Yöntem makalesi

Düşük Girişli Çekirdek İzolasyonu ve Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Fare Sempatik Ganglia'nın Barkodlu Antikorları ile Çoklama

DOI:

10.3791/63397

⸱

23 Mart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, 3Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare üstün servikal ve yıldız gangliyonunun diseksiyonu, hücre ayrışması, kriyoprezervasyon, çekirdek izolasyonu ve hashtag barkodlaması dahil olmak üzere tek çekirdekli dizileme için ayrıntılı, düşük girişli numune hazırlığını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak otonom sinir sistemi, kalp atış hızı ve kardiyak kontraktilitesi gibi kardiyak fonksiyonların kontrolünde çok önemlidir ve sempatik ve parasempatik dallara ayrılır. Normalde, homeostazı korumak için bu iki dal arasında bir denge vardır. Bununla birlikte, miyokard enfarktüsü, kalp yetmezliği ve hipertansiyon gibi kalp hastalığı durumları, olumsuz bir klinik sonuçla ilişkili olan kardiyak innervasyonda rol oynayan hücrelerin yeniden şekillenmesine neden olabilir.

Kardiyak otonom sinir sisteminin histolojik yapısı ve işlevi için çok miktarda veri olmasına rağmen, sağlık ve hastalıktaki moleküler biyolojik mimarisi birçok açıdan hala gizemlidir. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) gibi yeni teknolojiler, dokuların tek hücreli çözünürlükte genetik karakterizasyonu için umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, nispeten büyük nöron boyutu, bu tekniklerin standartlaştırılmış kullanımını engelleyebilir. Burada, bu protokol, sağlık ve hastalıkta kardiyak sempatik nöronların biyolojik mimarisini karakterize etmek için bir yöntem olan damlacık bazlı tek çekirdekli RNA dizilimini (snRNA-seq) kullanır. Yetişkin farelerden disseke edilen bilateral superior servikal (SCG) ve stellat ganglionların (StG) snRNA-sekik'ini gerçekleştirmek için kademeli bir yaklaşım gösterilmiştir.

Bu yöntem, birden fazla bireyden/deneyden alınan örneklerin kısa bir süre içinde bir kerede toplanamadığı durumlarda yeterli RNA kalitesini koruyarak uzun süreli numune muhafazasını sağlar. Çekirdeklerin hashtag oligolarla (HTO'lar) barkodlanması, çoklamanın giderilmesini ve dizileme sonrası farklı gangliyonik örneklerin geri izlenmesini sağlar. Daha sonraki analizler, snRNA-seq tarafından doğrulandığı gibi, sempatik ganglionların nöronal, uydu glial ve endotel hücrelerinin başarılı çekirdek yakalamasını ortaya koydu. Özetle, bu protokol, sempatik ekstrinsik kardiyak gangliyonların snRNA-seksi için, diğer organ ve dokuların innervasyonu çalışmalarında daha geniş uygulama potansiyeline sahip bir yöntem olan kademeli bir yaklaşım sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otonom sinir sistemi (ANS), çevresel koşullara ve patolojiye adaptasyon da dahil olmak üzere vücut homeostazını koruyan periferik sinir sisteminin çok önemli bir parçasıdır1. Kardiyovasküler, solunum, sindirim ve endokrin sistemler gibi vücuttaki çoklu organ sistemlerinin düzenlenmesinde rol oynar. ANS sempatik ve parasempatik dallara ayrılmıştır. Sempatik sinir sisteminin spinal dalları, sempatik zincirin ganglionlarında, iki taraflı olarak paravertebral pozisyonda bulunan sinapstır. İki taraflı servikal ve torasik ganglionlar, özellikle StG, kardiyak sempatik innervasyona katılan önemli bileşenlerdir. Kardiyak iskemi gibi hastalık durumlarında, nöronal yeniden yapılanma meydana gelebilir ve bu da sempatik bir aşırı hızlanmaile sonuçlanır 2. Nöronal yeniden yapılanma, insanlarda ve diğer bazı hayvan türlerinde 3,4,5,6 yapılan birçok histolojik çalışmada gösterilmiştir. Kardiyak sempatik gangliyonlarda kardiyak iskemiye bağlı nöronal remodellemenin ayrıntılı bir biyolojik karakterizasyonu şu anda eksiktir ve kardiyak sempatik sinir sistemi (SNS) içindeki özelleşmiş nöronal hücre tiplerinin veya alt tiplerinin temel biyolojik özellikleri sağlık ve hastalıkta henüz tam olarak belirlenmemiştir7.

