Method Article

DNA Fiber Testi Kullanılarak İnsan Hücrelerinde Replikasyon Sonrası Boşlukların Birikmesi ve Onarımının Tespiti

DOI:

10.3791/63448

⸱

February 3rd, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, 2Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, lezyon indüksiyonundan sonra DNA'nın kopyalanmasında tek sarmallı DNA boşluklarını araştırmak için DNA lif testinin iki modifikasyonunu açıklıyoruz. S1 fiber testi, ssDNA'ya özgü S1 endonükleazı kullanarak replikatif sonrası boşlukların tespit edilmesini sağlarken, boşluk doldurma testi, boşluk onarımının görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine izin verir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA lifi testi, insan hücrelerinde DNA sentezi sırasında dahil edilen nükleotid analoglarının immüno-tespitine dayanan replikasyon çatal dinamiklerinin analizi için basit ve sağlam bir yöntemdir. Bununla birlikte, bu teknik birkaç bin kilobazlık sınırlı bir çözünürlüğe sahiptir. Sonuç olarak, birkaç yüz baz kadar küçük replikatif tek sarmallı DNA (ssDNA) boşlukları standart tahlil ile tespit edilemez. Burada, özellikle ssDNA'yı parçalayan bir enzim olan S1 nükleazını kullanan DNA lifi testinin modifiye edilmiş bir versiyonunu açıklıyoruz. Post-replikatif ssDNA boşluklarının varlığında, S1 nükleazı boşlukları hedefleyecek ve parçalayacak ve devam eden çatallardaki ssDNA boşlukları için bir okuma olarak kullanılabilecek daha kısa yollar üretecektir. Bu post-replikatif ssDNA boşlukları, hasarlı DNA süreksiz olarak çoğaltıldığında oluşur. Genom replikasyonundan ayrılan mekanizmalarla, boşluk doldurma veya replikatif onarım sonrası onarım olarak bilinen bir süreçte onarılabilirler. Boşluk doldurma mekanizmaları S fazından bağımsız DNA sentezini içerdiğinden, DNA lifi etiketleme şemasındaki değişiklikler de boşluk doldurma olaylarını izlemek için kullanılabilir. Toplamda, DNA lifi testinin bu modifikasyonları, insan hücrelerinin genomunda replikatif sonrası boşlukların nasıl oluştuğunu ve doldurulduğunu anlamak için güçlü stratejilerdir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seminal çalışmalar, bakteri1 ve insan hücrelerinde DNA'ya zarar veren ajanlarla tedavi üzerine post-replikatif tek sarmallı (ssDNA) boşlukların biriktiğine dair kanıtlar sağlamıştır 2,3. Hasarlı DNA şablonlarının replikasyonu sırasında, DNA sentez makinesi, spesifik translezyon sentezi DNA polimerazları kullanarak veya şablon anahtarlama mekanizmaları yoluyla lezyonları atlayabilir. Alternatif olarak, replizom daha sonra onarılmak üzere geride bir ssDNA boşluğu bırakarak lezyonu atlayabilir. Daha yakın zamanlarda, bir çalışma, genotoksik ajanlarla tedavinin, replikasyon ara ürünlerinin spesifik yapısını görselleştirmek için elektron mikroskobu kullanılarak ökaryotlarda ssDNA boşluklarına yol açtığını açıkça göstermiştir4. Post-replikatif boşlukların bu bölgelerinin oluşumunun başlangıçta DNA replikasyonu2'nin yarı-süreksiz modunun basit bir sonucu olduğu öne sürüldü. Bu durumda, geciken iplikçik üzerindeki bir lezyon bir Okazaki parçasının uzamasını engelleyebilir, ancak çatal ilerlemesi doğal olarak bir ssDNA boşluğunun arkasında kalan aşağıdaki Okazaki parçası tarafından kurtarılır. Bununla birlikte, daha ileri çalışmalar, ilk olarak bakteri5'te gösterildiği gibi, öncü iplikçik üzerinde boşluk oluşumunun da mümkün olduğunu göstermiştir. Ökaryotlarda, primaz aktivitesine sahip benzersiz bir DNA polimeraz olan PRIMPOL'ün, azarlama aktivitesi 6,7,8,9,10,11 yoluyla bir replikasyon bloke edici lezyonun DNA sentezini yeniden başlatabildiği gösterilmiştir. Bu nedenle, PRIMPOL primaz aktivitesi, insan hücrelerinde DNA'ya zarar veren bir ajanla tedavi edildiğinde önde gelen iplikçikte post-replikatif ssDNA boşluklarının oluşumunu açıklayabilir12. Bununla birlikte, bu boşlukların tespiti ve boşluk onarımı, yakın zamana kadar, elektron mikroskobu4 veya plazmid bazlı tahliller13 gibi dolaylı veya zaman alıcı yaklaşımlar gerektiriyordu. İnsan hücrelerindeki boşlukları tespit etmek için ssDNA'ya özgü S1 nükleazın kullanılması, kırk yıldan daha uzun bir süre önce, sakkaroz gradyan teknikleri 2,3 kullanılarak yapılan erken çalışmalarla öncülük etmiştir. Daha yakın zamanlarda, grubumuz DNA lifi ve kuyruklu yıldız tahlilleri14 gibi diğer yöntemleri kullanarak DNA'nın kopyalanmasında (post-replikatif boşluklar) ssDNA'yı tespit etmek için bu nükleazın kullanımını uyguladı. Bu yeni yaklaşımlar, replikatif sonrası boşluklar üzerine yapılan çalışmaların mevcut artışının yolunu açtı. Burada, DNA fiber testi ile replikatif ssDNA boşluklarını tespit etmek için S1 nükleaz kullanma stratejisini açıklıyoruz ve DNA fiber protokolündeki bir diferansiyel etiketleme şemasının bu boşlukların onarımının incelenmesine nasıl izin verebileceğini açıklıyoruz.

