya çift oositler için) kullanılabilir (Şekil 1B, C). Bununla birlikte, son çalışmamız^7'ye kadar, bu amplifikatörün yüksek yan akım ölçüm modunda kullanımını açıklayan tek bir yayın yoktu. Amplifikatör, başka bir laboratuvar tarafından çift oosit kayıtları için kullanılmasına rağmen, yüksek yan mod^21,22 yerine standartta kullanılmıştır. Amplifikatörü yüksek yan akım ölçüm modunda kullanan bu rapor eksikliği, teknik zorluklardan kaynaklanıyor olabilir. Üreticinin talimatlarını izleyerek yüksek yan modu kullanarak kararlı çift oosit kayıtları elde edemedik. Yıllar geçtikçe, yüksek yan akım ölçüm modunda iki OC-725C amplifikatör, standart modda iki OC-725C amplifikatör ve başka bir üreticiden iki amplifikatör kullanmak da dahil olmak üzere çift oosit kayıtları için üç farklı yaklaşım denedik. Sonunda, yalnızca kapsamlı deneme yanılma sonrası ilk yaklaşımla istikrarlı kayıtlar elde etmeyi başardık. Bu yayın, Xenopus oositlerinde GJ proteinlerini eksprese etmek, yüksek yan akım ölçüm modunu kullanarak I_j'yi kaydetmek ve popüler ticari yazılımları kullanarak elektrofizyolojik verileri analiz etmek için kullandığımız prosedürleri açıklamakta ve göstermektedir. Çift voltaj kelepçesi tekniği hakkında ek bilgi diğer yayınlarda bulunabilir^19,23.

Protokol

Ameliyatlar, Connecticut Üniversitesi Tıp Fakültesi kurumsal hayvan bakım komitesi tarafından onaylanan bir protokolün ardından gerçekleştirilir.

1. Kurbağa cerrahisi ve defoliküler oositlerin hazırlanması

1. Yetişkin bir dişi Afrika pençeli kurbağasını (Xenopus laevis) (Malzeme Tablosu) serin (buzlu) bir trikain çözeltisine (~ 300 mg / L) batırarak anestezi yapın.
2. Kurbağa perdeli ayaklarını sıkmaya çok az tepki verene veya hiç tepki göstermeyene kadar bekleyin (~ 15 dakika). Kurbağayı karnı yukarı bakacak şekilde bir ameliyat masasına koyun.
3. Sol veya sağ alt karın bölgesinde uzunlamasına bir kesiden (8-10 mm uzunluğunda) sonra, bir çift forseps ile küçük bir yumurtalık dokusu parçasını yavaşça çıkarın ve yumurtalık dokusunu bir çift küçük makasla serbest bırakın.
4. Serbest yumurtalık dokusunu derhal 60 mm'lik bir Petri kabı içinde Ca 2⁺ içermeyen ND96 çözeltisine (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) batırın.
5. Kesi, 5-0 ipek dikiş (Malzeme Tablosu) kullanarak basit kesilmiş dikişlerle kapattıktan sonra, kurbağayı iyileşme için sığ bir su tankına geri koyun.
   NOT: Kesi iki adımda kapatılır: önce periton ve kas tabakaları, sonra cilt tabakası. Her kurbağa, ardışık iki ameliyat arasında en az 4 haftalık bir aralıkla 5 ameliyata tabi tutulur.
6. İzole yumurtalık dokusunu, 20 mg kollajenaz (Malzeme Tablosu) ve²⁰ mg hyaluronidaz (Malzeme Tablosu) içeren 10 mL Ca 2 + içermeyen ND96 çözeltisi içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
7. Tüpü, tüm yumurtalar izole edilene (yalnız) kadar oda sıcaklığında (RT) bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.
8. Bundan sonra, bir cam Pasteur pipeti kullanarak 30-50 oositi bir Petri kabına aktarın ve defoliküle olup olmadıklarını belirlemek için yumurtaları sık sık bir stereomikroskop altında (≥25x en yüksek büyütme gücü) inceleyin.
   NOT: Pasteur pipeti, bir elmas yazıcısı (Malzeme Tablosu) kullanılarak daha geniş bir uç açıklığına "kesilmeli" ve kesici kenarı pürüzsüzleştirmek için ateşlenmelidir.
9. Yumurtaların% 70-80'i defoliküle olur olmaz, tüpü hafifçe eğerek enzim çözeltisini boşaltın. Tüpü ND96 çözeltisi (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl 2 1.8 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) ile doldurarak ve çözeltiyi boşaltarak yumurtaları 5 kez yıkayın.
10. Son yıkamadan sonra, yumurtaları ND96 çözeltisi içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Büyük ve sağlıklı görünümlü oositleri toplayın ve temiz bir cam Pasteur pipet kullanarak sodyum piruvat (2 mM) ve penisilin-streptomisin (100 U / mL) ile desteklenmiş ND96 çözeltisi içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
    NOT: "Büyük ve sağlıklı görünümlü oositler", enzimler tarafından aşırı sindirim belirtisi göstermeyen evre V ve VI'dakilerdir.
11. Toplanan oositleri içeren Petri kabını bir çevre odasına (15-18 ° C) yerleştirin.