ScRNA-seq gibi yeni teknolojiler, küçük dokuların tek hücre seviyesindegenetik karakterizasyonu için kapılar açmıştır 8,9. Bununla birlikte, nöronların nispeten büyük boyutu, bu tek hücreli tekniklerin insanlarda optimize edilmiş kullanımını engelleyebilir10. Ek olarak, tek hücreli dizileme, sıralama işlemindeki yüksek bir kayıp nedeniyle yeterli bir hücre sayısını geri kazanmak için yüksek verimli bir hücre gerektirir. Bu, bir seansta yakalanması zor olan ve dizileme için yeterli tek hücreyi tanıtmak için birden fazla örnek gerektiren küçük dokuları incelerken zor olabilir. Yakın zamanda geliştirilen damlacık bazlı snRNA-seq teknolojisi (yani, 10x Krom platformu), tek çekirdekler arasındaki biyolojik farklılıkların incelenmesine izin verir11,12. snRNA-seq, Emülsiyonlarda (GEM'ler) Jel Boncuk'ta yakalanamayan büyük hücreler (>30 μm) için scRNA-seq'e göre bir avantaja sahiptir, ayrıca kapsamlı ayrışma ve / veya uzun süreli koruma ile gelişmiş uyumluluk13,14,15.

Heterojenlik, nöronal hücrelerin sayısı ve kardiyak SNS'de zenginleştirilmiş diğer hücreler, sağlık ve hastalık durumlarında ANS'nin karakterizasyonu için önemli hususlardır. Ek olarak, her sempatik ganglionun organa veya bölgeye özgü innervasyonu, SNS'nin karmaşıklığına katkıda bulunur. Ayrıca, sempatik zincirin servikal, stellat ve torasik ganglionlarının kalbin farklı bölgelerini innerve ettiği gösterilmiştir16. Bu nedenle, biyolojik mimarilerini incelemek için bireysel ganglionlardan türetilen gangliyonik hücrelerin tek çekirdekli analizini yapmak gerekir.

Damlacık bazlı snRNA-seq, plaka tabanlı dizileme platformlarından daha düşük maliyetlerle aynı anda birden fazla numuneden binlerce hücreden oluşan bir havuz için transkriptom çapında ekspresyon profillemesine izin verir. Bu yaklaşım, damlacık bazlı snRNA-sek'in hücresel fenotip sınıflandırması ve SCG ve StG içindeki hücrelerin yeni alt popülasyon tanımlaması için daha uygun olmasını sağlar. özellikle, bu protokol, sempatik ekstrinsik kardiyak ganglionların tanımlanması, izolasyonu ve tek çekirdekli RNA dizilimi için kısa ve kademeli bir yaklaşım sağlar; bu, diğer ilgili organ ve dokuları innerve eden ganglionların karakterizasyonu çalışmalarında geniş bir uygulama potansiyeline sahip bir yöntemdir. sağlık ve hastalık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, murin servikal ve / veya servikotorasik (stellat) gangliyonların snRNA-seksi için gerekli tüm adımları açıklar. Dişi ve erkek C57BL/6J fareler (15 haftalık, her cinsiyet için n=2) kullanıldı. Ek bir Wnt1-Cre; mT / mG fare, ganglionları diseksiyon amacıyla görselleştirmek için kullanıldı17,18. Bu ek fare, bir B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J fare ve bir B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J farenin melezlenmesiyle oluşturuldu. Tüm hayvan deneyleri, NIH tarafından yayınlanan ve Leiden Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre gerçekleştirilmiştir (Lisans numarası AVD1160020185325, Leiden, Hollanda). Protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar, yazılımlar ve hayvanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Hazırlıklar

NOT: Tüm adımlar bir hücre kültürü akış kabininde gerçekleştirilir.

