Radyoaktif Olmayan Demir İzotopları Kullanarak Fare Plasentası In Vivo Boyunca Demir Taşımacılığının Ölçülmesi

Özet

Bu makalede, fare gebeliğinde demir taşıma çalışmaları için transferrine bağlı radyoaktif olmayan izotopik demirin nasıl hazırlanacağı ve uygulanacağı gösterilmektedir. Fetoplasental bölmelerde izotopik demirin miktarının belirlenmesi yaklaşımı da açıklanmaktadır.

Özet

Demir, hamilelik sırasında anne ve fetal sağlık için gereklidir ve sağlıklı bir hamileliği sürdürmek için insanlarda yaklaşık 1 g demir gerekir. Fetal demir bağışı tamamen plasenta boyunca demir transferine bağlıdır ve bu transferin pertürbasyonları olumsuz gebelik sonuçlarına yol açabilir. Farelerde, plasenta boyunca demir akışlarının ölçümü geleneksel olarak radyoaktif demir izotoplarına dayanıyordu, bu oldukça hassas ama külfetli bir yaklaşımdı. Kararlı demir izotopları (⁵⁷Fe ve ⁵⁸Fe), insan gebelik çalışmalarında kullanılmak üzere radyoaktif olmayan bir alternatif sunar.

Fizyolojik koşullar altında, transferrine bağlı demir, plasenta tarafından alınan demirin baskın şeklidir. Bu nedenle, plasental demir taşınımını doğrudan değerlendirmek ve kafa karıştırıcı bir değişken olarak maternal intestinal demir emilimini atlamak için ⁵⁸Fe-transferrin hazırlandı ve gebe barajlarda intravenöz olarak enjekte edildi. İzotopik demir, plasenta ve fare embriyonik dokularında endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi (ICP-MS) ile kantite edildi. Bu yöntemler, in vivo demir dinamiklerini ölçmek için fizyoloji veya hastalığın diğer hayvan modeli sistemlerinde de kullanılabilir.

Giriş

Demir, büyüme ve gelişme, enerji üretimi ve oksijen taşınması dahil olmak üzere çeşitli metabolik süreçler için kritik^{öneme sahiptir 1}. Demir homeostazının bakımı dinamik, koordineli bir süreçtir. Demir, duodenumdaki gıdalardan emilir ve demir taşıma proteini transferrinine (Tf) bağlı dolaşımda vücudun etrafında taşınır. Her hücre tarafından enzimatik işlemler için kullanılır, yeni ortaya çıkan eritrositlerde hemoglobine dahil edilir ve makrofajlar tarafından yaşlı eritrositlerden geri dönüştürülür. Demir, aşırı olduğunda karaciğerde depolanır ve kanama veya hücre dökülmesi yoluyla vücuttan kaybolur. Dolaşımdaki demir miktarı, tüketim ile demir arzı arasındaki dengenin sonucudur, ikincisi, demir homeostazının merkezi düzenleyicisi olan hepatik hormon hepcidin (HAMP) tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir¹. Hepcidin, her yerde bulunmasını engelleyerek veya indükleyerek ve demir ihracatçısı ferroportini (FPN) bozarak kandaki demir biyoyararlanımını sınırlamak için işlev ^görür2. Fonksiyonel FPN'deki azalma, diyetle demir emiliminin azalmasına, karaciğerde demir tutulmasına ve makrofajlardan demir geri dönüşümünün azalmasına yol açar¹.

