Bitki Köklerini Toprak Kaynaklı Mikroorganizmalarla Enfekte Etmek için Aşılama Stratejileri

Doğal topraklarda, nötr, zararlı veya bitkilere faydalı olabilecek şaşırtıcı sayıda mikrop^{yaşar 1}. Birçok bitki patojeni toprak kaynaklıdır, kökleri çevreler ve yeraltı organına saldırır. Bu mikroorganizmalar çok çeşitli kladlara aittir: mantarlar, oomisetler, bakteriler, nematodlar, böcekler ve bazı virüsler ^1,2. Çevresel koşullar enfeksiyonu desteklediğinde, duyarlı bitkiler hastalıklı hale gelecek ve mahsul verimi düşecektir. Küresel ısınma ve aşırı hava koşulları gibi iklim değişikliğinin etkileri, toprak kaynaklı bitki patojenlerinin oranını artıracaktır³. Bu nedenle, bu yıkıcı mikropları ve bunların gıda ve yem üretimi üzerindeki etkilerini, aynı zamanda doğal ekosistemler üzerindeki etkilerini incelemek giderek daha önemli hale gelecektir. Ek olarak, toprakta köklerle sıkı bir şekilde etkileşime giren ve bitki büyümesini, gelişimini ve bağışıklığını teşvik eden mikrobiyal karşılıkçılar vardır. Patojenlerle karşı karşıya kaldıklarında, bitkiler rizosferde patojenleri baskılayarak konakçı sağkalımını destekleyebilecek spesifik rakipleri aktif olarak işe alabilir ^4,5,6,7. Bununla birlikte, yararlı kök-mikrop etkileşimlerinde yer alan mekanik detaylar ve yollar genellikle hala bilinmemektedir⁶.

Bu nedenle, kök-mikrop etkileşimlerinin genel anlayışını genişletmek esastır. Model çalışmaları yapmak ve bulguları tarımsal uygulamalara aktarmak için köklerin toprak kaynaklı mikroorganizmalarla aşılanması için güvenilir yöntemler gereklidir. Topraktaki faydalı etkileşimler, örneğin, Serendipita indica (eski adıyla Piriformospora indica), azot sabitleyici Rhizobium spp. veya mikorizal mantarlarla incelenirken, bilinen toprak kaynaklı bitki patojenleri arasında Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. ve Verticillium ^spp.1 bulunur. Son ikisi, küresel olarak dağılmış ve vasküler hastalıklara neden olan mantar cinsleridir². Verticillium spp. (Ascomycota) yüzlerce bitki türünü enfekte edebilir - otsu yıllıklar, odunsu çok yıllık bitkiler ve birçok mahsul bitkisi de dahil olmak üzere büyük ölçüde dikotiledonlar ^2,8. Verticillium'un hifleri köke girer ve ksilem damarlarını^kolonize etmek için merkezi silindire doğru hem hücreler arası hem de hücre içi olarak büyür ^2,9. Bu damarlarda, mantar yaşam döngüsünün çoğunda kalır. Ksilem özü besin açısından fakir olduğundan ve bitki savunma bileşikleri taşıdığından, mantar bu eşsiz ortama uyum sağlamalıdır. Bu, patojenin konakçısı^10,11'de hayatta kalmasını sağlayan kolonizasyonla ilgili proteinlerin salgılanmasıyla gerçekleştirilir. Kök vaskülatürüne ulaştıktan sonra, mantar ksilem damarları içinde akroleptal olarak yeşilliklere yayılabilir ve bu da konakçının sistemik kolonizasyonuna yol açar ^9,12. Bu noktada bitki büyümesinde olumsuz etkilenmektedir 9,10,13. Örneğin, bodurluk ve sarı yaprakların yanı sıra erken yaşlanma^13,14,15,16 meydana gelir.

Bu cinsin bir üyesi, tarımsal olarak önemli yağlı tohumlu kolza, karnabahar ve model bitki Arabidopsis thaliana¹² gibi sütyen konakçılara oldukça adapte olmuş Verticillium longisporum'dur. Birkaç çalışma, toprak kaynaklı vasküler hastalıklar ve ortaya çıkan kök savunma yanıtları^13,15,16,17 hakkında kapsamlı bilgiler edinmek için V. longisporum ve A. thaliana'yı birleştirdi. Basit duyarlılık testi, V. longisporum / A. thaliana model sistemi kullanılarak gerçekleştirilebilir ve her iki organizma için de köklü genetik kaynaklar mevcuttur. V. longisporum ile yakından ilişkili olan patojen Verticillium dahliae'dir. Her iki mantar türü de benzer bir vasküler yaşam tarzı ve istila süreci gerçekleştirse de, köklerden yapraklara yayılma etkinlikleri ve A. thaliana'da ortaya çıkan hastalık semptomları farklıdır: V. longisporum genellikle erken yaşlanmayı indüklerken, V. dahliae enfeksiyonu solgunluğa neden olur¹⁸. Son zamanlarda, metodolojik bir özet, A. thaliana'yı V. longisporum veya V. dahliae ile enfekte etmek için farklı kök aşılama stratejileri sunmuş ve deneysel kurulumların planlanmasına yardımcı olmuştur¹⁹. Tarlada, V. longisporum zaman zaman yağlı tohumlu kolza^{üretiminde önemli} hasara neden olurken, V. dahliae asma, patates ve domates⁸ gibi çeşitli ekili türlerden oluşan çok geniş bir konakçı yelpazesine sahiptir. Bu, her iki patojeni de incelemek için ekonomik olarak ilginç modeller haline getirir.