  1. Forseps ve makasları, aletleri 20 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak temizleyin.
  2. B-27 artı (1x), L-glutamin (2 mM) ve% 1 Antibiyotik-Antimikotik ile desteklenmiş Nörobazal Ortamdan oluşan ganglion ortamını hazırlayın. Ganglion ortamını oda sıcaklığında önceden ısıtın.
  3. Sindirim çözeltisini hazırlayın:% 0.25 Tripsin-EDTA (1: 1) ve gangliyon ortamında çözünmüş 1.400 U / mL kollajenaz tip 2.
  4. Çekirdek izolasyonu için taze, soğuk (4 °C) hücre yıkama tamponu (%0,4 sığır serum albümini [BSA]) ve lizis tamponu (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 ve %0,1 iyonik olmayan deterjan, nükleaz içermeyen suda 40 U/mL RNAse) hazırlayın.
  5. Çekirdek yıkama tamponu hazırlayın (%2.0 BSA ve 0.2U/μL RNaz İnhibitörü ile 1x fosfat tamponlu salin [PBS]).
  6. ST boyama tamponunu (ST-SB) hazırlayın (nükleaz içermeyen suda 10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl,21 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, %2 BSA, %0,02 Ara-20).

2. Yetişkin fare superior servikal ganglionların (SCG) diseksiyonu

  1. Fareleri ötenazi yapın ve buz üzerinde tutun.
    NOT: Bu çalışmada, toplam 4 C57BL6/J faresi CO2 boğulması ile ötenazi yapılmıştır. Alternatif olarak, izofluran, diğer çalışma amaçları için büyük miktarda kan toplanması gerektiğinde ekssanguinasyon ile takip edilebilir.
  2. Fareyi pimlerle bir diseksiyon panosuna sabitleyin ve kürk dağılımını en aza indirmek için% 70 etanol ile doldurun (tıraş gerekli değildir).
  3. Bir stereomikroskop altında, makasla orta hat kesimi yaparak boyun bölgesinin derisini açın, submandibuler bezleri bir kenara taşıyın ve ortak karotis arteri ve çatallanmasını ortaya çıkarmak ve bulmak için sternomastoid kası çıkarın (Şekil 1A, B, oka bakınız).
  4. Sağ ve sol karotis arter bifurkasyonunu ve ona bağlı dokuyu diseke edin. Her disseke edilmiş doku parçasını soğuk PBS içeren ayrı bir 3,5 cm Petri kabına aktarın.
  5. Karotis bifurkasyonuna bağlı SCG'yi arayın. Petri kabındaki arteri ve diğer bağlı dokuları çıkararak SCG'yi daha da temizleyin (Şekil 1E).

3. Yetişkin fare yıldız ganglionlarının (StG) diseksiyonu

  1. StG'yi diseke etmek için, karında bir orta hat kesimi yapın, ardından diyaframı ve ventral torasik duvarı açın.
  2. Dorsal toraksı ortaya çıkarmak için kalbi ve akciğerleri çıkarın. İlk kaburga seviyesindeki musculus colli longus'a (MCL) sol ve sağ StG anterolateral olanı arayın (Şekil 1C, D, kesikli çizgilerle gösterilir).
  3. Forseps ile hem sol hem de sağ StG'yi disseke edin ve ayrı ayrı soğuk PBS içeren 3,5 cm Petri kaplarına aktarın (Şekil 1F).
    ​

4. Fare gangliyonik hücrelerinin izolasyonu ve kriyoprezervasyonu

4-6 arası adımlar Şekil 2'de özetlenmiştir.