Hepcidin demir durumu, inflamasyon, eritropoietik sürücü ve gebelik ile düzenlenir (^3'te gözden geçirilmiştir). Demir homeostazının oldukça dinamik olduğu göz önüne alındığında, toplam demir havuzunu ve demir dağılımını ve cirosunu anlamak ve ölçmek önemlidir. Hayvan çalışmaları geleneksel olarak demir dinamiklerini ölçmek için oldukça hassas ancak külfetli bir yaklaşım olan radyoaktif demir izotoplarına dayanıyordu. Bununla birlikte, burada sunulan çalışma da dahil olmak üzere daha yeni çalışmalarda⁴, gebelik sırasında demir taşınımını ölçmek için radyoaktif olmayan, kararlı demir izotopları (⁵⁸Fe) kullanılmaktadır 5,6,7,8,9. Kararlı izotoplar, besin metabolizmasını incelemek için değerli araçlardır (^10'da gözden geçirilmiştir). İnsan çalışmalarında stabil demir izotoplarının kullanımı, i) demir emiliminin gebeliğin sonuna doğru arttığını^{göstermiştir 5,6}, ii) diyet demirinin fetüse transferinin maternal demir durumuna bağlı olduğu⁷, iii) maternal olarak alınan heme demiri, fetüs tarafından nonheme demir 8'den daha kolay dahil edilir ve iv) fetüse demir transferinin maternal hepcidin seviyeleri ⁸ ile negatif korelasyon gösterir^{, 9}. Bu deneyler serumlardaki demir izotoplarını veya RBC'lere dahil edilmelerini ölçtü; Bununla birlikte, yalnızca RBC'lere dahil edilen demirin ölçümü, gerçek demir emilimini hafife alabilir⁹. Bu çalışmada, dokularda hem heme hem de nonheme demir ölçülmüştür.

Hamilelik sırasında, maternal kırmızı kan hücresi hacminin genişlemesini desteklemek ve fetüsün büyümesini ve gelişmesini desteklemek için plasenta boyunca transfer için demir gereklidir¹¹. Fetal demir bağışı tamamen plasenta boyunca demir taşınmasına bağlıdır. İnsan 12 ve kemirgen ^4,13 gebelik sırasında, hepcidin seviyeleri önemli ölçüde azalır ve fetüse transfer için plazma demir mevcudiyetini arttırır.

Plasental demir taşımacılığının temelleri başlangıçta 1950-70'lerde radyoaktif izleyiciler (⁵⁹Fe ve ⁵⁵Fe) kullanılarak karakterize edildi. Bu çalışmalar, plasenta boyunca demir taşınmasının tek yönlü 14,15 olduğunu ve diferrik transferrinin plasenta ve fetüs ^16,17 için önemli bir demir kaynağı olduğunu belirlemiştir. Plasental demir taşımacılığının mevcut anlayışı daha eksiksizdir, ancak bazı önemli demir taşıyıcıları ve düzenleyici mekanizmalar bilinmemektedir. Fare modelleri, demir regülasyonu ve nakliyesini anlamak için çok önemlidir¹⁸, çünkü kilit taşıyıcılar ve mekanizmalar oldukça benzerdir. Hem insan hem de fare plasentası hemokoriyaldir, yani maternal kan fetal koryon¹⁹ ile doğrudan temas halindedir. Bununla birlikte, bazı dikkate değer yapısal farklılıklar vardır.