DNA lifi testi, giderek artan sayıda laboratuvar tarafından kullanılan ve replikasyon çatalı dinamikleri ve replikasyon stres tepki mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlayan güçlü bir tekniktir. Kısaca, bu teknik, nükleotid analoglarının (CldU -5-kloro-2'-deoksiüridin- ve IdU -5-iyodo-2'-deoksiüridin gibi) replikasyon DNA'sına sıralı olarak dahil edilmesine dayanmaktadır. Hasattan sonra, hücreler lize edilir ve DNA molekülleri pozitif kaplı bir cam slayt üzerine yayılır. CldU ve IdU daha sonra floresan mikroskopta iki renkli lifler olarak görselleştirilebilen spesifik antikorlar tarafından tespit edilir. Son olarak, IdU ve CldU yollarının uzunlukları, DNA hasarı indüksiyonunun bir sonucu olarak DNA replikasyon dinamiklerindeki herhangi bir değişikliği tanımlamak için ölçülür. Bu teknik, çatal durma, çatal yavaşlama, yeni ortaya çıkan DNA bozulması ve15,16 orijin ateşleme sıklığındaki değişiklikler gibi farklı fenomenleri araştırmak için kullanılabilir.

DNA lifi testinin bir sınırlaması, birkaç kilobazın çözünürlüğüdür. Post-replikatif ssDNA boşlukları yüzlerce baz aralığında olabileceğinden, bu boşlukları doğrudan standart DNA fiber protokolü ile görselleştirmek imkansızdır. Genotoksik ajanlarla tedavi edilen insan hücrelerinde DNA'nın kopyalanmasında ssDNA boşluklarının varlığı daha önce dolaylı olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, ssDNA bağlayıcı proteinin, replikasyon proteini A'nın (RPA) S fazı dışındaki hücrelerde işe alınması veya alkali DNA çözülmesi ile tespit edilen ssDNA oluşumunun DNA lifi testi ile uzun süreli çatal durdurma yokluğu ile birlikte değerlendirildiği gibi ssDNA'nın gözlemlenmesi 12,17,18,19,20,21 ssDNA boşluklarının birikmesine bağlanmıştır. Ek olarak, post-replikatif ssDNA boşlukları, ATR'ye bağımlı bir G2 / M faz kontrol noktasını indükler ve replikasyon zehirleri 18,19,20,21,22 ile muamele edilmiş hücreleri durdurur.

S1 nükleaz, 5'-fosforil mono- veya oligonükleotidleri serbest bırakan tek sarmallı nükleik asitleri bozar ve RNA'ya kıyasla ssDNA'ya 5 kat daha yüksek bir afiniteye sahiptir. Çift sarmallı nükleik asitler (DNA: DNA, DNA: RNA veya RNA: RNA), aşırı yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığı durumlar dışında S1 nükleazına karşı dirençlidir. S1 nükleazı ayrıca bir çentik, boşluk, uyumsuzluk veya döngünün neden olduğu tek sarmallı bölgede çift sarmallı DNA'yı parçalar. Bu nedenle S1 nükleazı, ssDNA boşluklarını parçalayabilen ve sonuçta çift sarmallı kırılmalar üretebilen ssDNA'ya özgü bir endonükleazdır23,24. Böylece, DNA fiber protokolüne S1 nükleaz sindirimi için adımlar eklenmesi, dolaylı olarak replikatif sonrası ssDNA boşluklarının tespit edilmesini sağlar. Boşlukların varlığında, DNA yayılmadan önce maruz kalan çekirdeklerin S1 nükleazı ile muamele edilmesi, doğal olarak boşluk14'te bulunan ssDNA'nın S1 bölünmesinin bir sonucu olarak daha kısa yollar üretecektir. Buna göre, yol kısaltması, bu yaklaşımı kullanarak ssDNA boşlukları için okumadır. Standart DNA lif protokolü ile karşılaştırıldığında, S1 nükleaz içeren DNA lifi sadece iki ekstra adım gerektirir: çekirdeklere maruz kalma (hücre geçirgenliği) ve S1 nükleaz ile tedavi. Genotoksik ajanla tedavi edilen ancak S1 nükleazı olmayan örnekler ve genotoksik ajan olmadan S1 nükleazı ile muamele edilen örnekler gibi uygun kontrollerin zorunlu olduğunu belirtmek önemlidir. Analogların dahil edilmesi, S1 tedavisi ve yayılması da dahil olmak üzere protokolün kendisi bir günde gerçekleştirilebilir ve istisnai malzeme gerektirmez. Sadece timidin analogları, saflaştırılmış S1 nükleaz, uygun birincil ve ikincil antikorlar ve bir floresan mikroskop gerektirir. Genel olarak, S1 nükleazını kullanan DNA lifi, nispeten basit bir yaklaşım kullanarak devam eden replikasyon çatallarındaki ssDNA boşluklarını tespit eder.

