Method Article

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

DOI:

10.3791/63377

⸱

February 18th, 2022

 ,  , 
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrotübüller, hücrelerde farklı yapılara organize olan αβ-tübülin heterodimerlerinin polimerleridir. Mikrotübül tabanlı mimariler ve ağlar genellikle dinamik özelliklerinde farklılık gösteren mikrotübül dizilerinin alt kümelerini içerir. Örneğin, bölünen hücrelerde, çapraz bağlı mikrotübüllerin kararlı demetleri, dinamik çapraz bağlı olmayan mikrotübüllere yakın bir yerde bir arada bulunur. TIRF-mikroskopi tabanlı in vitro sulandırma çalışmaları, bu farklı mikrotübül dizilerinin dinamiklerinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar. Bu tahlilde, bir görüntüleme odası, tek filamentler halinde bulunan veya çapraz bağlı demetler halinde organize edilen yüzey immobilize mikrotübüllerle birleştirilir. Tübülin, nükleotitler ve protein düzenleyicilerinin tanıtılması, ilişkili proteinlerin ve tek ve çapraz bağlı mikrotübüllerin dinamik özelliklerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Ayrıca, dinamik tek mikrotübüller demetler halinde organize olurken meydana gelen değişiklikler gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Burada açıklanan yöntem, bireysel proteinlerin aktivitesinin ve lokalizasyonunun sistematik bir değerlendirmesinin yanı sıra, protein düzenleyicilerinin aynı deneysel koşullar altında iki farklı mikrotübül alt kümesi üzerindeki sinerjik etkilerinin sistematik bir şekilde değerlendirilmesine izin verir, böylece diğer yöntemlerle erişilemeyen mekanik bilgiler sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrotübüller, hücre içi taşıma ve organel konumlandırmasından hücre bölünmesi ve uzamasına kadar çoklu hücresel süreçler için gerekli olan yapısal iskeleleri oluşturan biyopolimerlerdir. Bu çeşitli işlevleri yerine getirmek için, bireysel mikrotübüller mitotik iğler, siliyer aksonemler, nöronal demetler, interfaz dizileri ve bitki kortikal dizileri gibi mikron boyutlu diziler halinde düzenlenir. Bu yapılarda bulunan her yerde bulunan bir mimari motif, uzunlukları boyunca çapraz bağlanmış bir mikrotübül demetidir1. Birkaç mikrotübül bazlı yapının ilgi çekici bir özelliği, demetlenmiş mikrotübüllerin ve çapraz bağlı olmayan tek mikrotübüllerin y....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Reaktifleri hazırlayın