Bu nedenle, aşağıdaki protokoller, kök aşılamaları için olası yaklaşımları örneklemek için hem V. longisporum hem de V. dahliae'yi model kök patojenleri olarak kullanmaktadır. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), yağlı tohumlu kolza (Brassica napus) ve domates (Solanum lycopersicum) model konakçı olarak seçildi. Metodolojilerin ayrıntılı açıklamaları aşağıdaki metinde ve beraberindeki videoda bulunabilir. Her aşılama sistemi için avantaj ve dezavantajlar tartışılmıştır. Birlikte ele alındığında, bu protokol koleksiyonu, kök-mikrop etkileşimleri bağlamında belirli araştırma soruları için uygun bir yöntemin belirlenmesine yardımcı olabilir.

1. Mantar kültürleri ve bitki aşılama sistemleri için ortam

1. Sıvı Patates Dekstroz Suyu (PDB): Isıya dayanıklı bir şişede ultra saf suda 21 g / L PDB hazırlayın.
2. Sıvı Czapek Dekstroz Suyu (CDB): Isıya dayanıklı bir şişede ultra saf suda 42 g / L CDB hazırlayın.
3. Petri kabı aşılama sistemi için ortam: Ultra saf suda 1,5 g / L Murashige ve Skoog ortamı (MS) ve 8 g / L agar ile ısıya dayanıklı bir şişe hazırlayın.
   NOT: Bu ortamda şekerden kaçının, çünkü aşılamadan sonra aşırı mantar büyümesine yol açacaktır.
4. Plastik fincan bazlı aşılama sistemi için ortam: Ultra saf suda 4.4 g / L MS, 0.2 g / L MgSO₄, 1 g / L KNO₃, 0.5 g / L 2-(N-morfolino) etansülfonik asit (MES) ve 6.0 g / L agar ile ısıya dayanıklı bir şişe hazırlayın ve pH'ı 5 M KOH ile 5.7'ye ayarlayın.
   NOT: Bu ortamda şekerden kaçının, çünkü aşılamadan sonra aşırı mantar büyümesine yol açacaktır.
5. 1/4 MS ortamı: Ultra saf suda 1,2 g/L MS hazırlayın.
6. Yukarıdaki tüm çözeltileri sterilize etmek için otoklav kullanın. Cam şişeleri sepete koyun, kapağı kapatın ve 121 ° C ve 98.9 kPa'da 15 dakika sterilize edin.

2. Bitki tohumlarının yüzeyinin sterilize edilmesi

NOT: Ekimden önce Arabidopsis, yağlı tohum kolza ve domates tohumlarının yüzeyini sterilize etmek için her zaman aşağıdaki protokolü kullanın.

1. Tohumları 2 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Tüpü 5,8 L'lik bir iç kapasiteye sahip bir eksizatöre yerleştirin.
2. 100 mL% 12 sulu sodyum hipoklorite (NaClO) 6 mL% 33 hidroklorik asit (HCl) ekleyerek eksikatörde klor gazı üretin.
3. Hemen eksikatörün kapağını kapatın ve tohumları gazda 3 saat boyunca inkübe edin.

3. İnokulumun Verticillium sporları (aseksüel türevli konidia) ile hazırlanması

NOT: V. dahliae (JR2 suşu) ile V. longisporum (suş Vl43)^17,18,19 ile aynı şekilde yetiştirilir. Tüm ekipmanın ve ortamın mikropsuz olduğundan ve inokulumu aksenik tutmak için tüm adımların laminer bir akış başlığında gerçekleştirildiğinden emin olun.