  1. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini forseps ile ayırmak için tüm bireysel SCG ve StG'yi dikkatlice aktarın.
    NOT: Ganglionları aktarmak için pipet uçlarını kullanmayın, çünkü ganglionlar plastik pipet uçlarının duvarına yapışmaya eğilimlidir.
  2. Her bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 40 dakika boyunca 37 ° C'de sallanan bir su banyosunda inkübe edin.
    NOT: Bu adım, bundan sonra kollajenaz tip 2 çözeltisinde sindirimi ve hücre salınımını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
  3. Her numune için 5 mL ganglion ortamı içeren 15 mL'lik bir tüp hazırlayın. Ganglionların mikrosantrifüj tüplerinin dibine yerleşmesine izin verin. Çok az gangliyonik hücre içeren süpernatanı toplayın, süpernatantı hazırlanan 15 mL tüplere aktarın ve her tüpü etiketleyin. Alternatif olarak, biraz zaman kazanmak için, tripsin-EDTA süpernatantını toplanmadan aspire edin, çünkü içinde çok az ayrışmış hücre tespit edilebilir.
    NOT: Ganglianın çıkarılmasını önlemek için mikrosantrifüj tüpünde az miktarda tripsin-EDTA çözeltisi (~ 10-30 μL) bırakılabilir. Bu adımda pipetlemeden kaçının, çünkü ganglionlara zarar verebilir ve daha sonra gangliyonik hücrelerin düşük çıkışına neden olabilir.
  4. Her bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL kollajenaz tip 2 çözeltisi ekleyin ve 35-40 dakika boyunca 37 ° C'de sallanan bir su banyosunda inkübe edin. Ganglionu 35 dakika sonra askıya almaya çalışın; ganglion hala sağlamsa ve ayrışmazsa, inkübasyon süresini uzatın veya gerektiğinde kollajenaz tip 2 çözeltisinin konsantrasyonunu artırın.
    NOT: Kuluçka süresi ganglion boyutuna bağlı olarak değişebilir.
  5. Gangliyonları kollajenaz çözeltisinde ~ 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek veya doku kümeleri artık tespit edilinceye kadar yeniden askıya alın.
  6. Hücre süspansiyonunu, gangliyon kültür ortamını ve tripsin-EDTA süspansiyonunu aynı gangliondan içeren daha önce kullanılan 15 mL tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu sallanan kova rotorlu santrifüjle oda sıcaklığında 10 dakika, 300 × g boyunca döndürün. Hücre süpernatını dikkatlice atın.
    NOT: Gangliyonik hücreler tek bir gangliondan ayrıştığından, hücre peleti gözle tespit edilemeyecek kadar küçük olabilir; hücre peletinin yanlışlıkla çıkarılmasını önlemek için tüpte az miktarda süpernatant bırakılabilir.
  7. Gangliyonik hücreleri 270 μL fetal sığır serumunda (FBS, düşük endotoksin) yeniden askıya alın ve her hücre-FBS süspansiyonunu 1 mL kriyovyal içine aktarın.
  8. Hücreleri saymak için, gangliyonik hücre süspansiyonunun 5 μL'sini% 0.4 tripan mavisi boya ile 5 μL'lik karıştırın ve karışımı bir hemositometreye yükleyin. Toplam ve canlı hücre sayılarını mikroskop altında sayın.
    NOT: Hücre canlılığı (canlı hücre sayısı / toplam hücre sayısı = canlılık), bu ayrışma protokolü ile genellikle% 90'ın üzerindedir. Tek bir ganglionun (SCG veya StG) canlı hücre sayısı, gangliyon 12 ila 16 haftalık bir fareden izole edildiğinde genellikle 9.000-60.000 hücre aralığındadır.
  9. Kriyovallerdeki her hücre-FBS süspansiyonuna 30 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin, iyice karıştırın ve kriyovyalleri oda sıcaklığında tutulan bir hücre dondurma kabına aktarın. Kriyovsal yüklü kabı gece boyunca -80 ° C'de saklayın ve dizilemeden önce uzun süre korunmak için kriyovyalleri ertesi gün sıvı nitrojene aktarın.

5. Çekirdek izolasyonu

NOT: Dört fareden izole edilen sol ve sağ SCG (toplam 8 örnek), aşağıdaki çekirdek izolasyonu ve dizileme hazırlığında örnek olarak kullanılmıştır. Tüm prosedür boyunca her şeyi buz üzerinde tutun. Küçük çekirdek peletlerinin görünmezliği nedeniyle, tüm prosedür boyunca süpernatant giderimini kolaylaştırmak için sallanan kovalara sahip bir santrifüj şiddetle tavsiye edilir.