2. GJ protein ekspresyonu

1. Üreticinin protokolünü takip eden bir RNA transkripsiyon kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak spesifik bir konneksin veya innexin in vitro tamamlayıcı RNA'sını (cRNA) sentezleyin.
2. RNA transkripsiyon kitinin kullanım kılavuzunda açıklanan bir lityum klorür yöntemi kullanarak cRNA'yı çökeltin.
3. Pelet% 70 etanol ile yıkayın, 20 μL nükleaz içermeyen_H2O içinde çözün ve 1 μL ribonükleaz inhibitörü ekleyin (40 U, Malzeme Tablosu).
4. Bir spektrofotometre (Malzeme Tablosu) kullanarak cRNA'nın konsantrasyonunu ölçün.
5. cRNA'yı bir Cx38 antisens oligo ile karıştırın, böylece son konsantrasyonlar 200-1.000 ng / μL cRNA ve 100 ng / μL oligo olur.
   NOT: Oligo dizisi 5′-GCTTTAGTAATTCCCCCC-3′dür ve Xenopus laevis Cx38 mRNA'da -5 ila +25 arasındaki nükleotidlere karşılık gelir (NCBI Erişimi: NM_001088018)¹¹. Oligo, cRNA ile karıştırılmadan önce bir stok çözeltisi (2.0 mg / mL) olarak tutulur.
6. 2 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde (~ 16.000 x g) dönerek cRNA'daki parçacıkları ortadan kaldırın ve pipetleme yoluyla tüm süpernatantı hızlı bir şekilde yeni bir tüpe aktarın (mikrosantrifüj tüpünün tabanını rahatsız etmekten kaçının).
7. cRNA'yı alikotlara (2.5 μL / şişe) bölün ve alikotları -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
8. Hızlı kürlenen bir epoksi yapıştırıcı kullanarak 35 mm'lik bir Petri kabının dibine küçük bir parça (~1 cm x 1 cm) naylon ağ (Malzeme Tablosu) yapıştırarak bir yumurta enjeksiyon kabı hazırlayın.
   NOT: Yumurta enjeksiyon kabı tekrar kullanılabilir. Her kullanımdan sonra% 70 etanol ile yıkayın.
9. Yumurta enjeksiyon kabını ND96 çözeltisi ile yaklaşık yarıya kadar doldurun (piruvat ve penisilin-streptomisin ile desteklenmiş).
10. Petri kabının içindeki sıralara 25-30 oosit yerleştirin.
11. Otomatik nanolitre enjektörün kullanım kılavuzundaki talimatları izleyerek yumurta enjeksiyonları için cam mikropipetler hazırlayın (Malzeme Tablosu).
    NOT: Bir mikroelektrot beveler (Malzeme Tablosu) kullanılması, oositlere minimum zarar veren keskin enjeksiyon mikropipetlerinin üretilmesine yardımcı olabilir.
12. Bir enjeksiyon mikropipetini hafif mineral yağ ile doldurun ve enjektörün mikropipet tutucusuna yerleştirin.
13. cRNA'yı depolanan alikotlardan birinden, pipetleme yaparak Petri kabı kapağının iç yüzeyine veya tabanına aktarın.
14. Enjektör kontrolöründeki FILL düğmesine basarak cRNA damlacığını mikropipetin ucuna aspire edin.
15. INJECT düğmesine basarak cRNA'yı (~50 nL/oosit) enjekte edin.
    NOT: Enjeksiyon hacmi, enjektör kontrolöründeki daldırma anahtarları tarafından ayarlanabilir.
16. Enjekte edilen oositleri ND96 çözeltisi (piruvat ve penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) içeren yeni bir Petri kabına aktarın ve 1-3 gün boyunca (GJ protein ekspresyon hızına ve seviyesine bağlı olarak) çevre odasının (15-18 ° C) içinde tutun. Yumurtaları yeni bir Petri kabına aktararak çözeltiyi günlük olarak değiştirin.

