Yöntem makalesi

Filamentöz Cyanobacterium Phormidium lacuna'nın Doğal Transformasyonu, Protein İfadesi ve Kriyokorunumu

DOI:

10.3791/63470

⸱

1 Şubat 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phormidium lacuna , deniz kaya havuzlarından izole edilmiş filamentli bir siyanobakteridir. Bu makalede filamentlerin doğal kaynaklardan izolasyonu, DNA ekstraksiyonu, genom dizilimi, doğal transformasyon, sfGFP ekspresyonu, kriyokonservasyon ve motiliteye yöntemleri anlatılmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siyanobakteriler, güneş enerjisinin biyokütle üretimi için kullanıldığı temel araştırma ve biyoteknolojik projelerin odak noktasıdır. Phormidium lacuna, yeni izole edilmiş bir filamentli siyanobakteridir. Bu makalede, yeni filamentli siyanobakterilerin deniz kaya havuzlarından nasıl izole edilebileceği açıklanmaktadır. Ayrıca DNA'nın filamentlerden nasıl çıkarılabileceğini ve genomların nasıl sıralanabileceğini de açıklar. Birçok tek hücreli tür için transformasyon kurulmuş olmasına rağmen, filamentli siyanobakteriler için daha az sıklıkla bildirilmektedir. P. lacuna'nın doğal dönüşümü için basitleştirilmiş bir yöntem burada açıklanmaktadır. P. lacuna, doğal dönüşümün kurulduğu Oscillatoriales düzeninin tek üyesidir. Bu makale aynı zamanda süper klasör yeşil floresan proteinini (sfGFP) eksprese etmek için doğal dönüşümün nasıl kullanıldığını göstermektedir. Endojen bir cpcB promotörü, Synechocystis sp. PCC6803'ten cpc560, A2813 veya psbA2 promotörlerinden yaklaşık 5 kat daha güçlü ekspresyonu indükledi. Ayrıca, P. lacuna ve Synechocystis sp.CPP 6803'ün kriyoprezervasyonu için bir yöntem oluşturulmuş ve sıvı bir ortamda ve agar ve plastik yüzeylerde hareketliliği değerlendirmek için yöntemler tanımlanmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siyanobakteriler, fotosentezi bir enerji kaynağı olarak kullanan prokaryotik organizmalardır 1,2. Araştırmalar giderek siyanobakteriyel türlere odaklanmaktadır. Birkaç siyanobakteri DNA3 ile dönüştürülebilir. Genler bu türlerde nakavt edilebilir veya aşırı eksprese edilebilir. Bununla birlikte, dönüşüm birkaç türle sınırlıdır 4,5,6,7,8,9,10,11 ve kültür koleksiyonlarından veya vahşi <....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Doğal çevreden izolasyon

NOT: Yeşil algler, diatomlar, filamentli siyanobakteriler ve diğer mikroalgler izole edilebilir. Protokol, laboratuvar koşullarında yetişen kaya havuzlarından herhangi bir mikroalg türü için kullanılabilir. Oscillatoriales'e ait filamentli siyanobakteriler, hareketleri ve filamentli şekilleri ile kolayca tanınabilir. Türler, genom dizilimi veya 16S rRNA dizilimi ile yarı saf bir durumda tanımlanabilir.