  1. Arabellekleri ve reaktifleri Tablo 1 ve Tablo 2'de belirtildiği gibi hazırlayın. Deney sırasında, aksi belirtilmedikçe, tüm çözeltileri buz üzerinde tutun.
ÇözümBileşenÖnerilen Depolama SüresiNotlar
5X BRB80 Serisi400 mM K-BORULAR, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 6.8 KOH ile, filtre steri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan deney, 647 nm florofor etiketli biyotinillenmiş mikrotübüller, 560 nm florofor etiketli biyotinillenmemiş mikrotübüller ve 560 nm florofor etiketli çözünür tübülin karışımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Mikrotübüller, çapraz bağlayıcı protein PRC1 (GFP etiketli) ile çapraz bağlandı. Yüzeysel hareketsiz demetler ve tek mikrotübüller üretildikten sonra (adım 5.11), görüntüleme odası bir TIRF 100X 1.49 NA yağ hedefi üzerine monte edildi ve 560 nm ve 647 nm floresan kanallarında görüntülendi. Tek mikr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan deney, geleneksel olarak tek mikrotübüller veya bir dizi türü üzerinde gerçekleştirilen geleneksel mikrotübül sulandırma tahlillerinin kapsamını ve karmaşıklığını önemli ölçüde genişletmektedir. Mevcut tahlil, iki popülasyonda, yani tek mikrotübüller ve çapraz bağlı demetler üzerindeki düzenleyici MAP aktivitesini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, bu tahlil iki tür demetin incelenmesine izin verir: dinamiklerin başlatılmasından önce kararlı tohumlardan önceden oluştu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH'den (no. 1DP2GM126894-01) bir hibe ve Pew Charitable Trusts ve Smith Family Foundation'dan R.S.'ye sağlanan fonlarla desteklendi. Yazarlar, protokollerin geliştirilmesine ve optimizasyonuna yaptığı katkılardan dolayı Dr. Shuo Jiang'a teşekkür eder.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-Hidroksi-2,5,7,8-tetrametilroman-2-karboksilik asit (Trolox)Sigma Aldrich238813
1,4-piperazindietansülfonik asit (PIPES)Sigma AldrichP6757
18x18 mm #1.5 lameller Elektron Mikroskobu Bilimleri63787
2-Merkaptoetanol (BME)Sigma AldrichM-6250
24x60 mm # 1.5 lamellerElektron Mikroskobu Bilimleri63793
405/488/560/647 nm Lazer Dörtlü Bant ChromaTRF89901-NK
AsetonSigma Aldrich320110
Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat (ATP)Sigma AldrichA7699-5G
Avidin, NeutrAvidin > Biyotin Bağlayıcı Protein (Moleküler Problar®)Thermo Fischer ScientificA2666
Banyo sonikatörü: Branson 2800 TemizleyiciBransonCPX2800H
Beckman Coulter Polikarbonat Kalın Duvar Tüpleri, 11 x 34 mmBeckman-Coulter 
Beckman Coulter Polikarbonat Kalın Duvar Tüpleri, 8 x 34 mmBeckman-Coulter 
Biotin-PEG-SVA, MW 5.000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma Aldrich2905
KatalazSigma AldrichC40
Corning LSE Mini Mikrosantrifüj, AC100-240VCorning6670
Hassas Görev MendilleriKimtech34120
Dithiothreitol (DTT)GoldBioDTT10
Emisyon filtresiChromaET610/75m
Etanol (200 geçirmez)Decon Labs2705
Etilen glikol tetraasetik asit (EGTA)Sigma Aldrich3777
Glikoz OksidazSigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
Guanozin 5'-trifosfat sodyum tuzu hidrat (GTP)Sigma AldrichG8877
Hellmanex III deterjan ve nbsp;Sigma AldrichZ805939
Daldırma yağı, Tip AFisher Scientific77010
Kappa-kazeinSigma AldrichC0406
LanolinFisher ScientificS25376
Lens Temizleme DokusuThorLabsMC-5
Magnezyum Klorür (MgCl2)Sigma AldrichM9272
MetilselülozSigma AldrichM0512
Mikrofüj 16 Tezgah Üstü SantrifüjBeckman-Coulter A46474
Mikroskop Slaytları, Elmas Beyaz Cam, 25 x 75mm, 90 derece; Zemin Kenarları, BEYAZ BuzluKüre Scientific1380-50W
mPEG-Süksinimidil Valerate, MW 5.000 Laysan Biyo#NH2-PEG-VA-5K
Optima & Max-XP Masaüstü UltrasantrifüjBeckman-Coulter 
ParafinFisher ScientificP31-500
PELCO Ters (kendi kendine kapanan), İnce CımbızTed Pella5377-NM
Petrolatum, WhiteFisher Scientific18-605-050
Plazma Temizleyici, 115VHarrick PlazmaPDC-001
Potasyum Hidroksit (KOH)Sigma Aldrich221473
Sodyum bikarbonatSigma AldrichS6014
SükrozSigma AldrichS7903
Termal-Lok 1 Pozisyonlu Kuru Isı BanyosuUSA Scientific2510-1101
1.5 ve 2.0 mL Tüpler için Termal-Lok BlokUSA Scientific2520-0000
Thermo Scientific & Pierce ve ticaret; Tahvil Kırıcı ve ticaret; TCEP Çözeltisi, Nötr pH; 500mMThermo Fischer ScientificPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Yağ ObjektifiNikonCFI Apochromat TIRF 100XC Yağ
TIRF mikroskobuNikonEclipse Ti
TLA 120.1 rotorBeckman-Coulter 
TLA 120.2 rotorBeckman-Coulter 
Tübülin proteini (% >99 saf): domuz beyniHücre iskeletiT240
Tubulin Proteini (Biotin): Domuz BeyinHücre İskeletiT333P
Tubulin proteini (floresan HiLyte 647): domuz beyniHücre iskeletiTL670M
Tubulin proteini (X-rodamin): sığır beyniHücre iskeletiTL620M
VECTABOND® Reaktif, Doku Kesiti YapışmaVektörü BiolabsSP-1800-7
VWR® Kişisel Boyutlu İnkübatör, 120V, 50/60Hz, 0.6AVWR97025-630
343778343776393315362224357656

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal mic....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TIRF MicroscopyMicrotubule DynamicsCrosslinked MicrotubulesSingle MicrotubulesIn Vitro ReconstitutionFluorescence ImagingMicrotubule BundlesProtein RegulatorsSurface ImmobilizationMicrotubule Organization

Related Articles