1. 500 mL'lik bir chicanery şişesine 150 mL sıvı PDB (adım 1.1) doldurun ve ortamı 500 mg / L sefotaksim ile tamamlayın.
2. Verticillium conida'yı gliserol stok deposundan PDB ortamına ekleyin. Şişeyi steril bir köpük tıpa ile kapatın.
3. Kültürü, sürekli, yatay sallama (döner çalkalayıcı; 60 rpm) altında oda sıcaklığında (RT) karanlık bir kutuda 7-10 gün boyunca inkübe edin. Bu, küçük, beyaz misel küreleri ile sonuçlanır.
4. PDB supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atın. Miselinin çoğu şişede kalmalıdır.
5. Chicanery şişesindeki miselya üzerine 100 mL sıvı CDB (adım 1.2) ekleyin ve ortamı 500 mg / L sefotaksim ile tamamlayın.
6. Sporülasyonu indüklemek için RT'deki karanlık bir kutuda sürekli, yatay sallama (döner çalkalayıcı, 60 rpm) altında 4-5 gün daha inkübe edin. Süpernatant, konidia serbest bırakıldıkça sarımsı-grimsi hale gelecektir.
7. Konidya içeren sıvının bir kısmını (5-10 mL) bir filtre kağıdından (partikül tutma seviyesi 8-12 μm) steril bir 50 mL toplama tüpüne filtreleyin. Bu, sporları miselden ayırır.
8. Bir hücre sayma odası ve mikroskop kullanarak spor konsantrasyonunu belirleyin. Aşağıda verilen spor konsantrasyonları elde edilene kadar ultra saf suda mikropsuz 1/4 MS ortamı ile seyreltin.
   NOT: Mikroskop altında, V. longisporum'dan gelen konidia çoğunlukla uzun çekilmiş ve 7.1-8.8 μm boyutundayken, V. dahliae conidia daha kısadır (3.5-5.5 μm) ve oldukça küresel^20'dir.
9. Bu taze hasat edilmiş konidiayı inokül olarak kullanın. Deneyleri her zaman dondurulmuş stoklarla değil, taze hasat edilmiş konidia ile yaptığınızdan emin olun, çünkü donma canlı sporların sayısını önemli ölçüde azaltır¹⁹.
10. Uzun süreli depolama için, sporları -⁸⁰ ° C'de% 25 gliserol içinde (1 yıla kadar saklanabilir) yüksek konsantrasyonlu spor çözeltisi (yaklaşık 1 x 10 8 spor / mL) olarak dondurun. Sonraki deneyler için, adım 3.2'de PDB ortamını aşılamak için bu gliserol stoklarını kullanın.

4. Petri kaplarına dayalı steril bir in vitro aşılama sistemi

NOT: Petri çanak sistemi¹⁷ için, tüm ekipman ve ortamların mikropsuz olduğundan ve tüm adımların laminer bir akış başlığında gerçekleştirildiğinden emin olun.

1. Otoklavlamadan sonra, ortamı (bkz. adım 1.3) Petri kaplarına dökün.
2. Ortamın sertleşmesinden sonra, Petri bulaşıklarını steril bir plastik torbada yeniden paketleyin ve gece boyunca buzdolabında (4-10 ° C) baş aşağı saklayın. Soğutulmuş bir ortam, sonraki adımlarda ortamın kaymasını önlemeye yardımcı olur.
3. Bir enfeksiyon kanalını ve katılaşmış ortamın üst üçte birini bir neşterle kesin ve çıkarın (Şekil 1A). Kesim sırasında agar ortamının altına sıvı veya hava almaktan kaçının; Aksi takdirde, ortam kayacak ve enfeksiyon kanalını kapatacaktır.
