Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Amerikan Hamamböceğinde RNA Girişiminin Uygulamaları

2.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63380

⸱

17 Aralık 2021

 ,  ,  ,  , 
1Guangdong Provincial Key Laboratory of Insect Developmental Biology and Applied Technology, Institute of Insect Science and Technology & School of Life Sciences, South China Normal University, 2Guangmeiyuan R&D Center, Guangdong Provincial Key Laboratory of Insect Developmental Biology and Applied Technology, South China Normal University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, P. americana'daki RNAi operasyon teknikleri için adım adım kılavuzları açıklamaktadır.

Özet

Sıhhi bir haşere olan hamamböceği, kolay beslenme ve hemimetabolöz özellikleri nedeniyle böcek gelişimsel ve metamorfik çalışmalarında vazgeçilmez türlerdir. İyi açıklamalı genom dizileri ile birlikte, bu avantajlar Amerikan hamamböceği, Periplaneta americana'yı önemli bir hemimetabolöz böcek modeli haline getirmiştir. Nakavt stratejisinin yetersizliği ile sınırlı olarak, etkili RNA girişimi (RNAi) tabanlı gen nakavtı, P. americana'nın fonksiyonel gen araştırmalarında vazgeçilmez bir teknik haline gelir. Mevcut protokol P. americana'daki RNAi operasyon tekniklerini açıklamaktadır. Protokol, (1) uygun gelişim aşamalarında P . americana'nın seçimini, (2) enjeksiyon ayarına hazırlık, (3) dsRNA enjeksiyonu ve (4) gen nakavt verimliliği tespitini içerir. RNAi, P. americana'da güçlü bir ters genetik araçtır. P. americana dokularının çoğunluğu hücre dışı dsRNA'ya duyarlıdır. Sadeliği, araştırmacıların bir veya daha fazla hedefleme dsRNA enjeksiyonu altında işlevsiz fenotipleri hızlı bir şekilde elde etmelerini sağlayarak araştırmacıların gelişimsel ve metamorfik çalışmalar için P. americana'yı daha iyi kullanmalarını sağlar.

Giriş

Evrimsel olarak korunmuş bir mekanizma olan RNA girişimi (RNAi), Andrew Fire ve Craig Mello2'nin çift sarmallı RNA (dsRNA) aracılı gen sessizliği stratejisini geliştirmesinden bu yana, yavaş yavaş birçok organizmada gen ekspresyonunu inhibe etmek için gerekli bir ters-genetik araç haline gelir1. dsRNA, RNAi yolunu aktive etmek için hücrelerdeki Dicer enzimi tarafından 21-23 nükleotid, küçük müdahale eden RNA'lar (siRNA'lar) fragmanlarına bölünür. Daha sonra siRNA'lar, hedef mRNA ile çiftleşen, mRNA bölünmesine neden olan ve son olarakgen fonksiyonunun 3,4,5 kaybına neden olan RNA kaynaklı susturma kompleksine (RISC) dahil edilir. Böcek türleri arasında, şimdiye kadar Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera ve Blattodea 5,6,7,8 gibi birçok sistemik RNAi deneyi bildirilmiştir.

Hamamböceği (Blattaria), hızlı büyüme döngüleri, çevreye güçlü adaptasyonu ve yüksek gelişimsel plastisitesi9 ile gelişimsel ve metamorfik çalışmalarda önemli bir böcek ailesidir. RNAi'nin hamamböceği ile uyumlu olduğunu keşfetmeden önce, önceki araştırmalar hamamböceklerinde genetik manipülasyon tekniklerinin azlığı nedeniyle sadece hamamböceği önleme ve kontrolüne odaklandı. Hamamböceği ootheca'nın eşsiz yapısı, CRISPR-Cas9 sistemi ile embriyo enjeksiyonuna dayalı gen nakavtını gerçekleştirmeyi zorlaştırdı. Ayrıca, hamamböceklerindeki çoğu doku (P. americana gibi) sağlam sistemik RNAi yanıtı gösterir ve bir veya daha fazla dsRNA'yı 9,10,11 hedefleyerek disfonksiyonel fenotiplerin hızlı bir şekilde üretilmesine izin verir. Bu özellikler RNAi'yi P. americana'daki gen fonksiyonel araştırmalarında vazgeçilmez bir teknik haline getirdi.