Replikasyon stres tepki mekanizmalarının bir sonucu olarak oluşan post-replikatif ssDNA boşlukları, boşluk doldurma veya replikasyon sonrası onarım (PRR) adı verilen bir süreçte, translezyon DNA sentezi veya şablon değiştirme dahil olmak üzere farklı mekanizmalarla onarılabilir (veya doldurulabilir)25. Bu süreçler, replikasyondan bağımsız DNA sentezi14,26,27'yi içeren ilerleyen çatalların arkasında gerçekleşir. Bu bulgulara dayanarak, G2 fazındaki boşluk doldurma olaylarını doğrudan14,16,26,28 görselleştirmek için standart DNA lif testinden farklı bir etiketleme şeması gerçekleştirilebilir. Spesifik olarak, bir timidin analoğu, genotoksik tedavi ve replikatif sonrası ssDNA boşluk oluşumu sırasında replikasyon çatalını etiketlemek için kullanılabilirken, başka bir timidin analoğu boşluk doldurma olaylarını etiketlemek için kullanılabilir. Bu protokolde, hücreler 1 saat boyunca genotoksik tedaviden hemen sonra veya eşzamanlı olarak ilk timidin analoğu (örneğin IdU) ile etiketlenir, böylece ortaya çıkan DNA boşluk oluşumu sırasında etiketlenir. Nokodazol, G2 / M'deki hücreleri tutuklamak için 12-24 saat arasında herhangi bir yerde tedaviye eklenir ve aşağıdaki S fazını önler. Nokodazol tedavisinin son 4 saati için, boşluk doldurma sırasında dahil edilecek ortama ikinci bir timidin analoğu (örneğin CldU) eklenir. Daha da önemlisi, bu tahlil sadece G2'deki boşluk doldurma olaylarını tespit etmek için kullanılabilir, çünkü CldU'dan gelen boşluk doldurma sinyali, CldU'nun S fazında DNA'yı çoğaltmaya dahil olması nedeniyle bir sinyalden ayırt edilemez. Bu nedenle, arka plan sinyalini en aza indirmek için, hasar indüksiyonundan sonra CldU birleşmesinin zamanlaması, hücre popülasyonunun çoğunun G2 faz14'e girdiği zamana denk gelmelidir. Bu nedenle, bu zamanlama hücre hattına ve tedavi koşullarına bağlı olarak değişecektir. Bu tahlili kullanmadan önce hücre döngüsü ilerlemesini optimize etmeniz önerilir. Bu timidin analoglarının birlikte boyanması, ssDNA boşlukları oluşturulduğunda genotoksik tedavi sırasında sentezlenen yeni ortaya çıkan DNA'nın (IdU yolları) üstünde boşluk doldurma (PRR) yollarının (CldU yamaları) görselleştirilmesine izin verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma insan hücrelerini kullandığından, çalışma São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Etik Kurulu tarafından (ICB-USP, onay numarası #48347515.3.00005467) insan örnekleriyle yapılan araştırmalar için onaylanmıştır.