3. Yumurta eşleştirme

1. Enjekte edilen oositlerin birkaçını ND96 çözeltisi içeren 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
2. Yumurtayı saran şeffaf vitelin membranı nazikçe soymak için iki ince cımbız (Malzeme Tablosu) kullanın.
   NOT: İlk kullanımdan önce ve zaman zaman ince (600 Grit) zımpara kağıdı parçası kullanarak cımbız uçlarını keskinleştirmek gerekebilir.
3. ND96 çözeltisi içeren (piruvat ve penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) bir oosit eşleştirme odasına kuyucuk başına 2 oosit yerleştirin (Şekil 1D).
   NOT: Yumurta eşleştirme odası, hızlı kürlenen bir epoksi yapıştırıcı kullanılarak 35 mm'lik bir petri kabının (Malzeme Tablosu) dibine küçük bir Microwell Minitray (Malzeme Tablosu) parçası yapıştırılarak inşa edilmiştir. Mini tepsi, sıcak tel kesici (Malzeme Masası) kullanılarak küçük parçalara ayrılır. Minitray'ın oosit eşleştirmesi için kullanımı başlangıçta diğerleri tarafından tanımlanmıştır²⁴. Bir GJ proteini, sitozolik alanlarındaki amino asit kalıntılarının yük özelliklerine bağlı olarak oosit hücre zarında homojen olmayan bir şekilde dağılabilse^{de, rastgele} eşleştirme (oositin hayvan ve bitkisel kutupları arasında ayrım yapmadan) genel olarak yeterli görünmektedir.
4. Eşleştirilmiş oositler içeren Petri kabını, elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılmak üzere izolasyon masasında RT'de tutun.
   NOT: Eşleştirme süresi birkaç saatten bir güne kadar değişebilir. Uygun bir uygulama, öğleden sonra geç saatlerde yumurtaları eşleştirmek ve ertesi gün onlardan kayıt yapmaktır.

4. Satın alma sisteminin hazırlanması

1. Dahili bir daldırma anahtarı ayarlayarak iki OC-725C oosit kelepçeli amplifikatörünü (Malzeme Tablosu) yüksek yan akım ölçüm moduna yapılandırın (Şekil 1B).
2. Amplifikatörleri, önce arka panellerdeki Toprak Devresi soketlerini birbirine bağlayarak ve ardından Faraday kafesine ve kayıt odasını aydınlatmak için kullanılan fiber ışığa bağlayarak topraklayın.
3. Amplifikatörleri analog-dijital sinyal dönüştürücüsüne (Malzeme Tablosu) bağlayın ve amplifikatör üreticisinin talimatlarını izleyerek pClamp yazılımının Clampex modülünde (Malzeme Tablosu) yapılandırın.
4. Toplama sistemini, amplifikatörle birlikte verilen model hücresiyle test edin.
   1. V DIFF probunu ve akım (I) kablolarını model hücresine bağlayın, V _DIFF probundaki Kırmızı ve Siyah soketleri birlikte verilen jumper ile bağlayın, jumper'ın her iki bacağını da model hücresindeki pimlere bağlayın ve model hücresindeki topraklama kablosunu amplifikatörün GROUNDS CIRCUIT soketinden kabloya bağlayın (Şekil 1E).
   2. Sırasıyla Vm OFFSET ve Ve OFFSET düğmelerini çevirerek amplifikatörün Voltaj Elektrodu (Vm) ve Banyo Elektrodu (Im) metrelerini sıfırlayın, Kelepçeyi KAPALI'dan Hızlı veya YAVAŞ'a çevirin ve GAIN kadranını saat yönünde uygun voltaj kelepçesine izin verecek bir seviyeye çevirin (Şekil 1A). D.C. GAIN anahtarı OUT veya IN konumunda olabilir.
   3. Vm ölçerde görüntülenen voltajın alım protokolüne göre değiştiğini ve voltaj ve akım izlerinin Clampex'te düzgün bir şekilde görüntülendiğini doğrulamak için birkaç voltaj adımı içeren basit bir alım protokolü çalıştırın.
      NOT: Bu yaklaşım kullanılarak her seferinde yalnızca bir amplifikatör test edilebilir.