  1. Üstüne bir süzgeç (30 μm) ile 15 mL tüpler hazırlayın ve süzgeci ganglion ortamın 1 mL'si ile hazırlayın.
  2. Kriyovalleri sıvı azottan çıkarın ve hemen 37 ° C'de bir su banyosunda çözün. Kriyovalde küçük bir buz topağı bırakıldığında, kriyovyalleri su banyosundan çıkarın.
  3. Gangliyonik hücreleri, gangliyon ortamının 1 mL'sini her kriyovyalin içine bırakarak ve elle dikkatlice sallayarak geri kazanın. İsteğe bağlı: Hücre iyileşmesini değerlendirmek için, iyileşmeden sonra hücre süspansiyonunu karıştırın ve adım 4.8'de açıklandığı gibi canlı hücre sayımı için 5 μL hücre süspansiyonu alın.
  4. Her gangliyonik hücre süspansiyonunu ayrı bir süzgeç üzerine yükleyin (adım 5.1'de hazırlanmış) ve her süzgeci 4-5 mL ganglion ortamı ile durulayın.
  5. Süzülmüş hücre süspansiyonunu 300 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 50 μL hücre yıkama tamponunda yeniden askıya alın.
  6. Hücre süspansiyonunu düşük bağlayıcı bir DNA / RNA 0.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. Hücre süspansiyonunu 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  8. Hücre peletinin yerinden çıkmasını önlemek için tüpün dibine dokunmadan süpernatantın 45 μL'sini çıkarın.
  9. 45 μL soğutulmuş Lizis Arabelleği ekleyin ve 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın.
  10. Hücreleri buz üzerinde 8 dakika boyunca inkübe edin.
  11. Her tüpe 50 μL soğuk çekirdek yıkama tamponu ekleyin. Karıştırmayın.
  12. Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj yapın.
  13. Çekirdek peletini bozmadan süpernatantın 95 μL'sini çıkarın.
  14. Pelet üzerine 45 μL soğutulmuş çekirdek yıkama tamponu ekleyin. İsteğe bağlı: 5 μL çekirdek süspansiyonu alın, saymak için 5 μL% 0.4 tripan mavisi ile karıştırın ve bir hemositometre ile mikroskop altında çekirdeklerin kalitesini kontrol edin.
  15. Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj yapın.
  16. Çekirdek peletinin yerinden çıkmasını önlemek için tüpün dibine dokunmadan süpernatantı çıkarın.

6. Hashtag oligos (HTO'lar) ve çoklama ile çekirdek barkodlama

NOT: HTO boyama basamakları, Gaublomme ve ark.15 tarafından kortikal dokuda önceki uygulamaya göre çok düşük miktarlarda (ganglionik) çekirdeğin nükleer etiketlenmesi için modifiye edilmiş ve optimize edilmiştir.