4. 50-100 yüzey sterilize Arabidopsis tohumunu, kesilmiş üst yüzeye steril bir pipet ucu ile dağıtın. Tohumları, kesilmiş agar yüzeyinin Petri kabının duvarına temas ettiği açıya koyun, böylece kökler ortam ile Petri çanağı duvarı arasında büyüyebilir. Bu daha sonra aşılamayı kolaylaştıracaktır.
5. Petri çanaklarını kapatın ve gaz değişimine izin vermek için hava geçirgen yapışkan bantla kapatın.
6. Karanlıkta 4 °C'de 2 gün boyunca tabakalaşmadan sonra, plakaları dikey olarak uygun bir rafa yerleştirin ve bitkileri bir büyüme odasında uzun gün koşullarında (16 saat ışık / 8 saat karanlık) 22 ° C ± 1 ° C'de yetiştirin.
7. Köklerin çoğunluğu enfeksiyon kanalına ulaştığında (yaklaşık 9-11 günlük fideler), plakaları yatay olarak yerleştirin, açın ve sıvının kanalda eşit olarak dağıldığından emin olmak için doğrudan enfeksiyon kanalına 4 x 10 5 spor / mL konsantrasyonda⁵⁰⁰ μL taze hasat edilmiş Verticillium conidia ekleyin.
8. Benzer şekilde, sporlar yerine 500 μL sahte bir çözelti ekleyerek kontrol plakaları hazırlayın (mikropsuz 1/4 MS ortamı).
9. Sıvı ıslanana kadar plakaları yatay olarak birkaç dakika inkübe edin ve plakalar tekrar dikey olarak ayarlandığında sızıntı yapamazsınız. Ardından, kapağı kapatın ve plakaları hava geçirgen yapışkan bantla kapatın.
10. Plakaları büyüme odasında dikey olarak inkübe edin. İsteğe bağlı olarak, kökleri ve toprak kaynaklı mantarları koyulaştırmak için kök kısımlarını siyah kağıt kutularla örtün (bkz.¹⁹).
11. Araştırma sorusuna bağlı olarak aşılamadan sonra analizleri tercih edilen zaman noktalarında gerçekleştirin (burada kullanılan kesin zaman noktaları için şekil açıklamalarına bakın). Aşağıda bazı öneriler verilmiştir.
    1. Yaprakları köklerden kesin ve her ikisini de ayrı ayrı hasat edin. Köklere kolayca erişmek için agar şeritlerini Petri bulaşıklarından çıkarın ve forseps kullanarak dikkatlice agardan çıkarın. Tüm bitki materyallerini hemen sıvı azotta dondurun.
       1. Numuneleri sıvı azotta öğütün. Kantitatif bir PCR (qPCR) yoluyla bitki DNA'sına göre mantar DNA'sı miktarını belirlemek için 100 mg yaprak materyalinden toplam DNA'yı çıkarın (bkz.¹⁹).
       2. Numuneleri sıvı azotta öğütün. 100 mg bitki materyali alın ve toplam RNA'yı çıkarın. İstila sırasında bitki genlerinin (veya mantar genlerinin) ekspresyonunu belirlemek için kantitatif ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) uygulayın (bkz.¹⁹).
    2. Kökleri yaralanmayı önlemek için agardan dikkatlice çıkarın ve floresan mikroskop altında inceleyin.
       1. Bitki raportör hatlarında belirteç genlerinin indüksiyonunu belirleyin (örneğin, lusiferaz, β-glukuronidaz veya floresan muhabirler^17,19,21).
       2. Mantar raporlayıcı çizgileri kullanarak (örneğin, gelişmiş Yeşil Floresan Proteini, Vl-sGFP^9'u yapısal olarak ifade eden V. longisporum) veya boyama teknikleriyle (örneğin, 5-bromo-4-kloro-3-indoksil-N-asetil-beta-d-glukozaminid (X-beta-D-Glc-Nac)¹⁸) kullanarak kökteki mantar yayılımını görselleştirin.