Sinsitiyotrofoblast, maternal ve fetal dolaşımı ayıran ve aktif olarak demir ve diğer besin maddelerini taşıyan plasental hücre tabakasıdır²⁰. İnsanlarda, sinsitiyotrofoblast, kaynaşmış hücrelerin tek bir tabakasıdır. Buna karşılık, fare plasentası iki sinsitiyotrofoblast katmanı²¹, Syn-I ve Syn-II'den oluşur. Bununla birlikte, Syn-I ve Syn-II'nin arayüzündeki boşluk kavşakları, besinlerin^22,23 katmanları arasında difüzyonuna izin verir. Böylece, bu katmanlar insan sinsitiyotrofoblastına benzer tek bir sinsitial tabaka olarak işlev görür. İnsan ve fare plasentası arasındaki ek benzerlikler ve farklılıklar Rossant ve Cross²¹ tarafından gözden geçirilmiştir. Plasental demir transportu, demir-Tf'nin maternal kandan sinsitiyotrofoblast^24'ün apikal tarafında lokalize olan transferrin reseptörüne (TfR1) bağlanmasıyla tetiklenir. Bu etkileşim, klatrin aracılı endositoz²⁵ yoluyla demir-Tf / TfR1 içselleşmesini indükler. Demir daha sonra asidik endozom^26'daki Tf'den salınır, belirlenemeyen bir ferriredüktaz tarafından demirli demire indirgenir ve endozomdan henüz belirlenmemiş bir taşıyıcı tarafından sitoplazmaya ihraç edilir. Demirin sinsitiyotrofoblast içinde nasıl chaperonize edildiği de açıklanmaya devam etmektedir. Demir sonunda demir ihracatçısı FPN tarafından fetal tarafa taşınır, sinsitiyotrofoblastın bazal veya fetale bakan yüzeyinde lokalize edilir (^27'de gözden geçirilmiştir).

TfR1, FPN ve hepcidinin fizyolojik ve patolojik regülasyonunun plasental demir taşınımını nasıl etkilediğini anlamak için, maternal dolaşımdan plasentaya ve embriyoya demir taşınımını in vivo^4'e arttırmak için stabil demir izotopları kullanılmıştır. Bu yazıda gebe farelere izotopik demir transferrin hazırlanması ve uygulanması, ICP-MS için dokuların işlenmesi ve dokulardaki demir konsantrasyonlarının hesaplanması için yöntemler sunulmaktadır. İn vivo stabil demir izotoplarının kullanımı, fizyolojik ve patolojik demir regülasyonunu araştırmak için farklı hayvan modellerinde demir regülasyonunu ve dağılımını araştırmak için uyarlanabilir.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri ve deneysel prosedürler, Kaliforniya Üniversitesi Los Angeles Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. ⁵⁸Fe-Tf'nin hazırlanması

NOT: Protokol ⁵⁸Fe kullanır; ancak, ⁵⁷Fe için aynı protokol kullanılabilir. Her iki izotop da ek önlemler alınmadan standart bir demir kimyasalı olarak kullanılabilir ve bertaraf edilebilir.