RNAi'nin P. americana'daki fonksiyonel gen araştırmalarında kullanımı bildirilmiş olmasına rağmen, ayrıntılı veya adım adım bir açıklama mevcut değildi . Bu rapor, P. americana'daki RNAi için diğer hamamböceklerinde gen fonksiyonu çalışması için yararlı olan adım adım operasyonel bir kılavuz sunmaktadır. Ayrıca, bu kılavuz Blattodea ile sınırlı değildir ve küçük değişikliklerle diğer birçok böceğe uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

P. americana çizgisi başlangıçta Dr. Huiling Hao tarafından sağlandı. Bu tür 30 yıldır akrabalık ile korunmaktadır9.

1. P. americana'nın kuluçkalanması ve beslenmesi

  1. P. americana'nın taze oothecae'sini (yumurtlamadan hemen sonra) toplayın ve karanlık inkübatörde 25 ° C'de ve% 60 nemde ~ 25 gün boyunca inkübe edin . Daha sonra sıcaklığı ve nemi 30 ° C'ye ve% 75'e yumurtadan çıkmadan 3 gün önce artırın.
  2. Taranmış nimfleri oothecae'den ayırmak için 4 mm diyaframlı bir elek kullanın.
  3. Perileri silindirik kaplarda (12 cm çapında ve 10 cm yüksekliğinde) karanlıkta 28 °C, % 70 nemde tutun. Hamamböceklerinin kaçmasını önlemek için kapların iç kenarını vazelin ile fırçalayın. Sıçan yemeği, su ve barınak (yumurta tepsileri) sağlayın. Perileri aktivitesine dikkat edin ve dışkı ve kalıntıları düzenli olarak temizleyin.

2. Uygun instardaki nimflerin seçimi

  1. Taze erimiş P. americana'yı (gövde renginde beyaz) seçmek için bir cam tüp kullanın . Onları yeni kaplarda saklayın ve tedavi için doğru aşamayı bekleyin.
    NOT: Yukarıdaki besleme koşulları altında ~ 19 gün sonra, 3. instardaki nimfler enjeksiyon için hazır olacaktır. Taze erimiş hamamböceklerinin rengi beyazdır ve instarlar erime süreleri ile açıklığa kavuşturulur.

3. Hedef parçanın T7 promotörleri ile hazırlanması

  1. P. americana'nın cDNA'sını şablon olarak kullanarak, hedef gen9'un 300-800 bp DNA fragmanını elde etmek için PCR gerçekleştirmek üzere eşleştirilmiş primerler tasarlayın. Ardından, sıralama için PCR parçasını bir pTOPO vektörüne klonlayın (bkz.
  2. Hedef parça DNA'sını şablon olarak kullanarak, 5' terminallerinde T7 promotör dizisine (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') sahip yeni bir çift primer sentezleyin ve her iki taraftaT7 promotörleri 9 ile hedef parçayı elde etmek için başka bir PCR turu gerçekleştirin.

4. İn vitro dsRNA'nın transkripsiyonu ve sentezi

  1. Reaksiyon sistemine 10 μL T7 2X Tampon, 2 μL Enzim Karışımı, T7 Express (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 2 μg PCR ürünü (adım 3.2'de elde edilen) ekleyin ve ddH 2 O ile toplam hacmi20μL'ye toplayın. ve sonra yavaşça oda sıcaklığına soğutun.
  2. RNaz A çözeltisini (4 μg/μL) ddH 2 O ile 1:200oranında seyreltin. Daha sonra sisteme 1 μL RQ1 RNase İçermeyen DNaz (1 U/μL) ve 1 μL seyreltilmiş RNase A çözeltisi ekleyin (bkz.
    NOT: Şimdi, tek bir sistemin hacmi 22 μL'dir.
  3. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra toplam hacmin% 10'unu (aynı anda N reaksiyonları gerçekleştirirken, toplam hacim N x 22 μL'dir) Sodyum asetat ve toplam izopropanol hacminin üç hacmini ekleyin.
  4. Manuel olarak yavaşça baş aşağı karıştırın, 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın.
  5. Süpernatantı bir pipetle çıkarın, kalıntıyı% 75 etanol (% 25 dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış su ile) yıkayın ve ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın.
  6. Supernatant'ı tekrar kaldırın. Peleti oda sıcaklığında 15 dakika boyunca hava ile kurulayın. DsRNA'yı çözmek için ~ 100 μL DEPC suyu kullanın, ardından dsRNA'yı son 2 μg / μL'ye kadar seyreltin.
    NOT: dsRNA 6 ay boyunca -80 °C'de saklanabilir.

5. dsRNA çözeltisinin şırıngaya yüklenmesi

  1. Her enjeksiyonun hacminin tutarlı olmasını sağlamak için programı mikro enjeksiyon pompasında önceden ayarlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Şırıngayı kullanmadan önce, şırıngayı 8-10 kez DEPC suyuyla doldurarak temizleyin.
  2. 10 μL Şırıngayı mikro-enjeksiyon pompasına takın, pompayı çalıştırın ve şırıngayı 10 μL dsRNA çözeltisi ile doldurun (adım 4.6'da hazırlanır). DsRNA'nın 1 μL'sini 3. instar perisine enjekte edin (bkz. adım 2) ve vücuda sızmadığından emin olun.