NOT: Burada açıklanan protokoller önceki yayınlarda 14,16,28 gibi küçük değişikliklerle kullanılmıştır. Burada odak noktası, DNA'ya zarar veren bir ajan olarak ultraviyole ışık C'nin (UVC) kullanılmasıdır. Bununla birlikte, sisplatin ve hidroksiüre gibi diğer DNA zarar verici ajanlar da başarıyla kullanılmıştır28. Bu protokol, U2OS, HEK293T, insan fibroblastları ve diğerleri 14,28,29 dahil olmak üzere bir dizi hücre hattında gerçekleştirilebilir. Bu protokolü gerçekleştirmeden önce deneysel sorunun belirlenmesi esastır. S1 nükleaz ile DNA lifi testi (bundan böyle S1 Fiber olarak anılacaktır), replikatif sonrası ssDNA boşluklarının varlığını tespit etmek için kullanılırken, boşluk doldurma (veya PRR) testi, G2 fazındaki boşluk doldurma olaylarını ölçmek için gerçekleştirilir. Bu nedenle, post-replikatif ssDNA boşluklarının varlığını analiz ederse, araştırmacı bölüm 2'yi (S1 Fiber deney düzeneği) gerçekleştirmeli ve doğrudan protokolün bölüm 4'üne (yayılarak DNA lifi preparatı) ilerlemelidir. Boşluk doldurma olaylarını analiz ediyorsanız, araştırmacı doğrudan bölüm 3'e (Boşluk doldurma (PRR) deney düzeneği) geçmelidir.

1. Reaktifler ve kurulum

  1. Timidin analogları: 5-İyodo-2'-deoksiüridin (IdU) ve 5-Kloro-2'-deoksiüridin (CldU) 1 N NH4OH'de 100 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar yeniden askıya alın. Analogları steril bir şırınga filtresi (0.2 μm), aliquot ile filtreleyin ve -20 C'de saklayın.
  2. Antikorlar: Primerler - anti-BrdU sıçan (Biorad) ve anti-BrdU fare (BD); İkinciller - sıçan karşıtı Alexa Fluor 488 ve fare karşıtı Alexa Fluor 594.
  3. S1 Fiber için hücresel geçirgenlik CSK100 tamponu: Damıtılmış H 2 O'ya 100 mM NaCl, 10 mM MOPS [pH 7], 3 mM MgCl2 [pH7.2], 300 mM sakkaroz ve% 0.5 Triton X-100 ekleyin.
  4. S1 nükleaz tamponu [pH 4.6]:H2O'ya 30 mM Sodyum Asetat [pH 4.6], 10 mM Çinko Asetat, 50 mM NaCl ve% 5 Gliserol ekleyin.
    NOT: S1 nükleaz tamponunun nihai pH'ı 4.6 olmalıdır, çünkü S1 aktivitesi pH > 4.9'da %50 düşer.
  5. Aliquot ve -20 ° C'de saklayın A. oryzae'den saflaştırılmış S1 nükleaz, üretici tarafından sağlanan S1 nükleaz seyreltme tamponunda önceden seyreltilir.
  6. DMSO'daki nokodazol, boşluk doldurma için 2 mM'lik son konsantrasyona yeniden oluşturun. Tahlil.
  7. Lizis tamponu: H 2O'ya 200 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM EDTA ve %0,5 SDS ekleyin.
  8. Fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.
  9. PBS'ye %0,1 Tween-20 ekleyerek PBS-T'yi hazırlayın.
  10. PBS'de% 5 Sığır Serum Albümini (BSA) hazırlayın.
  11. PBS'de %0,1 BSA hazırlayın.
  12. PBS-T'ye %1 BSA ekleyerek PBS-T-BSA'yı hazırlayın.
    NOT: 510 nm dalga boyu ve 42 nm bant genişliğine sahip cıva veya ksenon lambalı bir epifloresan mikroskop ve 510 nm dalga boyu ve 42 nm bant genişliğine sahip GFP (FITC, Alexa Fluor 488) emisyon filtresi ve 624 nm dalga boyu ve 40 nm bant genişliğine sahip Texas Red (Alexa Fluor 594) emisyon filtresi veya yeşil floresanı (510 ile 560 nm arasında algılanır) algılamak için 488 nm çizgi (mavi) lazerli bir konfokal mikroskop ve kırmızı floresanı algılamak için 561 nm çizgi (sarı) lazer kullanın ( 575 ila 680 nm arasında tespit edildi). Daldırma hedefi (40x, 63x veya 100x).