5. Eşleştirilmiş _oositler arasında I j kaydı

1. pClamp yazılımında I_j'yi kaydetmek için edinme protokolleri oluşturun.
   NOT: İki alma protokolü oluşturun. Bunlardan birinde, amplifikatör # 1, bir dizi membran voltajı (V m) adımı üretmek için kullanılır (örneğin, 10-mV aralıklarla -150 ila +90 mV), oysa amplifikatör #2, sabit bir V_m'yi (örneğin, -30 mV) korumak için kullanılır. Diğer protokolde, V m adımlarını üretmek için #2 amplifikatör kullanılırken, V_m sabitini korumak için # 1 amplifikatör kullanılır. Pozitif ve negatif V_m adımları alternatif olarak uygulanmalıdır (örneğin, -150, +90, -140, +80 ......), bu da edinme protokolündeki Kullanıcı Listesi özelliği kullanılarak Clampex'te programlanabilir.
2. Kayıt aşamasını ayarlama
   1. Eşleştirilmiş oositler içeren bir Petri kabını kayıt platformundaki Petri kabı kabına bırakın (Şekil 2A)
   2. Bir çift oosit seçin ve gerekirse Petri kabını döndürün, böylece iki oosit sol ve sağ yönde olur ve sahneyi manyetik tabanı ile pozisyonda kilitleyin.
   3. Akım ve voltaj problarını tutan manyetik standları izolasyon tablasında uygun yerlere sabitleyin.
      NOT: Bir yükselteçten gelen akım ve gerilim problarının sol tarafta, diğer amplifikatörden gelen probların ise sağ tarafta olduğundan ve voltaj probunun her iki taraftaki akım probunun önünde olduğundan emin olun (Şekil 2B, C).
3. Referans elektrodunu ayarlama
   1. Petri kabının kenarına kullanıcı tarafına doğru bir referans elektrodu (Malzeme Tablosu) yerleştirin (Şekil 2B, C).
   2. Referans elektrodunu, iki V_DIFF probundan yalnızca birinde siyah sokete (Devre Topraklaması) bağlayın.
4. V_DIFF elektrotlarını kurma
   1. Bir çift cam mikropipet çekin, elmas yazıcıyla ucun bir kısmını kesin (Malzeme Tablosu) ve uç kenarını ateşle parlatarak pürüzsüzleştirin.
      NOT: Uç direnci 150 kΩ'dan az olmalıdır (pipetteki ND96 ile ölçülmüştür). Tipik olarak uç direnci 20-150 kΩ olan mikropipetler kullanılır.
   2. Mikropipeti bir alkol brülörünün alevinin üzerinde tutarak ucundan ~1 cm uzakta bir konumda pürüzsüz bir açıyla (~130°) bükün.
      NOT: Fabrikasyon mikropipetler yeniden kullanılabilir. Her kullanımdan sonra suyla durulayın.
   3. Cam pipeti tamamen ND96 çözeltisiyle doldurun, önceden doldurulmuş (ND96 ile) bir mikroelektrot tutucuya (Malzeme Tablosu, Şekil 2D) yerleştirin ve sistemde hava kabarcığı olmadığından emin olun.
   4. Mikroelektrot tutucunun 2 mm'lik pimini V_DIFF elektrot bağlantı telinin 2 mm'lik soketine yerleştirin (Şekil 2D).