  1. Sıvı deniz suyu örneklerini deniz kaya havuzlarından (yani kayalık kıyıdaki boşluklardan) 50 mL şişelere aktarın. Her şişe için, doğal kaynağın tam yerini veya koordinatlarını not edin. M....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda belirtilen yöntemler izlenerek 5 farklı P. lacuna suşu kaya havuzlarından izole edilmiş ve sıralanmıştır (Şekil 1 ve Tablo 1). P. lacuna HE10JO hariç tüm kültürler ~ 1 yıllık alt kültürlemeden sonra sterildi. Bu suş hala bir deniz bakterisi olan Marivirga atlantica ile kirlenmiştir. Sonraki Helgoland gezileri sırasında, diğer filamentli siyanobakteriler, P. lacuna'dan farklı olan ve karakterize edilmesi gereken kaya havuzlarından .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kültür koleksiyonlarından birçok siyanobakteri suşu mevcut olmasına rağmen 32,33,34,35,36, vahşi doğadan yeni siyanobakterilere hala talep vardır, çünkü bu türler belirli özelliklere uyarlanmıştır. P. lacuna kaya havuzlarından toplandı ve tuz konsantrasyonlarının ve sıcaklığın30 varyasyonlarına uyarlandı. Bu türün suşları 2008,.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma Karlsruher Teknoloji Enstitüsü tarafından desteklendi.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Otoklav 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 Tatlı Su ÇözeltisiSigma AldrichC3061
BG-11 ortaMerck73816-250ML
Borik asitMerck10043-35-3H3< / sub>BO3< / sub>
Kalsiyum klorür dihidratCarl Roth10035-04-8CaCl2 & orta nokta; 2 H2O
Hücre kültürü şişeleri Cellstar, filtre vidalı kapaklı, steril, 250 mLGreiner658190
Hücre kültürü şişeleri Cellstar, filtre vidalı kapaklı, steril, 50 mLGreiner601975
Santrifüj LYNX 4000Thermo Scientific75006580ve rotor
13.000 rpm'ye kadarmicrostar 17VWR InternationalN/A
Setiltrimetilamonyum Bromür (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
Kloroform : İzoamil Alkol 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
Kobalt(II) klorür hekzahidratMerck7791-13-1CoCl2 & orta nokta; 6 H2O
Bakır(II) sülfat pentahidratMerck7758-99-8  CuSO4 ve orta nokta; 5 H < alt > 2 < / alt > O
D (+) - BiotinCarl Roth58-85-5  C10H16N2O3S
DNA merdiveni 1 kbNew England BiolabsN3232
DNA merdiveni 100 bpNew England BiolabsN3231
Elektrikli pipetleme yardımı accujet-pro S BrandGmbH26360pipetleme için 1-25 mL
EtanolVWR64-17-5C2H6O
Etilendiamin tetraasetik asit disodyum tuzu dihidratCarl Roth6381-92-6EDTA-Na2 ve orta nokta; 2 H2O
Floresan mikroskobu ApoTomeZeiss
Floresan mikroskobu Axio Imager 2Zeiss
Fransız Basınç Hücresi PresiAmerikan Enstrüman ŞirketiN/A
Jel dokumasyon Sistemi Saffe GörüntüInvitrogen
Gelelctrophoresis sistemi Mupid-One/-exuADVANCED
Züccaciye, farklı
GliserolCarl Roth56-81-5C3H8O<>3
Demir(III) klorür hekzahidratMerck10025-77-1&nbsp; FeCl3 ve orta nokta; 6 H2O
KanamisinSigma-Aldrich25389-94-0
Kanamisin sülfatCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodyum Tuzu (Sarkosil)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 & orta nokta; Na
LB Et Suyu (Lennox)Carl RothX964.4
Işık kaynağı, floresan tüp L18W/954 gün ışığıOSRAMsiyanobakteri yetiştiriciliği
Işık kaynağı, LED panel XL 6500K 140 WBloom StarN/A1.000 & mikroya kadar siyanobakteri yetiştiriciliği; mol m-2 s-1
Magnezyum klorür hekzahidratCarl Roth7791-18-6MgCl2 & orta nokta 6 H < alt > 2 < / alt >O
Manganez (II) klorür tetrahidratServa13446-34-9MnCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta; 4 H < alt > 2 < / alt >O
Mikroskop DM750Zeiss
Midi hazırlık plazmid ekstraksiyon kiti NucleoBond Xtra Midi kitiMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Hızlandırılmış kayıt içinmini bilgisayar Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YD