2. S1 Fiber deney düzeni (2 gün)

  1. 1. Gün: Her hücre hattı için 4 kuyucuk plakası: ± UVC ve ± S1 nükleazı% 70-90 oranında hücrelerle birleştirin.
    NOT: Deney, 12 delikli bir plaka kadar küçük bir formatta yapılabilir. Bu durumda, tüm çözeltiler 0,5 mL/kuyuda kullanılır.
  2. 2. Gün: Önceden ısıtılmış (37 °C) hücre kültürü ortamında 20 μM'de taze IdU ve 200 μM'de CldU hazırlayın.
  3. Kültür ortamını aspire edin ve hemen 20 μM IdU ile ortamı ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de (hücre inkübatörü) tam olarak 20 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) PBS ile iki kez hızlı bir şekilde yıkayın.
  5. Hücreleri 20 J/m2 UVC ile ışınlayın. Tedavi edilmemiş hücreleri denetim olarak kullanın.
  6. Ortamı hemen 200 μM CldU ile ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de (hücre inkübatörü) tam olarak 60 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: IdU ve CldU etiketlemesi değiştirilebilir, ancak ikinci analogun konsantrasyonu ilk analogdan 5-10 kat daha yüksek olmalıdır. Analog inkübasyonun zamanlaması, kullanılan genotoksik ajana uyarlanabilir, ancak ikinci analog inkübasyonun zamanı, boşluk oluşumu için yeterli süreyi sağlayacak kadar uzun olmalıdır14,16. DNA'ya zarar veren bir ilaç kullanıyorsanız, ilacı CldU 28,29,30 ile birlikte ekleyin.
  7. Hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) PBS ile iki kez yıkayın.
  8. CSK100 tamponu ile hücreleri oda sıcaklığında (RT) 8-10 dakika geçirgenleştirin.
    NOT: Başarılı geçirgenlik, yalnızca çekirdeklerin gözlemlenebilir olması gereken parlak alan mikroskobu altında kontrol edilebilir.
  9. Çekirdekleri PBS ile dikkatlice yıkayın (sadece birkaç saniye boyunca her bir kuyucuğun kenarından 0,5 mL dökün).
  10. Çekirdekleri S1 tamponuyla dikkatlice yıkayın (sadece birkaç saniye boyunca her bir kuyucuğun kenarından 0,5 mL dökün).
  11. Çekirdekleri S1 nükleaz (20 U / mL) ile S1 tamponu ile veya 37 ° C'de (hücre inkübatörü) 30 dakika boyunca (kontrol olarak) olmadan inkübe edin.
  12. S1 arabelleğini aspire edin ve PBS'ye %0,1 BSA ekleyin.
  13. Çekirdekleri kazıyın ve uygun şekilde açıklanmış 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpleri her zaman buz üzerinde tutun.
    NOT: Çekirdeklerin başarılı bir şekilde ayrılması, parlak alan mikroskobu altında kontrol edilebilir.
  14. Çekirdekleri peletleyin: 4 ° C'de 5 dakika boyunca ~ 4600 x g'de santrifüj.
    NOT: Standart DNA lifi testinden farklı olarak, çekirdekler sayılamaz, bu nedenle kaplanan hücrelerin ilk sayısını göz önünde bulundurun. Alternatif olarak, geçirgenliğe maruz kalmayan ekstra bir kuyu, bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak hücre sayısını tahmin etmek için kullanılabilir.
  15. Peletleri PBS'de ~ 1500 hücre / μL konsantrasyonunda iyi bir şekilde askıya alın, tüpleri buz üzerine yerleştirin ve hemen yayılarak DNA lifi preparatına devam edin (bölüm 4) protokolü

3. Boşluk doldurma (PRR) deney düzeni (3 gün)

  1. 1. Gün: Her hücre hattı için Plaka 2 kuyusu: ~% 70 akıcılıkta hücrelerle UVC ±.
  2. 2. Gün: Önceden ısıtılmış (37 °C) hücre kültürü ortamında 20 μM'de taze IdU hazırlayın.
  3. Hücreleri 20 J/m2 UVC ile ışınlayın.
  4. Ortamı hemen 20 μM IdU ile ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de (hücre inkübatörü) tam olarak 60 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) PBS ile iki kez yıkayın.
  6. Medyayı derhal 200 ng / mL nokodazol ile ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de (hücre inkübatörü) 12-24 saat boyunca inkübe edin (bu adımın zamanlaması deneyler arasında tutarlı tutulmalıdır).
    NOT: Nokodazol konsantrasyonunun, kullanılan hücre hattına göre uyarlanması gerekebilir. Genotoksik bir ilaç kullanıyorsanız, hücreleri IdU ± ilacı28 ile inkübe edin.
  7. 3. Gün: Kültür ortamını aspire edin, ortamı 20 μM CldU + nokodazol ile ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de (hücre inkübatörü) nokodazol tedavisinin son 4 saati için inkübe edin.
  8. Hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) PBS ile yıkayın.
  9. Tripsin ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 ° C'de,% 5 CO 2'de (hücre inkübatörü)1-2 dakika inkübe edin.
  10. Aynı hacimdeki hücre kültürü ortamını ekleyin ve hücreleri (media + tripsin) uygun şekilde açıklanmış 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın. Tüpleri her zaman buz üzerinde tutun.
  11. Bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
  12. Hücreleri peletleyin: 4 ° C'de 5 dakika boyunca ~ 350 x g'de santrifüj.
  13. Süpernatantı çıkarın ve PBS'deki hücreleri ~ 1500 hücre / μL'de yeniden askıya alın. hücreleri buz üzerinde tutun ve protokolü hemen yayarak DNA lifi hazırlığına başlayın (Gün 3 veya 4).