   5. 2 mm'lik soketi manyetik tabanlı bir kelepçeleyici üzerine sıkıştırın (Şekil 2D) ve V_DIFF elektrodunun ucunu iki oositten birine doğru hedefleyin (Şekil 2E).
      NOT: Kelepçenin konumunu ve açısını, elektrotun ucu yumurtaya çok yakın olacak şekilde ayarlayın
   6. V DIFF elektrot bağlantı kablosunun 1 mm'lik pimini aynı taraftaki V DIFF probundaki kırmızı sokete (V _DIFF Girişi) takın.
   7. Benzer prosedürleri izleyerek diğer yumurta ve amplifikatör için bir V_DIFF elektrodu hazırlayın ve bağlayın.
      NOT: Bir çift oosit ve tüm elektrotların yakından görünümü Şekil 2E'de gösterilmiştir.
5. Akım ve gerilim elektrotlarını ayarlama
   1. Cam kılcal damarlardan voltaj ve akım elektrotları hazırlayın, bunları bir KCl çözeltisiyle (KCl 3.0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4 KOH ile) doldurun ve amplifikatörlerle birlikte verilen elektrot tutuculara yerleştirin.
      NOT: Elektrotlar ~1 MΩ dirence sahip olmalıdır. Uygun elektrotlar, belirli bir çekme parametreleri seti kullanılarak bir tür ince duvarlı cam kılcal damardan (Malzeme Tablosu) elde edilebilir (Tablo 1). Bu tür uçlar, amplifikatör üzerindeki Vm veya Ve BUZZ düğmesine basmaya gerek kalmadan yumurta hücre zarına kolayca nüfuz edebilir.
   2. Elektrotları banyo çözeltisine indirin, Vm OFFSET ve Ve OFFSET kadranlarını çevirerek Vm ve Im sayaçlarını sıfırlayın ve Vm Elektrot Testi ve Ve Elektrot Testi tuşlarına basarak elektrot direncini kontrol edin.
   3. Akım ve voltaj elektrotlarını yumurtaların içine yerleştirin ve negatif membran potansiyellerini gözlemleyin (tipik olarak -20 ila -50 mV).
      NOT: Aynı amplifikatörün Vm ve Im ölçerleri iki özdeş veya çok benzer değer göstermelidir.
6. Veri toplama
   1. Amplifikatörün Kelepçe bölümünde, D.C. GAIN'in IN konumunda olduğunu onaylayın, GAIN düğmesini saat yönünde uygun voltaj kelepçesine izin veren bir seviyeye (tipik olarak tam aralığın üçte biri ila yarısı) çevirin ve Kelepçe anahtarını KAPALI'dan HIZLI'ya çevirin.
      NOT: Kelepçeyi açtıktan sonra, Vm ve Im sayaçları sırasıyla tutma voltajını ve tutma akımını gösterecektir. Tutma akımı yumurta koşullarına bağlı olarak biraz değişebilse de, tutma V_m'de (örneğin, -30 mV) genellikle küçük ve kararlıdır.
   2. Bir satın alma protokolü çalıştırın.
      NOT: Ekranda dört iz görüntülenecektir. Bir amplifikatörden gelen voltaj ve akım izleri, oosit #1'e uygulanan Vm adımlarını ve Vm adımlarını üretmek için gereken akımı gösterirken, diğer amplifikatörden gelenler oosit #2'nin sabit Vm'sini (-30 mV) ve bu sabit Vm'yi korumak için enjekte edilen akımı gösterir. Oosit #2'ye enjekte edilen akım I_j'yi temsil eder.