1. ⁵⁸Fe'yi 12 N HCl'de 50 μL HCl / mg ⁵⁸Fe'de çözün.
   1. HCl'yi satıcı tarafından sağlanan cam şişedeki metale ekleyin ve kapağı gevşek bir şekilde değiştirin. Demiri çözmek için, ⁵⁸Fe / HCl çözeltisini 1 saat boyunca 60 ° C'ye ısıtın. Hala çözülmemişse, çözeltiyi çözülmesi için gece boyunca oda sıcaklığında duman davlumbazında bırakın.
      NOT: Çözünmüş ⁵⁸Fe/HCl çözeltisi sarımsı-turuncu renktedir.
      Fe₃O 4(_ler) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl _3(aq) + 4H ₂ O
2. Fe^(III)Cl 2 çözeltisini üretmek için kalan Fe(II⁾Cl_3'ü oksitleyin.
   1. Oksidasyonu kolaylaştırmak için ⁵⁸Fe/HCl çözeltisini kapak kapalıyken 60 °C'ye ısıtın.
   2. Oksidasyonu daha da kolaylaştırmak için 50 μL 58 Fe/HCl çözeltisi başına 1 μL %³⁵_{H 2}O₂ ekleyin.
      Fe(^II)Cl_2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(^III)Cl_3(aq) + 2H₂ O
3. Ferrik klorür (⁵⁸Fe(III)Cl₃⁾ çözeltisini hazırlayın.
   1. Ferrik klorür çözeltisini, numuneyi buharlaştırmak için kapağı kapalı olarak 60 °C'de davlumbazda bırakın.
      NOT: Buharlaşma bir ila birkaç gün sürebilir.
   2. ⁵⁸Fe(^III)Cl_3'ü ultra saf H2 O ile 100 mM'ye yeniden oluşturun ve adım 1.1'de kullanılan ilk metal ağırlığına göre gereken ultra saf H2 O miktarını hesaplayın (⁵⁸Fe(^III)Cl_3'ün moleküler ağırlığı 162.2'dir).
4. ⁵⁸Fe ^(III) -nitrilotriasetat (NTA), 20 mM NaHCO 3 varlığında 1:5 molar oranında NTA ile ⁵⁸Fe ^(III) Cl_3'ü inkübe ederek hazırlayın.
   1. 1 N NaOH'de 500 mM NTA hazırlayın.
   2. 5x transferrin yükleme tamponu hazırlayın (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
   3. Ultra saf_H2O'da 1 M NaHCO₃ hazırlayın.
   4. 15 mL'lik bir konik tüpe 150 μL 100 mM 58 Fe(^III)Cl 3 çözeltisi (adım 1.3.2'den), 1 N NaOH'da hazırlanan 150 μL 500 mM NTA, 480 μL ultrasaf H₂O, 200 μL ^5xtransferrin yükleme tamponu ve 20 μL 1 M NaHCO₃ çözeltisi ekleyin.
   5. Karışımı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
5. ⁵⁸Fe-Tf oluşturmak için apo-Tf'yi ⁵⁸Fe^(III)-NTA ile yükleyin.
   NOT: Bu protokol McCarthy ve Kosman^28'den uyarlanmıştır.
   1. 500 mg apo-Tf'yi 4 mL 1x Tf yükleme tamponunda çözün.
   2. Adım 1.4.4'te 58 Fe^(III)-NTA çözeltisinin 1 mL'sini içeren ¹⁵mL konik tüpe 4 mL apo-Tf çözeltisi ekleyin.
      NOT: Bu, apo-Tf ile ⁵⁸Fe-NTA'nın 3: 1 molar oranıdır. Her Tf 2 Fe bağlama bölgesi içerir; Tf'nin tamamen yüklendiğinden emin olmak için fazla ⁵⁸Fe-NTA eklendi.
   3. ⁵⁸Fe-NTA'nın apo-Tf üzerine maksimum yüklenmesine izin vermek için, çözeltinin pH 7.5'te olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse pH'ı NaHCO₃ veya HCl ile ayarlayın.
   4. Oda sıcaklığında 2,5 saat inkübe edin.
6. Fazla bağlanmamış ⁵⁸Fe(III)-NTA'yı çıkarın ve ^NTA'yı serbest bırakın.
   1. ⁵⁸Fe-Tf çözeltisini moleküler ağırlıklı bir kesme kolonuna (30 kDa kesme) aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2.500 × g'da santrifüj yapın.
   2. Kolonu 10 mL 1x transferrin yükleme tamponu ile yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2.500 × g'da santrifüj yapın. Yıkama ve santrifüjlemeyi tekrarlayın, 10 mL tuzlu su ile tuzlu su yıkama yapın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2.500 × g'da santrifüj yapın.
7. ⁵⁸Fe-Tf konsantrasyonunu hesaplayın.
   NOT: Adım 1.5.2'de fazla ⁵⁸Fe eklenmesi nedeniyle, tüm transferrinlerin diferrik olduğunu varsayalım. 500 mg apo-Tf kullanıldığından, adım 1.5.4'te ~ 500 mg ⁵⁸Fe-Tf üretildi.
   1. Adım 1.6.2'de tuzlu su yıkamadan sonra santrifüjlemeden geri kazanılan hacmi ölçün.
   2. 58 Fe-Tf çözeltisinin konsantrasyonunu (mg / mL cinsinden) belirlemek için ⁵⁰⁰mg'ı geri kazanılan hacme bölün.
8. ⁵⁸Fe-Tf çözeltisini 0,22 μm şırınga filtresi kullanarak sterilize edin; kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
   NOT: ⁵⁸Fe-Tf çözeltisi hazırlıktan 1 ila 4 hafta sonra kullanılmıştır.