4. Yayılarak DNA lifi hazırlanması (12 slayt için ~ 1 saat)

  1. Mikroskop slaytlarına bir karbon kalemle açıklama ekleyin ve bunları bir tepsiye düz bir şekilde yerleştirin.
  2. Homojenizasyonu sağlamak için tüpün altına dokunun.
  3. İlgili slaydın üstüne 2 μL hücre ekleyin.
    NOT: Biri slaytın üstüne, diğeri slaydın ortasına olmak üzere iki damla eklenebilir.
  4. Lizis tamponunun 6 μL'sini ekleyin ve hücreleri yaklaşık 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek lize edin (kabarcık yapmaktan kaçının).
  5. Pipet ucuyla damlayı slaydın altına doğru biraz çekin (damlanın yayılma yolunu yönlendirmek için).
  6. Çekirdekleri lize etmek için RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: Lizis tamponunun hacmi ve lizis süresi, lizat çok çabuk kurursa veya alternatif olarak yeterince kurumazsa ayarlanabilir. Lizis tamponu hacmi 5-7 μL arasında değişebilir ve zamanlama 4-10 dakika arasında düşebilir.
  7. Slaytı yaklaşık 20-40° 'ye eğin ve damlanın slaytın altına sabit ve düşük bir hızda yayılmasına izin verin.
  8. Slaytın karanlıkta RT'de kurumasını bekleyin (10-15 dakika).
  9. Sabitleme çözeltisini taze olarak hazırlayın: Metanolü karıştırın: 3: 1 oranında buzul asetik asit.
  10. Slaytları sabitleme çözeltisini içeren bir kavanoza batırın ve DNA'yı slaytlara sabitlemek için RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    DİKKAT: Metanol oldukça toksiktir ve kimyasal bir başlık altında tutulmalıdır. Uygun bir kaba atın.
  11. RT'deki slaytları karanlıkta kurutun ve lekelenene kadar ışıktan korunan 4 °C'de saklayın.

5. DNA liflerinin immün boyanması (~ 6 saat)

  1. Slaytları PBS ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  2. RT'de 40-60 dakika boyunca taze hazırlanmış 2.5 M HCl ile DNA'yı denatüre edin.
    DİKKAT: 2,5 M HCl hazırlamak için, suya asit dökün ve asla tam tersini yapmayın. Bu ekzotermik bir reaksiyondur, bu yüzden hafifçe ısınır.
  3. Slaytları PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  4. % 5 BSA'lı blok (üç kullanıma kadar 20 ° C'de saklanabilir), daha önce 37 ° C'de 37 ° C'de 30-60 dakika ısıtılır.
  5. Bir kağıda hafifçe dokunarak fazla sıvıyı slaytlardan çıkarın.
  6. Slaytlara damla damla (fare anti-BrdU 1/20 (IdU için) ve sıçan anti-BrdU 1/100 (CldU için) damla damla damla ekleyin ve üstüne bir örtü parçası yerleştirin. RT'de karanlık, nemli bir odada 1-1,5 saat inkübe edin.
  7. Slaytları 1-2 dakika boyunca PBS'li bir kavanoza yerleştirin, ardından kapak kapaklarını dikkatlice çıkarın.
  8. PBS-T ile bir kavanozda 5 dakika boyunca üç kez yıkayın, ardından slaytları PBS'ye yerleştirin.
  9. Bir kağıda hafifçe dokunarak fazla sıvıyı çıkarın.
  10. Slaytlara damla damla 30 μL ikincil antikor (anti-fare Alexa Fluor 594 ve anti-sıçan Alexa Fluor 488 1/75'te seyreltilmiş) ekleyin ve üstüne bir kapak parçası yerleştirin. RT'de karanlık, nemli bir odada 45-60 dakika kuluçkaya yatırın.
  11. Slaytları 1-2 dakika boyunca PBS'li bir kavanoza yerleştirin, ardından kapak kapaklarını dikkatlice çıkarın.
  12. PBS-T ile bir kavanozda 5 dakika boyunca üç kez yıkayın, ardından slaytları PBS'ye yerleştirin.
  13. Bir kağıda hafifçe dokunarak fazla sıvıyı çıkarın.
  14. Kızaklara damla damla montaj reaktifinin 20 μL'sini ekleyin ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin. Kabarcıklardan kaçının.
  15. Slaytları karanlıkta RT'de kurumaya bırakın, ardından 4 ° C'de (veya daha uzun koruma için -20 ° C'de) saklayın.