  1. Çekirdek peletine 50 μL ST-SB tamponu ekleyin, çekirdekler tamamen yeniden askıya alınana kadar 8-10 kez hafifçe pipet çekin.
  2. ST-SB / çekirdek karışımının 50 μL'si başına 5 μL Fc Bloke edici reaktif ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
  3. ST-SB / çekirdek karışımının tüpü başına 1 μL (0,5 μg) tek çekirdekli hashtag antikoru ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: Daha kısa inkübasyon süresi, temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, hashtag etiketlemenin daha düşük verimliliğine yol açar.
  4. Her tüpe 100 μL ST-SB ekleyin. Karıştırmayın.
  5. Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 5 dakika, 600 × g santrifüj yapın.
  6. Çekirdek peletini bozmadan süpernatantın 145 μL'sini çıkarın.
  7. 6.4 ve 6.5 numaralı adımları yineleyin. Çekirdek peletinin yerinden çıkmasını önlemek için süpernatantı tüpün dibine dokunmadan mümkün olduğunca çıkarın.
  8. Çekirdek peletini 50 μL ST-SB içinde yeniden askıya alın ve çekirdekleri yavaşça karıştırın.
  9. Çekirdek süspansiyonunun 5 μL'sini alın ve çekirdekleri mikroskop altında saymak için 5 μL% 0.4 tripan mavisi ile karıştırın. Tripan mavisi ile karıştırılmış ve bir hemositometreye yüklenen çekirdeklerin temsili bir görüntüsü için Şekil 3A'ya bakınız.
  10. Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 600 × g'da 5 dakika santrifüj yapın.
  11. Karşılık gelen çekirdek sayısına göre her numune için 1.000-3.000 nüklei/μL'lik bir hedef çekirdek konsantrasyonu elde etmek için ST-SB'deki çekirdekleri yeniden askıya alın.
  12. İstenilen hücre sayısına ulaşmak için örnekleri bir araya getirin.
    NOT: Örneğin, bu deneyde, 8 örnek, hemen ardından 10x Genomik Krom ve snRNA-sek'e geçmek için toplam 25.000 çekirdeğe ulaşmak için eşit olarak bir araya getirildi. Çekirdek sayısı, ganglion 12 ila 16 haftalık bir fareden izole edildiğinde genellikle 6.000-40.000 hücre aralığına düşer. Toplam yüklü çekirdeklerin sadece yarısı damlacık bazlı snRNA-seq ile yakalanabilir. Örneğin, daha fazla kütüphane hazırlama ve dizileme için gerekli olan 10.000 çekirdeğin yakalanmasını sağlamak için 25.000 çekirdek karışımı hazırlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek çekirdekli cDNA kütüphanesi hazırlığı ve snRNA-seq kalite kontrol analizi
Temsili sonuçlar, 25.000 okuma / çekirdek gen ekspresyon kütüphanesi ve 5.000 okuma / çekirdek hashtag kütüphanesi ile tek bir havuzda yakalanan 10.000 çekirdeğin dizileme sonuçlarını açıklamaktadır. Şekil 3B , Biyoanalizör ile kontrol edilen 1. iplik cDNA, gen ekspresyonu (GEX) kütüphanesi ve HTO kütüphanesinin kalite kontrol sonuçlarını göstermektedir. HTO kaynaklı cDNA'ların 180 bp...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, i) yetişkin fare üstün servikal ve sempatik gangliyonlarının diseksiyonu, ii) gangliyonik hücrelerin izolasyonu ve kriyoprezervasyonu, iii) çekirdek izolasyonu ve iv) çoklama amacıyla HTO etiketleme ile nükleus barkodlaması ve snRNA-sek konularına odaklanan ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Bu protokolle, yaygın olarak kullanılan tripsin ve kollajenaz kullanılarak bireysel gangliyonların ayrıştırılmasıyla sempatik gangliyonik hücreler kolayca elde edilebilir. İzole gangliyonik hü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Susan L. Kloet'e (İnsan Genetiği Bölümü, LUMC, Leiden, Hollanda) deneysel tasarımdaki ve faydalı tartışmalardaki yardımları için teşekkür ederiz. Emile J. de Meijer'e (İnsan Genetiği Bölümü, LUMC, Leiden, Hollanda) tek çekirdekli RNA izolasyonu ve dizileme için kütüphane hazırlığı konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) [016.196.346 to M.R.M.J.] tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kimyasallar ve reaktifler< / güçlü>
% 0.25 Tripsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
%0,4 tripan mavisi boyaBio-Rad1450021
Antibiyotik-AntimikotikGibco15240096
B-27GibcoA3582801
Kollajenaz tip 2WorthingtonLS0041761.400 U/mL
Dimetil sülfoksitSigma Aldrich67685
Etanol mutlak & ge kullanın; % 99,5VWRVWRC83813.360
Fetal sığır serumu (düşük endotoksin)BiowestS1810-500
L-glutaminThermo Fisher Scientific25030024
Nörobazal OrtaGibco21103049
Sığır Serumu Albümini% 10Sigma-AldrichA1595-50MLHücre yıkama
tamponu DPBS (Ca < sup> 2 + < / sup>, Mg2+ücretsiz)Gibco14190-169Hücre yıkama tamponu
Magnezyum Klorür Çözeltisi, 1 MSigma-AldrichM1028Çekirdek Lizis tamponu
Nonidet P40 İkame (iyonik olmayan deterjan)Sigma-Aldrich74385Çekirdek Lizis tamponu
Nükleaz içermeyen su (DEPC ile tedavi edilmemiştir)InvitrogenAM9937Çekirdek Lizis tamponu
Koruyucu RNaz İnhibitörü, 40 U/&mikro; LSigma-Aldrich3335399001Çekirdek Lizis tamponu
Sodyum Klorür Çözeltisi, 5 MSigma-Aldrich59222CÇekirdek Lizis tamponu
Trizma Hidroklorür Çözeltisi, 1 M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194Çekirdek Lizis tamponu