6. P. americana'ya dsRNA enjekte etmek

  1. Hamamböcekleri, hamamböceği artık hareket etmeyene kadar bir kapta artan bir CO2 konsantrasyonu ile uyuşturun ve hemen enjeksiyonla devam edin.
  2. Hamamböceğini cımbızla yavaşça alın ve hamamböceğini iğneye doğru elinizle teslim edin. Daha sonra , iğneyi epidermise karşı yatay olarak iki karın somiti arasındaki boşluktan yerleştirin. Kesici uç derinliği hakkında, sığ, daha iyi.
  3. Ardından, dsRNA çözeltisini hamamböceğine enjekte edin. Son olarak, iğne ucunu çekin. İç organlara zarar vermemek için iğne ucunun epidermise mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olun.
    NOT: Enjeksiyon diseksiyon mikroskobu altında yapılmalıdır.
  4. Enjekte edilen hamamböceklerini temiz biyotahlil kaplarına koyun. CO 2 etkilerinden kurtulmalarına izin vermek için yaklaşık10-20 dakika bekleyin. Kapları enjeksiyon tarihi, dsRNA'nın tipi ve dozu ve P. americana'nın yaşı ile etiketleyin.
  5. Enjekte edilen hamamböceklerini karanlık bir ortama 28 ° C'de,% 70 nemde yerleştirin, su, yem ve barınak sağlayın ve hamamböceği fenotipindeki olası değişiklikleri düzenli olarak gözlemleyin.

7. Nakavt onayı ve fenotipik analiz

  1. RNAi'nin verimliliğini, kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) ve Batı lekelemesi gibi mevcut moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak değerlendirin. Ayrıntılı qRT-PCR ve Western blotlama prosedürleri için bkz: Referanslar 1,12.
  2. RNAi ile ilişkili fenotipleri gözlemlemek ve analiz etmek için, canlı hayvanlar için uygun mikroskobu kullanın.
    NOT: RNAi, hamamböceklerinin morfolojisini, davranışını, erimesini, uzuv rejenerasyonunu ve diğer fizyolojik aktivitelerini etkileyebilir. Fenotipin spesifik frekansı, spesifik koşullara göre hesaplanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1'de başarılı bir enjeksiyon görülmektedir. Mikro çaplı iğneli mikroenjeksiyon şırıngası, güçlendirici üzerine yatay olarak yerleştirilmelidir (Şekil 1A). İğne, epidermise karşı yatay olarak iki abdominal somit arasındaki boşluktan yerleştirilir (Şekil 1B). Sıvının P. americana karnına girdiğinden emin olun. İğnenin çok dik açısı iç organlara zarar verir (Şekil 1C) ve yanlış enje...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu rapor, P. americana'da metodolojik bir adım adım RNAi stratejisini tanımladı; Not olarak, diğer hamamböceklerine (örneğin Blattella germanica ) ve küçük değişikliklerle diğer birçok böceğe de uygulanabilir. Bununla birlikte, RNAi'nin gen susturma etkinliği her zaman yeterince yüksek değildir, gen nakavt stratejisi13 ile karşılaştırıldığında belirgin bir dezavantaj vardır. Gen seviyesinin aşağıdaki kalıntı etkisi, gerçek fenotiplere müdahale edebilir. RNAi tedavisinin başarılı ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32070500, 31620103917, 31330072 ve C.R., Sh.L.'ye 31572325), Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 2021B1515020044 ve 2020A1515011267 C.R.), Guangdong Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bölümü (Hibe No. 2019B090905003 ve 2019A0102006), Guangzhou'daki Bilim ve Teknoloji Bölümü (Hibe No. 202102020110), Shenzhen Bilim ve Teknoloji Programı tarafından (Hibe No. KQTD20180411143628272 için Sh.L.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
701 N 10 ve mikro; L Syr (26s / 51/2)HamiltonPN: 80300Enjeksiyon
İnkübatörüNingbo Jiangnan Enstrüman FabrikasıRXZ-380A-LEDHamamböceği kuluçka ve besleme için
Mikro enjeksiyon pompasıAlcott BiotechnologyALC-IP600Enjeksiyon
pTOPO-Künt Klonlama Kitiiçin AidlabBiyoteknolojiCV16
Bio-RadCFX ConnectqRT-PCR analizi için
T7 RiboMAX Express RNAi SistemiPromegaP1700Rnase A Çözeltisi (4 & mu; g/μ L), Sodyum Asetat, 3.0M (pH 5.2), Enzim Karışımı, T7 Ekspres, Nükleaz İçermeyen su, Express T7 2x Tampon, RQ1 RNaz İçermeyen DNaz
Termal DöngüleyicilerDNA amplifikasyonu içinBio-RadS1000
Gen uzatma kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Sistemleri

Kaynaklar

  1. Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
  4. Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
  5. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
  6. French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).
  7. Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).
  8. Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
  9. Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).
  10. Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
  11. Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163(2011).
  12. Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
  13. Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
  14. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  15. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
  16. Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
  17. Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
  18. Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
  19. Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778(2020).
  20. Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
  21. Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Gen NakavtdsRNA EnjeksiyonuHemimetabol B ceklerFonksiyonel Gen Ara t rmasUzuv RejenerasyonuqRT PCRTers GenetikGeli im Biyolojisi
Amerikan Hamamböceğinde RNA Girişiminin Uygulamaları
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.