6. Görüntü yakalama ve analiz (numune başına ~ 1 saat)

NOT: Her iki protokol için de bir epifloresan mikroskobu kullanılabilir. Bununla birlikte, boşluk doldurma (PRR) testi için, görüntülerin artan çözünürlüğü için konfokal mikroskop kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

  1. Slaytın üst kısmına hücrelerin lize edildiği yere bir damla daldırma yağı (mikroskopa özgü) yerleştirin ve arka planda yeşil noktaları arayarak yeşil kanalı kullanarak odağı bulun (40x, 63x ve 100x hedefleri kullanılabilir).
  2. Liflerin ana konsantrasyonunu bulun ve resimler için bölgeleri seçmek ve potansiyel önyargılardan kaçınmak için yalnızca bir kanal kullanarak iyi yayılmış örtüşmeyen bireysel lifleri bulmak için kenarlara gidin.
  3. Yeşil ve kırmızı kanallardaki tüm slaytın yanında slayt başına yaklaşık 15-20 resim çekin ve iki renkli DNA lifleri elde etmek için iki kanalı birleştirin.
    NOT: Konfokal mikroskop kullanıyorsanız, yüksek çözünürlükte (1024 x 1024 piksel) fotoğraf çekin ve hem kırmızı hem de yeşil floresan için 1'e yakın iğne deliği değerlerini kullanın.
  4. IdU ve CldU trakt uzunluğu ölçümleri için ImageJ (NIH, https://imagej.nih.gov/ij/ tarafından sağlanan ücretsiz yazılım) kullanın.
    1. Bir resmi ImageJ kutusuna sürükleyerek açın.
    2. Uzunluğu mikrometrelere dönüştürmek için mikroskop yazılımı tarafından oluşturulan ölçek çubuğunu (uygun şekilde kalibre edilmiş) kullanın. Sağlanan resimdeki ölçek çubuğunu mikrometreler halinde ölçmek ve piksel cinsinden bir ölçüm elde etmek için ImageJ kutusunda soldan sağa 5. simgeyi seçerek Düz çizgi aracını kullanın. Analiz Et > Set Scale'e tıklayın ve "piksel cinsinden mesafe" yi uygun sayı ve "uzunluk birimi" ile μm olarak değiştirin.
    3. ImageJ kutusunda, soldan sağa 5. simgeye sol tıklayıp ardından yukarıdan aşağıya ikinci seçeneği belirleyerek Segmentlere Ayrılmış Çizgi aracını seçin.
    4. Sol tıklayarak kırmızı (IdU) veya yeşil (CldU) yolun tam yolunu çizin ve sağ tıklayarak çizimi durdurun. Uzunluğu ölçmek için klavyedeki M düğmesine basın.
    5. S1 Fiber için yalnızca kırmızı-yeşil (iki renkli lifler)16'yı analiz edin. Her bir lif için kırmızı ve yeşil yol ölçümlerini takip ederek farklı resimlerden en az 150 liften kırmızı ve yeşil yol uzunluklarını ölçün.
    6. Boşluk doldurma testi için, yalnızca en az 1 CldU (yeşil) yama içeren ancak sürekli CldU boyama içermeyen IdU (kırmızı) yollarının uzunluğunu ölçün. En az 1 CldU yamasıyla farklı resimlerden en az 10-15 IdU yolu alın.
      NOT: Analizler için Zeiss LSM Image Browser gibi başka yazılımlar da kullanılabilir.
  5. S1 Fiberler için, IdU yollarının uzunluğunu, CldU yollarının uzunluğunu ve oranlarını (CldU/IdU veya tam tersi) ayrı grafiklerde medyanlarla dağılım noktası grafikleri olarak çizin.
  6. Boşluk doldurma olaylarını "kilobaz başına yoğunluk" birimleri olarak ölçün, belirli bir IdU (kırmızı) yolu uzunluğu üzerindeki toplam CldU (PRR, yeşil) yama sayısını, kilobazlardaki kırmızı yolun toplam uzunluğuna bölün (1 μm = 2.59 kilobaz31 göz önüne alındığında). Ardından verileri medyanlarla dağılım noktası grafikleri olarak çizin.
  7. Her iki deneyde de, Mann-Whitney (parametrik olmayan test) kullanarak iki örnek arasında ve Kruskal-Wallis kullanarak ikiden fazla örnek arasında istatistiksel analiz yapın ve ardından Dunn'un çoklu karşılaştırma testi izleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S1 Fiber testinde, genotoksik bir ajanla yapılan tedavi, replikatif ssDNA boşluklarına yol açarsa, S1 ile tedavi edilen çekirdeklerden elde edilen DNA liflerinin toplam uzunlukları, DNA hasarı ile tedavi edildiğinde, tedavi edilmemiş örneklere ve genotoksik ajanla tedavi edilen ancak S1 bölünmesine sunulmayan örneklere kıyasla daha kısa olacaktır (Şekil 1).