2. Zamanlanmış fare gebeliklerini ayarlama

1. 6 ila 8 haftalık dişi fareler kullanın. Çiftleşmeden önce hayvanları 2 hafta boyunca düşük demirli bir diyete (4 ppm demir) veya standart chow'a (185 ppm demir) yerleştirin ve hamilelik boyunca hayvanları ilgili diyetlerde tutun.
2. Seçenek 01: E7.5'te kilo alımı ile hamileliği onaylayın.
   1. Birden fazla üreme kafesi kurun. Her kafes için, 2 dişiyi gece boyunca 1 erkekle birleştirin; hayvanların ayrıldığı ertesi gün embriyonik gün (E)0.5 olarak kabul edilir. Hamile olup olmadığını belirlemek için kadınları E7.5'te tartın. Erkekleri kilo almayan dişilerle tekrar eşleştirin.
      NOT: WT C57BL/6'da, E7.5'te 1 g'lık bir kilo alımı gebeliğin iyi bir göstergesidir. Bu yöntem, implantasyonun belirli bir 16 saatlik zaman dilimi içinde gerçekleşmesini sağlar ve aynı çiftleşme döneminde hamile kalan tüm hayvanların senkron tedavisine izin verir.
3. Seçenek 02: Fiş kontrolleri ile hamileliği onaylayın.
   1. 2 dişi 1 erkekle birleştirin ve çiftleşmenin gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için günlük fiş kontrolleri yapın.
      NOT: Bu yöntem kademeli gebeliklere neden olabilir ve bir tıkaçların varlığı hamileliği garanti etmez.