6. Veri analizi

1. Clampfit ile analiz.
   1. pClamp'ın Clampfit modülünde kayıtlı bir abf dosyasını açın.
   2. I_j izlemelerinden önce taban çizgisinin bir bölümünü içine almak için imleç 1 ve 2'yi kullanın.
   3. Bir Taban Çizgisi penceresi açmak için Taban Çizgisini Ayarla simgesine tıklayın. Yöntem için İmleçlerin Ortalamasını Çıkar 1..2'yi seçin ve İzleme Seçimi için Tüm Görünür Sinyallerin ve Tüm Görünür İzlemelerin seçildiğini onaylayın.
   4. Tamam'a tıklandığında, Temel penceresi kapanır, tüm akım ve voltaj izlemelerinin taban çizgileri sıfır düzeyinde birleşir. Voltaj adımlarının, orijinal voltaj eksi tutma voltajına (örneğin, -30 mV) eşit olan yeni seviyelere değiştiğini unutmayın.
   5. I j ve V_j ilişkisini kararlı durum I j kullanarak çizmek için, kararlı durum I j'yi temsil eden I _j izlerinin istenen bir bölümünü imleç 1 ve 2 ile çevreleyin, imleç 3'ü voltaj adımlarının zaman penceresinde herhangi bir yere yerleştirin.
   6. Bir I-V penceresi açmak için Analiz / Hızlı Grafik / I-V'ye gidin.
   7. X Ekseni (Voltaj) altında, Sinyal'den İmleç 3'ü seçin, açılır menüden voltaj adım sinyalini (örneğin, Voltaj 1) belirtin ve Ters Çevir kutusunu işaretleyin.
      NOT: V _m'yi, oosit #2-V _m oosit #1 olarak tanımlanan V_j'ye eşdeğer değerlere dönüştürmek için Ters Çevir kutusu işaretlenir.
   8. Y Ekseni (Akım) altında, Sinyal'in yanındaki açılır menüden I_j sinyalinin kaynağını (ör. Geçerli 0) seçin, açılır menüden Bölge'yi İmleçler 1..2 olarak tanımlayın ve Ortalama'yı seçin.
      NOT: Tepe I j ve V j ilişkilerini çizmek için, imleç 1 ve 2, adım 6.1.5'te tepe I _j'yi içeren I_j izlemelerinin segmentini içine almalı ve adım 6.1.8'de Tepe (Ortalama yerine) seçeneğini seçmelidir.
   9. Hedef seçeneği altında, Değiştir veya Ekle'yi seçin.
   10. I-V penceresinde Tamam'a tıklandığında, ekranda bir I j - V j ilişkisi görüntülenir ve karşılık gelen I j ve V _j değerleri Pencere/Sonuç tıklatılarak bulunabilir.
2. G j-V_j ilişkisini OriginPro'da çizin ve sığdırın (Malzeme Tablosu)
   1. V j ve I _j değerlerini içeren iki sütunu Clampfit'in Sonuçlar penceresinden (adım 6.1.10) Origin'deki yeni bir Çalışma Kitabı'na kopyalayın. V_j ve I_j değerlerinin sırasıyla X ve Y sütunlarının altında olduğundan emin olun.
   2. Sütun / Yeni Sütunlar Ekle'yi tıklatarak Çalışma Kitabına dört yeni sütun ekleyin.
   3. İlk yeni sütunu G j olarak adlandırın, Sütun Değerlerini Ayarla penceresine "sütun I j/sütun V j * 1.000" denklemini girerek doldurun ve G j-V _j ilişkisinin dağılım grafiğini oluşturun.
      NOT: 1.000 ile çarpma (isteğe bağlı), sonraki adımlarda çok küçük sayılarla uğraşmanın zorluğunu önlemek içindir.
   4. G j veri noktalarını negatif ve pozitif V_j aralıkları üzerinden Boltzmann fonksiyonuna bağımsız olarak takın. G _j'yi V _j = 0 mV'de hesaplayın, G jmax, G_jmin, A ve V₀ değerlerini bir elektronik tabloda yapılabilen Boltzmann denklemine sığdırmadan girin. Bu şekilde elde edilen G _j, bir sonraki adımda G_jmax olarak kullanılacaktır.
      NOT: Boltzmann fonksiyonuna uyacak denklem şöyledir: G j = (G jmax-G jmin)/{1 + exp[A(V j-V 0)]} + G jmin, burada V ₀, iletkenliğin yarı maksimum olduğu V j'dir, G jmax maksimum iletkenliktir, G _jmin V _{j-duyarsızdır} artık iletkenlik²³. Montajı gerçekleştirmek için, önce Boltzmann denklemini OriginPro'ya yeni bir montaj fonksiyonu olarak ekleyin ve ardından montaj için bu işlevi seçin. Takma işlevini yürütmeden önce G _jmax, G _jmin, V₀ ve A için yaklaşık çekirdek değerlerini girin. G_jmax parametresinin bu bağlantı için sabit olmadığından emin olun.
   5. İkinci ve üçüncü yeni sütunları nGj-L ve nGj-R ("normalleştirilmiş" için n") olarak adlandırın ve G j sütununu sırasıyla sol ve sağ G _j - V_j eğrilerinden türetilen G_jmax değerlerine bölerek doldurun (adım 6.2.4).
   6. Dördüncü yeni sütunu nGj-LR olarak adlandırın ve sırasıyla nGj-L ve nGj-R sütunlarının negatif ve pozitif V_j aralıklarından değerler kopyalayarak doldurun.
   7. V j üzerinden nGj-LR için bir dağılım grafiği oluşturun ve negatif ve pozitif V_j aralıkları üzerindeki veri noktalarını bağımsız olarak Boltzmann işlevine sığdırın. Bağlantı parçası için G_jmax parametresinin 1,0'da sabitlendiğinden emin olun.
   8. Montaj sonuçlarının kayıtlarını tutun (örneğin, takılı grafik ve G_jmin, V₀ ve A değerleri).