Alternatif olarak, S1 nükleaz ile tedavi, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla DNA liflerinin uzunluğunu öneml...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standart DNA lif tahlil protokolünün kritik adımları önceki bir yayında tartışıldı32. Burada, post-replikatif ssDNA boşluklarının varlığını araştırmak için standart DNA lif testinin modifiye edilmiş versiyonlarını ve başlangıçta14'te tarif edilen boşluk doldurma ile onarımlarını açıklıyoruz. Post-replikatif ssDNA boşluğu varlığı bağlamında, S1 Fiber protokolünde S1 nükleazın kullanılması, büyük olasılıkla, boşluk oluşumu ve daha sonra tespit için zaman tanımak için en az 1 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.F.M.M. laboratuvarındaki çalışmalar, FAPESP ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO, Hollanda) Uluslararası İşbirliği Araştırması kapsamında Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brezilya, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 ve 2017/05680-0) tarafından desteklenmektedir; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Asetik asit, BuzulSentezi64-19-7Alternatif olarak, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
Amonyum hidroksitSynth1336-21-6Veya benzeri
Antikor anti-fare IgG1 Alexa Fluor 594InvitrogenA11005-Antikor
anti-sıçan Alexa Fluor 488InvitrogenA21470-Antikor
Fare anti-BrdUBecton Disckson347580-Antikor
Sıçan anti-BrdUAbcam  Ab6326-Biyolojik
güvenlik başlığıPachanePA 410Laboratuvarda bulunan kullanım başlığı
BSA (Sığır Serum Albümini)Sigma-AldrichA3294Veya benzeri
Hücre sıyırıcıThermo Scientific179693Veya benzeri
CldUMillipore-SigmaC6891-Cloridric
acidSynth7647-01-0Veya benzer
Konfokal Zeiss LSM Serisi (7, 8 veya 9)Zeiss-Veyabenzeri
Kapak camı (veya lameller)Thermo Scientific152460Alternatif olarak, Olen - Kasvi Kapak Camı (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - Yüksek GlikozLGC/GibcoBR30211-05/12100046Kullanılan hücre hattına özel kültür ortamını kullanın.
EDTA (Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat)Sigma-AldrichE5314Veya benzeri
Epifloresan Mikroskobu Axiovert 200Zeiss-Veyabenzeri
FBS (Fetal Sığır Serumu)Gibco12657-029Veya benzeri
Forma Serisi II Su Ceketli CO2 İnkübatörüThermo Scientific 311013-998-074İçinde bulunan hücre inkübatörünü kullanın laboratuvar
Cam sürgülü kavanozSigma-AldrichS5516Veya benzeri
GliserolSigma-Aldrich56-81-5Veya benzeri
IduMillipore-SigmaI7125-Magnezyum
KlorürSynth7791-18-6Veya benzeri
MetanolMerck67-56-1Veya benzeri
Mikroskop slaytlarıDenvilleM1021Alternatif olarak, Olen - Kasvi Mikroskop Slaytları - K5-7105 VEYA< / güçlü> Hassas Cam Hattı - 7105-1
MOPS (&Akut; Cido 3-morfolinopropano 1-Sülf ve OSRİK; nico)Synth1132-61-2Veya benzeri
NocodazoleSigma-Aldrich31430-18-9-PBS
(Fosfat Tampon Salin)Yaşam Teknolojileri3002Veya benzeri
Penisilin-StreptomisinGibco15140122Veya benzeri
ProLong Gold AntiFade MountantInvitrogenP36930için herhangi bir antifade moutant çözümü immünofloresan kullanılabilir
Aspergillus oryzaeInvitrogen18001-016'danS1 nükleazını (1/100 - 1/200) üretici tarafından sağlanan S1 nükleaz seyreltme tamponunda önceden seyreltin, aliquote ve -20 °C'de saklayın; C
SDS (Sodyum Dodesil Sülfat)BioRad161-0302Veya benzeri
Sodyum Asetat TrihidratSigma-Aldrich6131-90-4Veya benzeri
Sodyum KlorürSentezi  7647-14-5Veya benzeri
SükrozSigma-Aldrich57-50-1Veya benzeri
Tris BaseWest Lab ResearchBP152-1Veya benzeri
Triton X-100Synth9002-93-1Veya benzeri
TripsinGibco25200072Veya benzeri
Tween 20Sigma-AldrichP1379Veya benzeri
UVC LambasıSpesifikOlmayan-Gerekli: 254 nm emisyon uzunluğu
VLX-3W UV RadyometreVilber Loumart-Veyabenzeri
Çinko AsetatSigma-Aldrich557-34-6Veya benzeri
saflaştırılmış

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
  2. Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
  3. Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
  4. Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
  5. Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
  6. Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
  7. García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
  8. Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
  9. Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
  10. Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
  11. Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
  12. Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
  13. Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  14. Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
  15. Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  16. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  17. Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
  18. Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
  19. Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
  20. Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071(2014).
  21. Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
  22. Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
  23. Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
  24. Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
  25. Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
  26. Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
  27. Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
  28. Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
  29. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  30. Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
  31. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  32. Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255(2011).
  33. Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
  34. Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
  35. Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
  36. Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
  37. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  38. Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833(2016).
  39. Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Fiber AssayReplication Fork DynamicsPost Replicative GapsS1 NucleaseSingle Stranded DNAGap Filling AssayDNA Replication StressGenome IntegrityImmunodetection MethodDNA Damage Repair

Related Articles