3. ⁵⁸Fe-Tf'yi intravenöz olarak E17.5 hamile farelere uygulayın

1. Enjeksiyon için adım ^{1.8'den 58}Fe-Tf hazırlayın.
   1. Tuzlu ^{suda 35}mg / mL'de 58 Fe-Tf çözeltisi hazırlayın; fare başına 100 μL enjekte edin.
   2. Bir insülin şırıngasını ⁵⁸Fe-Tf çözeltisinin 100 μL'si ile doldurun.
      NOT: Her doz 3.5 mg insan 58 Fe-Tf (5 μg ⁵⁸Fe) içerir.
2. İzofluran kullanarak hamile bir fareyi anestezi altına alın.
   1. Odacıklı bir izofluran regülatörü kullanın.
   2. Aşağıdaki ayarları kullanın: %5 izofluran, 2 L/mL_O2, 2 dk.
   3. Bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermemeye bakarak farenin uyuşturulduğunu onaylayın.
   4. Göz yağlayıcısını gözün yüzeyine uygulayın ve fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin.
3. ⁵⁸Fe-Tf çözeltisini retro-orbital sinüse yavaşça ve dikkatlice enjekte edin.
4. Farenin anesteziden kurtulmasına izin verin; Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
5. Enjeksiyondan altı saat sonra, E17.5 hamile kadınları izofluran doz aşımı ile ötenazileştirin.
   1. Fareyi ikincil ötenazinin bir şekli olarak exsanguinate etmek için bir kardiyak ponksiyon gerçekleştirin.
   2. Stabilizasyon için ayakları iğnelerle sabitleyin.
6. Plasenta ve embriyo karaciğerlerini toplayın.
   1. Steril forseps ve diseksiyon makası kullanarak, uterusu hamile fareden dikkatlice çıkarın. Rahim bir kısmı ile çevrili amniyotik kesede tek bir fetüs ve plasenta içeren bir plasental fetal-plasental üniteyi kesin.
   2. Fetusu ve plasentayı rahatsız etmeden uterus ve amniyotik keseyi dikkatlice kesin.
   3. Amniyotik kesesi geri soyun ve fetüsü ve plasentayı çıkarın.
   4. Göbek kordonunu kesin.
   5. Fazla amniyotik sıvıyı çıkarmak için fetüsü ve plasentayı temiz bir görev mendiliyle lekeleyin.
   6. Tüm plasentaların ağırlıklarını kaydedin.
   7. Her plasentayı bir tıraş bıçağı ile ikiye bölün, her yarısını 2.0 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve sıvı azotta dondurun.
      NOT: 58 Fe özel elleçleme önlemleri ve bertaraf gerektirmediğinden, plasentanın yarısı ⁵⁸Fe ölçümü için, diğer yarısı ise batı lekelenmesi ve qPCR ile transferrin reseptörü (TFR1) ve ferroportin (FPN) ekspresyonunun kantitasyonu da dahil olmak üzere diğer analizler için kullanılabilir.
   8. Embriyo karaciğerlerini toplamak için embriyoyu feda edin: embriyonun başını hızla kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.
      NOT: E17.5'te, uterustaki tüm embriyolar, çalışmada kullanılmasalar bile, ayrı ayrı ötenazi yapılmalıdır.
   9. Stabilizasyon için embriyoyu sabitleyin ve karnı açıkta bırakın.
   10. Diseksiyon makası kullanarak, göbek kordonunun takılı olduğu yerde küçük bir kesi yapın, diseksiyon makasının bir ucunu insizyona yerleştirin ve koronal düzleme doğru yaklaşık 1/4 inç kesilmiş bir medyan düzlem yapın. Ardından, fetal karaciğeri açığa çıkarmak için enine düzlem kesimleri yapın.
   11. Fetal karaciğeri çıkarmak için forseps kullanın.
   12. Tüm embriyo karaciğerlerinin ağırlıklarını kaydedin.
   13. Tüm embriyo karaciğerlerini 2 mL tüplere yerleştirin ve sıvı azot içinde çırpınarak dondurun.
       NOT: Alternatif olarak, ek analizler isteniyorsa, embriyo karaciğerinin sadece bir kısmı ⁵⁸Fe ölçümü için kullanılabilir. 2,0 mL tüplerin kullanılması, 1,5 mL tüplerden daha iyi doku homojenizasyonu sağlar.
7. Dokuları süresiz olarak -80 °C'de saklayın.

4. ICP-MS ile kantitatif demir analizi için proses dokuları

1. Nonheme demirin kantitasyonu için plasenta ve fetal karaciğerleri işleyin.
   1. Plasental yarıları ve tüm fetal karaciğerleri çözün ve plasenta yarısını tartın (fetal karaciğer ağırlıklarını kaydetmek için adım 3.6.12'ye bakınız).
   2. 400 μL protein çökeltme çözeltisi ekleyin (0.53 N HCl,% 5.3 TCA).
   3. Elektrikli homojenizatör kullanarak dokuyu homojenize edin.
   4. Numuneleri 1 saat boyunca 100 °C'de inkübe edin.
   5. Numuneleri oda sıcaklığında suda 2 dakika soğutun.
   6. Basıncı serbest bırakmak için kapakları açın, ardından tüpleri tekrar kapatın.
   7. Pelet dokusu kalıntılarına oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 17.000 × g'da santrifüj.
   8. Süpernatantı dikkatlice yeni etiketli bir tüpe aktarın.
   9. ICP-MS analizi için örnekleri gönderin.
2. Heme-demirin kantitasyonu için plasenta ve fetal karaciğerleri işleyin.
   NOT: Adım 1'de nonheme demirin ekstraksiyonunu takiben, pelet içinde kalan demir ağırlıklı olarak heme'dir.
   1. Adım 4.1.7'deki her peletin ağırlığını kaydedin.
   2. Peletleri 10 mL konsantre p HNO₃ içinde sindirin ve 1 mL'lik 0 H_2O2 ile desteklenin.
      NOT: Belirli çalışmalar için HNO₃ hacmini optimize etmek üzere ICP-MS çekirdeğine veya merkezine danışın; hacim kısmen numune ağırlığına bağlı olacaktır.
   3. Numuneleri 15 dakika boyunca 200 °C'ye ısıtın.
   4. ICP-MS analizi için örnekleri gönderin.
      NOT: Heme ve nonheme demir kaynakları arasında ayrım yapmak gerekli değilse ve sadece toplam demir ölçülüyorsa, ilk adım olarak HNO_3'te tüm doku sindirilebilir.