Sığır Serumu Albümini% 10Sigma-AldrichA1595-50MLÇekirdek yıkama
DPBS (Ca < sup> 2 + < / sup>, Mg< sup>2+ücretsiz)Gibco14190-169Çekirdek yıkama
Koruyucu RNaz İnhibitörü, 40 U/&mikro; LSigma-Aldrich3335399001Çekirdek yıkama
Sığır Serumu Albümini% 10Sigma-AldrichA1595-50MLST boyama tamponu (ST-SB)
Kalsiyum klorür çözeltisi, 1 MSigma-Aldrich21115-100MLST boyama tamponu (ST-SB)
Magnezyum Klorür Çözeltisi, 1 MSigma-AldrichM1028ST boyama tamponu (ST-SB)
Nükleaz içermeyen su (DEPC değil tedavi edilmiş)InvitrogenAM9937ST boyama tamponu (ST-SB)
Sodyum Klorür Çözeltisi, 5MSigma-Aldrich59222CST boyama tamponu (ST-SB)
Trizma Hidroklorür Çözeltisi, 1M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194ST boyama tamponu (ST-SB)
Ara-20Merck Millipore822184ST boyama tamponu (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nükleer Gözenek Kompleksi Proteinleri Hashtag 1 AntikorBiyoefsane682205Hashtag antikoru
TotalSeq-A0452 anti-Nükleer Gözenek Kompleksi Proteinleri Hashtag 2 AntikorBiyoefsanesi682207Hashtag antikoru
TotalSeq-A0453 anti-Nükleer Gözenek Kompleksi Proteinleri Hashtag 3 AntikorBiyoefsane682209Hashtag antikoru
TotalSeq-A0461 anti-Nükleer Gözenek Kompleksi Proteinleri Hashtag 11 AntikorBiyoefsane682225Hashtag antikoru
TotalSeq-A0462 anti-Nükleer Gözenek Kompleksi Proteinleri Hashtag 12 AntikorBiyoefsanesi682227Hashtag antikoru
TotalSeq-A0463 anti-Nükleer Gözenek Kompleksi Proteinleri Hashtag 13 AntikorBiyoefsanesi682229Hashtag antikoru
TotalSeq-A0464 anti-Nükleer Gözenek Kompleksi Proteinleri Hashtag 14 AntikorBiolegend 682231Hashtag antikoru
TotalSeq-A0465 anti-Nükleer Gözenek Kompleksi Proteinleri Hashtag 15 AntikorBiolegend682233Hashtag antikoru
TruStain FcX (insan)Biolegend422302FC reseptör bloke etme çözümü
Ekipman ve sarf malzemeleri
Parlak Çizgi  HematitometreMerckZ359629-1EA
Santrifüj 5702 / R A-4-38Eppendorfve nbsp;
CoolCell LX Hücre Dondurma KabıCorningCLS432003-1EA
CryovialThermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tüpüEppendorfEP0030108035-250EA
Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri 1.5 mLEppendorf30121872
Falcon 35 mm TC ile muamele edilmemiş Petri kabıCorning
Falcon 15 mL Konik Santrifüj TüpleriFisher bilimsel10773501
Forseps Dumont #5Güzel bilim aletleri11252-40
Sertleştirilmiş İnce MakasGüzel bilim aletleri14091-09
  Buz Tavası, dikdörtgen 4 L TuruncuCorningCLS432106-1EA
Leica MS5LeicaMikroskop
Moria MC50 MakasGüzel bilim aletleri15370-50
Noyes Yaylı MakasGüzel bilim aletleri15012-12
Olympus CK2 ULWCDOlympusMikroskop
P10GilsonF144802
P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
; m)Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
Sallanan su banyosuGFL1083
Silikon plakaRubberBV3530Diseksiyon tahtası
< güçlü > Yazılım ve paketler < / güçlü >
Hücre rangerV4.0.0
R programlamaV4.1.1
R sudioV1.3.1073
SeuratV4.0
tydiverseV1.3.1
Animals
B6. Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J fareJackson LaboratuvarıJAX hisse senedi #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J fareJackson LaboratuvarıJAX hisse senedi #007576
C57BL/6J farelerCharles River
Veri analizi için kod
EP022629905351008 Ön Ayırma Filtreleri (30 & mikrohttps://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
  2. Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368(2015).
  3. Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010(2012).
  4. Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
  5. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  6. Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
  7. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  8. Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
  9. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
  10. Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
  11. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832(2019).
  12. Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374(2020).
  13. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
  14. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).
  15. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).
  16. Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298(2021).
  17. Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  19. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
  20. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).
  21. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).
  22. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022(2016).
  23. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
  24. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Single Nucleus RNA SequencingNucleus IsolationBarcoded AntibodiesMouse Sympathetic GangliaCardiac Autonomic Nervous SystemHashtag OligosMultiplexed SequencingGanglia DissectionNeuronal Cell ClustersSample Preservation

İlgili makaleler