Sonuçlar

UNC-7 ve UNC-9, C. elegans'ın inteksinleridir. UNC-9 sadece bir izoforma sahipken, UNC-7, esas olarak amino terminalleri ^7,8'in uzunluğu ve amino asit dizisinde farklılık gösteren çoklu izoformlara sahiptir. Bu inneksinler, Xenopus oositleri ^7,8 ile eksprese edildiğinde homotipik ve heterotipik (^UNC-7 ve UNC-9) GJ'ler oluşturabilir. Temsili I j izleri ve UNC-7b ve UNC...

Tartışma

Çift yumurta voltaj kelepçesi deneyleri için sistem optimizasyonu gerekli görünmektedir. Onsuz, kayıtlar oldukça kararsız olabilir ve amplifikatörlerin hedef Vm'ye ulaşmak için aşırı miktarda akım enjekte etmesi gerekebilir, bu da yumurta hasarına ve kayıt hatalarına neden olabilir. Yüksek yan akım ölçüm yöntemi ile stabil çift oosit kayıtları elde etmek için çeşitli faktörler kritik öneme sahiptir. İlk olarak, akım ve voltaj elektrotları uygun dirence (~ 1 MΩ) sahip olmalı ve tutucuları temiz olmalıdır. İkincis...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agar Köprüsü Manyetik Tutucu	ALA Scientific Instruments	MPSALT-H	büyük manyetik tabanı nedeniyle Narishige tüp kelepçesinden daha kararlıdır, ancak 2 mm'lik bir dişi soketi akredite etmek için modifikasyon gerektirir.
Otomatik Nanolitre Enjektör	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, ABD	Nanoject II	Otomatik nanolitre enjektör
Kollajenaz, Tip II	Gibco-ABD, Langley, OK, ABD	17101-015
Elmas Scriber	Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD	62108-ST
Diferansiyel Gerilim Probu	Warner Instruments, Hamden, CT, ABD	7255DI
Analogdan Dijitale Sinyal Dönüştürücü	Moleküler Cihazlar, San Jose, CA, ABD	Digidata 1440A
Dumont #5 Cımbız	Dünya Hassas Aletleri, Sarasota, FL, ABD	500341
Cam Kılcal Damarlar	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, ABD	3-000-203-G/X
Sıcak Tel Kesici	Amazon.com	Proxxon 37080	Bir alternatif, ayak kontrol pedalına sahip Hercules 8500 DHWT'dir.
Hyaluronidaz, Tip I-S	MilliporeSigma, Burlington, MA, ABD	H3506
Manyetik Tutucu Taban	Kanetec USA Corp., Bensenville, IL, ABD	MB-L-45
Mikroelektrot Beveler	Sutter Aleti, Novato, CA, ABD	BV-10
Mikroelektrot Tutucu	Dünya Hassas Aletleri, , Sarasota, FL, ABD	MEH1S15
Mikropipet Çektirme	Sutter Instrument, , Novato, CA, ABD	P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3	Invitrogen-FisherScientific	AM1348
Nunc MicroWell MiniTray	Nalge Nunc International, Rochester, NY, ABD	438733	Microwell Minitray
Naylon örgü	Bileşen Tedarik Şirketi, Sparta, TN, ABD	U-CMN-1000
Oosit Kelepçe Amplifikatör	Warner Aletler, , Hamden, CT, ABD	OC-725C
	OriginPro OriginLab Corporation, Northampton, MA, ABD	2020b
pClamp	Moleküler Cihazlar, , San Jose, CA, ABD	Sürüm 10
Referans Elektrot	Dünyası Hassas Aletler, Sarasota, FL, ABD	DRIREF-2SH	Özellikler: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (ribonükleaz inhibitörü)	Invitrogen-FisherScientific	10777-019
İpek Sütür 5-0	Covidien, North Haven, CT, ABD	VS890
Spektrofotometre NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
İnce Duvar Cam Kapallar	Dünya Hassas Aletleri, Sarasota, FL, ABD	TW150F-4
Tüp Kelepçe	Narishige International USA, Amityville, NY, ABD	CAT-1	Kullanıma hazırdır ancak küçük manyetik taban nedeniyle konumu kaymaya eğilimlidir.
Xenopus laevis	Xenopus Express, Brooksville, FL, ABD	IMP-XL-FM