5. Veri analizi

NOT: ICP-MS'den elde edilen veriler ng/mL veya mg, ppb cinsinden ⁵⁶Fe ve ⁵⁸Fe konsantrasyonları olarak sağlanmıştır (Tablo 1). ⁵⁶ adet Fe, doğada en bol bulunan demir izotopudur ve ölçümü, tüm hamilelik boyunca plasenta / embriyodaki demir birikimini yansıtırken, ⁵⁸Fe ölçümü, enjeksiyondan sonraki 6 saat boyunca transfer edilen demiri yansıtır.

1. Ölçülen 58 Fe değerinden ⁵⁸Fe'lik doğal bolluğu (toplam Fe'nin% 0.28'i) çıkarın.
2. Toplam nonheme ⁵⁸Fe hesaplayın.
   1. Toplam ⁵⁸Fe'yi tahmin etmek için adım 5.1'de hesaplanan demir konsantrasyonunu (ng / mL) adım 4.1.2'deki ilk işlem sırasında hacim (mL) ile çarparak embriyo karaciğeri toplam nonheme demiri (ng) hesaplayın.
   2. Adım 3.6.6'da ölçülen plasentanın toplam ağırlığını alarak ve adım 4.1.1'de işlenen plasentanın ağırlığına bölerek tüm plasentadaki demir miktarını hesaplayın. Plasentanın toplam nonheme ⁵⁸Fe içeriğini elde etmek için bu değeri adım 5.2.1'de hesaplanan toplam nonheme demir (ng) ile çarpın.
3. Toplam heme ⁵⁸Fe hesaplayın.
   1. İlk önce adım 5.1'de hesaplanan demir konsantrasyonunu (ng / mg) adım 4.2.1'de ölçülen peletin ağırlığı (mg cinsinden) ile çarparak toplam heme ⁵⁸Fe'yi hesaplayın.
   2. Ardından, adım 3.5.1'de ölçülen plasentanın toplam ağırlığını, adım 4.2.1'de ölçülen plasenta peletinin ağırlığına bölün. Plasentanın toplam heme ⁵⁸Fe içeriğini elde etmek için bu değeri adım 5.3.1'de hesaplanan toplam heme demir (ng) ile çarpın.
4. Her doku için toplam demir içeriğini belirlemek için hesaplanan nonheme ve heme ⁵⁸Fe değerlerini toplayın.

Şekil 1: Protokoldeki adımların görsel özeti. (A) ⁵⁸Fe-transferrin'in hazırlanması. (B) ⁵⁸Fe-transferrinin in vivo uygulaması. (C) Doku toplanması ve depolanması. (D) ICP-MS tarafından metal türlerinin kantitasyonu için plasenta ve embriyo karaciğerinin işlenmesi. Kısaltmalar: Fe = demir; NTA = nitrilotriasetik asit; Tf = transferrin; PPS = protein çökeltme çözeltisi; Sup = süpernatant; TCA = trikloroasetik asit; ICP-MS = endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Demir taşınımını ölçmek için stabil demir izotopları kullanan daha önceki bir çalışma, maternal demir eksikliğinin plasenta demir ihracatçısı FPN^4'ün aşağı regülasyonuna neden olduğunu göstermiştir. FPN, bilinen tek memeli demir ihracatçısıdır ve gelişim sırasında FPN'nin yokluğu, E9.5^29'dan önce embriyonik ölümle sonuçlanır. FPN ekspresyonunda gözlenen azalmanın fonksiyonel olarak azalmış plasental demir transportuna çevrilip çevrilmediğini belirlemek için, ⁵⁸Fe...