5. Plastik bardaklarla organize edilmiş steril in vitro aşılama sistemi

NOT: Bu tekniğin ilk açıklamasında belirtildiği gibi¹⁹, tüm ekipman ve ortamların mikropsuz olduğundan ve tüm adımların laminer bir akış başlığında gerçekleştirildiğinden emin olun.

1. Toplam hacmi 500 mL olan şeffaf plastik kaplar kullanın ve bunları en az 20 dakika boyunca% 70-75 etanol banyosunda sterilize edin. Bardakları laminer akış davlumbazında kurulayın.
2. Otoklavlanmış ortamı (bkz. adım 1.4) plastik bardaklara dökün. İsteğe bağlı olarak, bakteriyel kontaminasyonları önlemek için otoklavlanmış ortama sefotaksim (50 mg / L'lik son konsantrasyon) ekleyin. Arabidopsis ile yapılan deneyler için fincan başına 150 mL veya daha büyük bitki türleri (yağlı tohumlu kolza, domates) ile deneyler için daha fazla ortam (fincan başına 250-300 mL) kullanın.
3. Katılaşmadan önce ortama plastik bir tabaka (20 dakika boyunca% 70-75% etanol içinde inkübe edilerek sterilize edilmiş) yerleştirin (Şekil 1B).
   NOT: Bu plastik tabaka, yüzey sterilize edilmiş tohumların yerleştirilmesi için köşelerde dört prefabrik delik içerir. Bu, tohumların ortama erişmesini sağlar. Daha sonra, bu ayırıcı tabaka yaprakların mantar içeren ortama dokunmasını önler, böylece mikroplar yapraklara doğrudan saldıramaz ve kök yolunu almalıdır. Merkezde başka bir delik daha bulunur ve enfeksiyon kanalının kesilmesini sağlar.
4. Ortam katılaştığında, agar'ı prefabrik merkez delikten yaklaşık 1,5 cm derinliğe kadar bir neşterle kesin. Mantar sporlarının daha sonra eklenebileceği bir enfeksiyon kanalı oluşturmak için kesilmiş agar'ı çıkarın.
5. Katılaşmış cildi kesmek için agar ortamını dört küçük delikte bir pipet ucu ile hafifçe çizin (bu, tohumların sulu agar ortamından su emmesini sağlar). Tohumları bir pipet ucu kullanarak daha küçük deliklere yerleştirin.
6. Plastik bardağı ikinci, ters çevrilmiş bir plastik kapla kapatın ve hava geçirgen yapışkan bantla kapatın. Bant gaz değişimine izin vermelidir.
7. 4 °C'de karanlıkta 3 gün tabakalaşmadan sonra, fincan sistemlerini 12 saat ışık / 12 saat karanlık (Arabidopsis, yağlı tohum kolzası) veya 16 saat ışık / 8 saat karanlık koşullar (domates) altında büyüme odalarında 22 °C sabit sıcaklıkta ve% 60 nemde inkübe edin.
8. Aşılama için önerilen bitki yaşını takip edin: Arabidopsis için 21 gün; Yağlı tohumlu kolza için 5-7 gün; Domates için 12 gün.
9. Enfeksiyon kanalına 1 mL konidia çözeltisi (önerilen konsantrasyon: 4 x 10⁵ spor / mL) ekleyerek plantletleri Verticillium ile aşılayın. Kontrol numuneleri hazırlamak için, kanala sporsuz (mikropsuz 1/4 MS ortam) 1 mL sahte çözelti ekleyin.
10. Araştırma sorusuna bağlı olarak aşılamadan sonra analizleri tercih edilen zaman noktalarında gerçekleştirin (burada kullanılan kesin zaman noktaları için şekil açıklamalarına bakın). Aşağıda bazı öneriler verilmiştir.
    1. Her fotoğraf için mesafeyi aynı tutarak yukarıdan bir dijital kamera ile bitkilerin fotoğraflarını çekin. Yaprak alanını ölçün (örneğin, ImageJ²² veya BlattFlaeche^17,19 ile; ölçeği ayarlamak için bardakların uzunluğunu kullanın) ve enfekte olmuş ve kontrol gruplarını karşılaştırın. Hastalık semptomlarının gelişimini kategorilere ayırın (örneğin, daha küçük, daha sarımsı veya nekrotik yapraklar).
       NOT: Arabidopsis'te herhangi bir sap varsa, rozetlerin daha iyi fotoğraflarını çekmek için bunları çıkarın.
    2. Kökleri çıkarın ve enfekte olmuş örneklerden sürgünlerin biyokütlesini (taze ağırlık) tanımlayın ve tartarak kontrol edin. Göreceli taze ağırlığı belirleyin¹⁹.
    3. Moleküler analizler için örnekleri aşağıdaki gibi toplayın.
    4. Arabidopsis: Varsa sapları çıkarın. Tabandaki rozetleri köklerden kesin. Tüm kök materyallerini numuneden çıkardığınızdan ve tüm rozetleri topladığınızdan emin olun. Farklı bitkilerden 4-5 rozeti tek bir numunede birleştirin ve yaprak malzemesini sıvı azotta dondurun.
    5. Kökleri forsepslerle ortamdan dikkatlice çekin, agar kalıntılarını çıkarmak için bir kağıt havluyla bastırın ve darpın ve farklı bitkilerden 4-5 kökü tek bir numunede birleştirin. Hemen sıvı azotta dondurun.
    6. Yağlı tohumlu kolza / domates: Hipokotilden sap segmentlerini kesin (örneğin, 1 cm uzunluğunda; her zaman aynı kök bölgesini alın). 4-5 bitkiden gelen malzemeyi her numunede birleştirin ve sıvı azotta dondurun.
    7. Numuneleri sıvı azotta öğütün. Bitki DNA'sına göre mantar DNA'sı miktarını qPCR yoluyla belirlemek için 100 mg yaprak veya kök materyalinden toplam DNA'yı çıkarın (bkz.¹⁹).
    8. Numuneleri sıvı azotta öğütün, 100 mg bitki materyali alın ve toplam RNA'yı çıkarın. İstila üzerine bitki genlerinin (veya mantar genlerinin) ekspresyonunu belirlemek için qRT-PCR uygulayın (bkz.¹⁹).

