Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı
Bu makalede
Özet
Özet
Hem enstrümantasyon hem de görüntü işleme yazılımındaki son gelişmeler, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobunu (kriyo-EM), yapısal biyologların çok çeşitli makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarını belirlemek için tercih ettikleri yöntem haline getirmiştir. Görüntü işleme ve yapı hesaplaması için yeni ve uzman kullanıcılar tarafından aynı temel iş akışını kolaylaştıran birden fazla yazılım paketi mevcuttur: mikroskop dedektörleri tarafından edinilen filmler, ışın kaynaklı hareket ve kontrast aktarım fonksiyonu (CTF) tahmini için düzeltmeye tabi tutulur. Daha sonra, parçacık görüntüleri yinelemeli 2B ve 3B sınıflandırma için ortalama film karelerinden seçilir ve ayıklanır, ardından 3B yeniden yapılandırma, iyileştirme ve doğrulama yapılır. Çeşitli yazılım paketleri farklı algoritmalar kullandığından ve çalışmak için farklı uzmanlık seviyeleri gerektirdiğinden, ürettikleri 3D haritalar genellikle kalite ve çözünürlük bakımından farklılık gösterir. Böylece, kullanıcılar en iyi sonuçlar için çeşitli programlar arasında düzenli olarak veri aktarırlar. Bu makale, kullanıcıların popüler yazılım paketlerinde bir iş akışında gezinmeleri için bir kılavuz sağlar: adeno ilişkili virüsün (AAV) atomik çözünürlüğe yakın bir yapısını elde etmek için cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3. İlk önce cryoSPARC v3 ile bir görüntü işleme boru hattını detaylandırıyoruz, çünkü verimli algoritmaları ve kullanımı kolay GUI'si kullanıcıların bir 3D haritaya hızlı bir şekilde ulaşmalarını sağlıyor. Bir sonraki adımda, parçacık koordinatlarını cryoSPARC v3'te elde edilen en iyi kalitede 3D rekonstrüksiyondan RELION-3 ve Scipion 3'e dönüştürmek ve aktarmak ve 3D haritaları yeniden hesaplamak için PyEM ve şirket içi komut dosyalarını kullanıyoruz. Son olarak, RELION-3 ve Scipion 3'ten algoritmaları entegre ederek ortaya çıkan yapıların daha fazla iyileştirilmesi ve doğrulanması için adımları özetliyoruz. Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak üzere üç işleme platformunun etkili bir şekilde nasıl kullanılacağını açıklayacağız.
Giriş
Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) ve tek parçacık analizi (SPA), hidratlanmış hallerinde çok çeşitli biyomoleküler montajların yapı tayinini sağlayarak bu makromoleküllerin rollerini atomik detaylarda aydınlatmaya yardımcı olur. Mikroskop optiği, bilgisayar donanımı ve görüntü işleme yazılımındaki gelişmeler, biyomoleküllerin yapılarını 2 Å1,2,3'ün ötesine ulaşan çözünürlükte belirlemeyi mümkün kılmıştır. 2020 yılında Protein Veri Bankası'na (PDB) 2.300'den fazla kriyo-EM yapısı yatırılırken, 20144 yılında 192 yapıya kıyasla, kriyo-EM'nin birçok yapısal biyolog için tercih....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Yeni bir cryoSPARC v3 projesi oluşturma ve verileri içe aktarma
NOT: Veriler, Portland'daki Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nde (OHSU), bir Falcon 3 doğrudan elektron dedektörü ile donatılmış 300 kV Titan Krios elektron mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir. Görüntüler, 129 kare boyunca kesirlenmiş toplam 28,38 e−/Å2 dozu ve EPU kullanılarak 1,045 şpiksel boyutunda -0,5 μm ila -2,5 μm arasında bir bulanıklaştırma aralığı ile sayım modunda toplanmıştır. AAV-DJ örneği OHSU personeli tarafından sağlanmıştır.
- cryoSPARC v3'ü bir web tarayıcısında açın ve Projeler başlığın....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Üç farklı işleme platformu kullanarak yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek için kapsamlı bir SPA boru hattı sunduk: cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3. Şekil 1 ve Şekil 4, genel işleme iş akışını özetler ve Tablo 1, iyileştirme protokollerini ayrıntılarıyla açıklar. Bu protokoller, AAV'nin 2.3 şyapısının iyileştirilmesi sırasında kullanıldı ve Nyquist çözünürlüğüne yakın bir çözünürlük elde edildi.
Filmler ilk ön.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede, yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için çeşitli yazılım platformlarında kriyo-EM veri işleme için sağlam bir SPA iş akışı sunuyoruz (Şekil 1). Bu iş akışı çok çeşitli biyolojik makromoleküllere uygulanabilir. Protokolün sonraki adımları, film ön işleme, parçacık toplama ve sınıflandırma ve yapı iyileştirmeleri (Tablo 1) ve doğrulama için çoklu yöntemler dahil olmak üzere Şekil 4'te özetlenmiştir. C.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Carlos Oscar Sorzano'ya Scipion3 kurulumundaki yardımları için ve Kilian Schnelle ve Arne Moeller'e farklı işleme platformları arasında veri aktarımı konusunda yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu araştırmanın bir kısmı NIH hibesi U24GM129547 tarafından desteklendi ve OHSU'daki PNCC'de gerçekleştirildi ve Biyolojik ve Çevresel Araştırmalar Ofisi tarafından desteklenen bir DOE Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi olan EMSL (grid.436923.9) aracılığıyla erişildi. Bu çalışma, Rutgers Üniversitesi'nden Arek Kulczyk'e verilen bir start-up hibesi ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| CryoSPARC | Structura Biyoteknoloji A.Ş. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Tıp Enstitüsü, UMass Chan Tıp Okulu | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Makromoleküler Yapı Grubu | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Makromoleküler Nötron Kristalografisi (MNC) için Phoenix Hesaplama Araçları | http://www.phenix-online.org/ | ||
| Kaliforniya PyEM | Üniversitesi, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Yapısal Biyoloji | Laboratuvarı https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Görüntü İşleme Merkezi (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Biyohesaplama Kaynağı, Görselleştirme ve Bilişim | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
Kaynaklar
- Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- Wardell, M.,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