Tartışma

Demir birçok biyolojik süreç için önemlidir ve vücuttaki hareketi ve dağılımı oldukça dinamik ve düzenlenmiştir. Kararlı demir izotopları, demir homeostazının dinamiklerinin değerlendirilmesi için radyoaktif izotoplara tutarlı ve uygun bir alternatif sağlar. Protokoldeki kritik bir adım, tüm doku ağırlıklarını ve hacimlerini takip etmektir. Demir bir elementtir ve bu nedenle sentezlenemez veya parçalanamaz. Böylece, tüm ağırlıklar ve hacimler dikkatlice günlüğe kaydedilirse, sistem içindeki tüm demirler hesaplama ile hes...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
58Fe-demir metal	Trace Sciences International	Fe-58
Amicon ultra-15 santrifüj filtre, 30 kDa kesme	Millipore Sigma	UFC903024
Santrifüj tüpleri, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-49B
Santrifüj tüpleri, 50 mL	Milipore Sigma	CLS430829
Santrifüj, Sorvall Legend Micro 17 Mikrosantrifüj	Fisher Scientific	75002432
Santrifüj, Sorvall Legend RT
Hassas görev silecekleri	Fisher Scientific	06-666
Diyet: demir eksikliği olan (4 ppm demir)	Envigo Teklad	TD.80396
Diyet: standart chow (185 ppm demir)	PicoLab	5053
30 mm kesme kenarlı	diseksiyon makasıVWR	25870-002
Forseps 4-1 / 2 inç uzunluk	McKesson	157-469
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Homojenizatör, Bio-Gen PRO200	PROScientific	01-01200
İnsan apo-transferrin (apo-Tf)	Celliance	4452-01	artık mevcut değil, alternatif: Millipore 616419
Hidroklorik asit (HCl	Fisher Scientific	A144S-500
Hidrojen peroksit (H2O2), suda ağırlıkça %35 çözelti	Cole-Parmer	EW-88216-36
İnsülin Şırıngaları, BD Lo-Dose U-100	Fisher Scientific	14-826-79
Isofluran	VETone	502017
Isofluran vaporizor	Summit Anestezi Solüsyonları
Metal ısı bloğu	Fisher Scientific Düz
vidalı kapaklı mikro santrifüj tüpü	VWR	16466-064
Mikrosantrifüj tüpleri 1.5 mL düşük retansiyonlu	Fisher Scientific	02-681-320
Mikrosantrifüj tüpleri 2.0 mL düşük retansiyonlu	Fisher Scientific	02-681-321
Millex-GP şırınga filtre ünitesi, 0.22 & m, polietersülfon, 33 mm, gama ile sterilize	edilmiş Millipore Sigma	SLGP033RS
Nitrilotriasetik asit (NTA)	Sigma	72560-100G
İğne 25 G x 5/8 inç hipodermik genel kullanım	Fisher Scientific	14-826AA
pH Şeritleri, plastik pH5.0-9.0	Fisher Scientific	13-640-519
Tıraş bıçağı 0,22 mm	VWR	55411-050
Ölçek (g)	Mettler Toledo	PB1502-S
Ölçek (mg)	Mettler Toledo	Balance XS204
Sodyum bikarbonat (NaHCO3)	Sigma	S5761-500G
Sodyum klorür (NaCl)	Fisher Scientific	S671-3
Sodyum hidroksit (NaOH)	Fisher Scientific	SS266-1
Steril şırınga, kayma ucu (1 mL)	Fisher Scientific	309659
Trikloroasetik asit (TCA)	Fisher Scientific	A322-500
Yazılım
ImageLab	Bio-Rad
SigmaPlot	Systat