6. Saksılarda toprak bazlı aşılama sistemi

1. Substratın köklerden yıkanmasını kolaylaştırmak için toprak ve kumu 3: 1 (toprak: kum) hacimsel oranında iyice karıştırın. Karışımı bir otoklav torbasına dökün. Karışım çok kuruysa, uygun miktarda su ekleyin ve substrata karıştırın. Mikrobiyal kontaminasyonları en aza indirmek için otoklavda 20 dakika boyunca 80 °C'de buharlayın.
   NOT: 80 ° C'nin üzerinde ısıtmaktan kaçının, çünkü bu organik toprak besinlerini etkileyebilir.
2. Saksıları toprak-kum karışımıyla doldurun ve tepsilere aktarın. Tepsilere bir tencerenin yüksekliğinin yaklaşık 1 / 3'ü kadar su ekleyin, böylece toprak-kum karışımı suyla iyice ıslatılır. Ek olarak, ıslak başlangıç koşullarını sağlamak için alt tabakayı bir sprey şişesi ile su püskürtün.
3. Her tencereye 3-4 tohum ekin (Şekil 1C), tohumların birbirlerinden yeterli mesafeye sahip olmasını sağlayın. Çimlenmeyi senkronize etmek için tabakalaşma için 4 ° C'de karanlıkta 3 gün saklayın.
   NOT: Aşılama deneyleri için benzer büyüklükteki bitkilerin seçilmesini sağlayan ve bireysel farklılıklardan kaynaklanan sapmaları azaltan fazla bitki yetiştirin.
4. Fidelerin düzenli sulama ile uzun gün koşullarında (16 saat ışık / 8 saat karanlık; 22 ° C sabit sıcaklık; % 60 nem) büyümesine izin verin.
5. Aşılama için önerilen bitki yaşını takip edin: Arabidopsis için 21 gün, yağlı tohumlu kolza için 7 gün ve domates için 10 gün. "Kök daldırma aşılaması" nı gerçekleştirmek için benzer büyüklükteki bitkileri seçin15,17,23,24. Toprağı saksılardan çıkarın ve kökleri dikkatlice kazın.
6. Sadece kökleri bir su kabında nazikçe yıkayın ve rozetleri sudan uzak tutun. Yıkanmış kökleri Verticillium spor çözeltisi içeren bir Petri kabında 60 dakika boyunca inkübe edin (önerilen konsantrasyon: 2 x 10⁶ spor / mL). Enfekte olmayan kontrol grubu için, kökleri sporsuz sahte çözeltide 60 dakika boyunca inkübe edin (mikropsuz 1/4 MS ortamı).
7. Kumsuz, nemli, buharla sterilize edilmiş toprakla (20 dakika boyunca 80 °C) yeni saksılar hazırlayın. Her tencerede toprağın ortasında bir delik açmak için bir pipet ucu kullanın.
8. Kökleri doğrudan deliğe yerleştirin (saksı başına sadece bir bitki aktarın). Kökleri yerleştirdikten sonra, delikleri dikkatlice toprakla doldurduğunuzdan emin olun. Toprağa basmaktan kaçının, aksi takdirde saksılama mor yapraklar gibi stres semptomlarına neden olabilir.
9. Enfekte ve kontrol gruplarını uzun gün koşullarında (16 saat ışık / 8 saat karanlık; 22 ° C'lik sabit bir sıcaklık; % 60 nem) düzenli sulama ile yetiştirin.
10. Araştırma sorusuna bağlı olarak aşılamadan sonra analizleri tercih edilen zaman noktalarında gerçekleştirin (burada kullanılan kesin zaman noktaları için şekil açıklamalarına bakın). Aşağıda bazı öneriler verilmiştir.
    1. Yukarıdan bir dijital kamera ile bitkilerin fotoğraflarını çekin, mesafeyi her fotoğraf için aynı tutun. Yaprak alanını ölçün (örneğin, ImageJ²² veya BlattFlaeche^17,19 ile; ölçeği ayarlamak için saksıların çapını kullanın) ve enfekte olmuş ve kontrol gruplarını karşılaştırın. Hastalık semptomlarının gelişimini kategorize edin (örneğin, daha küçük, daha sarımsı veya nekrotik yapraklar)¹³.
       NOT: Arabidopsis'in saplarını çıkarmak, rozetlerin fotoğrafını çekmeyi kolaylaştırır.
    2. Kökleri çıkarın ve enfekte olmuş örneklerden sürgünlerin biyokütlesini (taze ağırlık) tanımlayın ve tartarak kontrol edin. Göreceli taze ağırlığı belirleyin¹⁹.
    3. Alternatif olarak, bitki boyunu ölçün veya hastalık şiddetini değerlendirmek için kök segmentlerinden mantar büyümesini kategorize edin¹³.
    4. Aşağıdaki gibi moleküler analizler için örnekler toplayın.
    5. Arabidopsis: Sapları çıkarın. Rozetleri kök tacında kesin. Farklı bitkilerden 4-5 rozeti tek bir numunede birleştirin. Yaprak malzemesini sıvı azotta dondurun.
       NOT: Kökler söz konusu olduğunda, yıkama yoluyla gen ekspresyonunu yeniden programlamadan onları topraktan yeterince temizlemek zordur.
    6. Yağlı tohumlu kolza / domates: Hipokotilden sap segmentlerini kesin (örneğin, 1 cm uzunluğunda; her zaman aynı kök bölgesini alın). 4-5 bitkiden gelen malzemeyi tek bir numunede birleştirin ve sıvı azotta dondurun.
    7. Numuneleri sıvı azotta öğütün. Bitki DNA'sına göre mantar DNA'sı miktarını qPCR yoluyla belirlemek için 100 mg yaprak veya kök materyalden toplam DNA'yı çıkarın (bkz.¹⁹).
    8. Numuneleri sıvı azotta öğütün, 100 mg bitki materyali alın ve toplam RNA'yı çıkarın. İstila üzerine bitki genlerinin (veya mantar genlerinin) ekspresyonunu belirlemek için qRT-PCR uygulayın (bkz.¹⁹).

7. Verilerin analiz edilmesi

1. Biyolojik kopyalara dayanarak ortalama ve standart sapmayı (± SD) hesaplayın.
2. Enfekte gruptan gelen tüm sonuçları kontrolün sonucuna bölerek göreceli değerleri hesaplayın. Ortalamayı örneğin "alaya göre" veya "vahşi türe göre" olarak görüntüleyin.
3. Gruplar arasındaki istatistiksel anlamlılığı belirler.

Şekil 1: Üç aşılama sisteminin ve protokollerdeki bireysel adımların derlenmesi. Bu rakamlar, Arabidopsis thaliana model tesisi ile sistemleri göstermektedir. Diğer bitki türleri için zamanlama ayarlanmalıdır. Turuncu kutular, ilgili sistemle sonraki analizlerin en çok önerildiği vurgulanır. (A) Petri tabaklarındaki aşılama sistemi^{için 17}, ortamı dökün ve katılaşmasına izin verin. Tabakları gece boyunca buzdolabında saklayın. Daha sonra, üst üçte birini ve enfeksiyon kanalını (IC) bir neşterle kesin ve çıkarın (resimdeki beyaz alanlar agardan çıkarılırken, mavimsi alanlar agar'ı temsil eder). Tohumları kesilmiş yüzeye yerleştirin ve Petri bulaşıklarını kapatın. Tabakalaşmadan sonra, plakaları dikey olarak yerleştirin ve bitkilerin büyümesine izin verin. Köklerin çoğu enfeksiyon kanalına ulaştığında, spor solüsyonunu bir pipetle doğrudan kanala ekleyin. Çözümün eşit olarak dağıtıldığından emin olun. Petri tabaklarını kapatın ve bir büyüme odasında dikey olarak inkübe edin. İzlenebilecek yaklaşımlar kantitatif ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) ile ekspresyonel analiz, muhabir çizgileri ile mikroskopi ve mikrobiyal DNA'nın nicelleştirilmesidir. (B) Plastik kaplar^19'daki aşılama sistemi için, ortamı dökün ve ayırıcı plastik tabakayı prefabrik deliklerle (tohumları yerleştirmek için köşelerde dört küçük delik ve enfeksiyon kanalı için merkezde bir büyük delik) aktarın. Ortamın katılaşmasına izin verin. Enfeksiyon kanalını (IC) elde etmek için orta delikteki agar ortamını bir neşterle kesin ve çıkarın. Ortamı daha küçük deliklerde çizin ve tohumları aktarın. Bardağı ters çevrilmiş bir bardakla kapatın ve hava geçirgen bantla kapatın (sarı renkle sembolize edilir). Bitkilerin büyümesine izin verin. Aşılama için, spor çözeltisini bir pipetle doğrudan enfeksiyon kanalına ekleyin. Sistemi kapatın ve büyüme odasında ekime devam edin. İzlenebilecek yaklaşımlar, qRT-PCR ile ekspresyonel analiz, mikrobiyal DNA'nın nicelleştirilmesi ve taze ağırlık, yaprak alanı veya diğer hastalık özelliklerinin belirlenmesidir. (C) "Kök daldırma aşılaması"^15,17,23,24: toprak bazlı aşılama sistemi için^, saksıları bir toprak: kum karışımı ile doldurun. Tohumları aktarın ve fidelerin büyümesine izin verin. Benzer büyüklükteki bitkileri kazın ve kökleri suda yıkayın. Yıkanmış kökleri, çözeltiyi sporlarla birlikte tutan bir Petri kabına yerleştirin. Kuluçkadan sonra, topraklı saksılara tek bitkiler yerleştirin. İzlenebilecek yaklaşımlar, qRT-PCR'li yapraklarda ekspresyonel analiz, mikrobiyal DNA'nın nicelleştirilmesi ve taze ağırlık, yaprak alanı veya diğer hastalık özelliklerinin belirlenmesidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokolü takiben, bitkiler V. longisporum ( suş Vl4325) veya V. dahliae (izole JR218) ile yetiştirildi ve aşılandı. Etkinliği kanıtlamak ve verilen protokollerin bazı yeteneklerini vurgulamak için çeşitli senaryolar tasarlanmıştır. Temsili sonuçlar gösterilir.

Antimikrobiyal indol-glukozinolat (IG) biyosentezinde rol oynayan genlerin ekspresyonel indüksiyonu, Verticillium enfeksiyonunun değerlendirilmesi için güvenilir bir göstergedir17,19,26. Arabidopsis'te MYB51 (MYB domain proteini 51; AT1G18570), IG biyosentezi için gerekli olan genlerin aktivasyonunda rol oynayan bir transkripsiyon faktörünü kodlar27. MYB51, V. longisporum 26 veya Phytophthora parasitica26 ve Fusarium oxysporum21 gibi diğer toprak kaynaklı mantarlar tarafından köklerde sürekli olarak indüklendiği için başarılı istilayı gösteren bir belirteç geni olarak işlev görebilir. Petri kabı bazlı sistemde aşılamadan iki gün sonra (2 dpi), Arabidopsis'in köklerinde MYB51'in indüksiyonu görselleştirildi. Muhabir bitki hattı BaloMYB51::YFP21, bir promotör aktivasyonunu açıkladı ve bir qRT-PCR analizi, bu genin önemli bir transkripsiyonel indüksiyonunu doğruladı (Şekil 2A-B). Bu tür deneyler, enfeksiyon sırasında köklerdeki ekspresyonel değişiklikleri belirlemeyi amaçlamaktadır.

Bu çalışmada kullanılan Verticillium türleri vasküler bir yaşam tarzı sergilediğinden ve kökten sürgüne ksilem damarları aracılığıyla yayıldığından, mantar DNA'sının miktarı yapraklarda mantar yayılım derecesi için bir parametre olarak belirlenebilir. Arabidopsis, plastik bardaklarda in vitro sistemde kök aşılandı ve rozetler 12 gün sonra hasat edildi. Sahte kontrolde tespit edilen arka plan değeri ile karşılaştırıldığında, enfekte olmuş bitkilerin yapraklarında önemli miktarda mantar DNA'sı bulunmuştur (Şekil 2C). Bu, enfeksiyonun başarıyla ilerlediğini gösterir. Daha ileri incelemeler için, kök savunma tepkileri hakkında fikir edinmek için mantar DNA'sının miktarı farklı bitki genotiplerinde ölçülebilir. Ek olarak, işaretleyici genin qRT-PCR yoluyla indüksiyonunu test etmek için bu zaman noktasında kökler toplandı. MYB51 transkript bolluğu önemli ölçüde zenginleştirildi (Şekil 2D). Bu da duyarlılık testlerinin ve ekspresyonel analizlerin fincan sistemine paralel olarak kolaylıkla yapılabileceğini göstermektedir ki bu da bu işlemin büyük avantajını vurgulamaktadır.

Diğer model bitki türlerinin de tanıtılabileceğine dair kanıtlar eklemek için, yağlı tohumlu kolza plastik kaplarda sistemde V. longisporum ve V. dahliae ile domates ile enfekte edilmiştir. Köklerde aşılamadan sonraki 12. günde, mantar DNA'sının miktarı, fidelerin tabanında kesilen kök segmentlerinde ölçülmüştür (Şekil 2E-F). Mantar DNA'sı, her iki bitki türünde de patojenlerin bitki içindeki yayılımını gösteren tespit edilebildi. Yine, savunma mekanizmaları hakkında bilgi edinmek için farklı bitki genotipleri test edilebilir.

İlgilenilen kök kolonize edici mikrop köklerden yapraklara yayılmazsa, yapraklardaki mikrobiyal DNA miktarını hastalık şiddeti için bir parametre olarak ölçmek mümkün değildir. Hastalığın şiddetini ölçmek için başka bir seçenek, konakçıdaki semptomların değerlendirilmesi ve ekstrapolasyonudur. Bunu örneklemek için Arabidopsis, toprak bazlı sistemde V. dahliae ile kök daldırma aşılanmış ve yeşil yaprak alanı değerlendirilmiştir (Şekil 2G-H). Alaycı muamele görmüş bitkilerin rozetleri sağlıklı ve yeşil görünürken, patojenle enfekte olmuş bitkilerin yaprak boyutu ve sarımsı ve hatta nekrotik yaprakları azaldı. Bu şekilde, farklı bitki genotiplerinin duyarlılığı, örneğin taze ağırlığın ölçülmesiyle analiz edilebilir ve doğrulanabilir.

Şekil 2: (A,B) Arabidopsis kökleri Petri çanağı sisteminde V. longisporum ile aşılandı. Balo MYB51::YFP 21 muhabir hattı, sahte kontrole kıyasla enfekte köklerde MYB51 promotörünün güçlü bir aktivasyonunu ortaya çıkardı (2 dpi'de mikroskopi; ölçek çubuğu: 50 μm). Wildtype (WT) köklerde MYB51'in transkripsiyonel indüksiyonu qRT-PCR analizi (2 dpi) ile daha da doğrulandı. Enfekte numunelerin değerleri sahte numunelere göre verilir (1 olarak ayarlanır) (n = 5; ± SD). (C) V. longisporum yoluyla sistemik kolonizasyon: Cup sisteminde Arabidopsis kökleri aşılandıktan sonra, yapraklardaki fungal DNA'nın nispi miktarı kantitatif PCR (qPCR; 12 dpi) ile belirlendi. Enfekte numunelerin değerleri, sahte numunelerde arka plan seviyesine göre verilir (1 olarak ayarlanır) (n = 3; ± SD). (D) V. longisporum ile enfekte olmuş ve alaycı muamele görmüş kökler fincan sisteminden toplandı ve qRT-PCR analizi yapıldı. Enfekte numunelerin değerleri sahte numunelere göre verilir (1 olarak ayarlanır) (n = 3; ± SD). MYB51'in transkripsiyonel olarak indüklendiği bulundu (12 dpi). (E) Yağlı tohum kolza fincan sisteminde V. longisporum ile aşılandı ve kök segmentlerinde (12 dpi) qPCR ile fungal DNA'nın göreceli miktarı ölçüldü. Enfekte numunelerin değerleri, sahte numunelerde arka plan seviyesine göre verilir (1 olarak ayarlanır) (n = 3; ± SD). (F) Domates fincan sisteminde V. dahliae ile aşılandı ve mantar DNA'sının göreceli miktarı kök segmentlerinde (12 dpi) qPCR ile ölçüldü. Enfekte numunelerin değerleri, sahte numunelerde arka plan seviyesine göre verilir (1 olarak ayarlanır) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis, toprak bazlı sistemde V. dahliae ile aşılanmış kök daldırma idi ve enfekte olmuş ve alaycı muamele görmüş bitkilerin temsili resimleri gösterildi (21 dpi). Yeşil yaprak alanı incelendi. Alaya göre (1'e ayarlanmış), enfekte olmuş bitkiler daha az yeşil yaprak alanına sahipti (n = 5; ± SD). (B-F,H) Astar çiftleri için bkz.19; istatistikler: öğrencinin alaya göre t-testi, * p≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.