Oküler kamera EC330 saniyeye kadar sürekli kayıt içinLeica
Oküler kamera MikrOkular Full HDBresserhızlandırılmış kayıtlar için, Raspberry Pi mini bilgisayarına bağlı
Petri kapları polistirol, 100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
Petri kapları polistirol, 60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
Fotometre Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Fotometre Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1.000 & mikro; LGilsonSKU: FA10006M
Pipetman 10-100 ve mikro; LGilsonSKU: FA10004M
Plastik pipetler 10 mL, sterilGreiner607107
Plastik tüp, steril, 15 mLGreiner188271
Plastik tüp, steril, 50 mLGreiner227261
Potasyum bromürCarl Roth7758-02-3KBr
Potasyum klorürCarl Roth7447-40-7KCl
Güç kaynağı Statron 3252-1Statron Gerä tetechnik GmbH
Güç kaynağı Voltcraft PPS 16005Maxwell'den LED
Elektronik 16 miRNA Doku Kiti AS1470
Q5 polimerazNew England BiolabsM0491S
Sıralama kiti NextSeq 500/550 v2.5Illumina
Sıralama sistemi NextSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010Heidolph Yetiştirme Aletleri
Sodyum asetatCarl Roth127-09-3NaCH3COO
Sodyum klorürCarl Roth7647-14-5NaCl
Sodyum dihidrojen fosfat monohidratCarl Roth10049-21-5NaH2PO4 · H2O
Sodyum florürCarl Roth7681-49-4NaF
Sodyum hidrojen karbonatCarl Roth144-55-8NaHCO3
Sodyum molibdat dihidratServa10102-40-6Na2MoO4 & middot; 2 H2O
Sodyum nitratMerck7631-99-4NaNO3
Sodyum sülfatCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Stronsiyum klorür hekzahidratCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
Tiamin hidroklorürMerck67-03-8C12H17ClN4OS ve orta nokta; HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Ultrasonik cihaz UP100H sonotrot MS3Hielscher Ultrason TeknolojisiUP100H
Ultraturrax Sessiz Kırıcı MHeidolph Instrumentshomojenizatör
ÜreCarl Roth57-13-6CH4N2O
Vitamini B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
Vitamin çözeltisi0.3 ve mikro; M tiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM siyanokobalamin
Su İmtilatörleri, Su arıtmaVEOLIA su teknolojileriELGA_21001
Çinko sülfat heptahidratSigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
software, URL < / strong>
gatb-minia DNA montajıiçin programhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline, kısa DNA okumalarından büyük iskeleler yapar,
ImageJyazılımı (piksel yoğunlukları, daire çapı)
RAST açıklama sunucusuhttps://rast.nmpdr.orggirişi: genom DNA dizisi, açık okuma çerçevelerini algılar, protein dizilerini ve işlevlerini
Kültür ortamı
Yapay deniz suyu0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2, 9 mM  KCl, 2,4 mM NaHCO3 ,0,84 mM KBr, 0,49 mM H3BO3, 90 & mikro; M SrCl2, 72 & M NaF
f/2 -sıvı ortamyapay deniz suyu, % 0.1 (h / h) eser element çözeltisi, % 0.05 (h / h) vitamin çözeltisi, 0.88 mM NaNO3< / alt>, 36 & mikro; M NaH2PO4 
f/2+ sıvı ortamf/2-orta, 10 kat artırılmış NaNO3 ve NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 &mikro; M NaH2< / sub>PO4< / sub>
f/2+< / sup>-agar% 3 (a/h) bacto agar, yapay deniz suyu, % 0.1 (h / h) eser element çözeltisi, % 0.05 (h / h) vitamin çözeltisi, 8.8 mM NaNO< alt > 3 < / alt >, 0.36 mM NaH 2< / alt >PO< alt >4< / alt >
f / 2-agar% 3 (a / h) bacto agar, yapay deniz suyu, % 0.1 (h / h) eser element çözeltisi,% 0.05 (h / h) vitamin çözeltisi, 0.88 mM NaNO3< / alt>, 36 & mikro; M NaH < alt > 2 < / sub > PO < alt > 4 < / sub>
eser element çözeltisi0.36 mM NaH < alt > 2 < / sub > PO < < >/ alt >, 12 ve mikro; M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4, 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 ve mikro; M MnCl2
Vitamin çözeltisi0.3 &mikro; M tiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM siyanokobalamin
santrifüj Proteinaz K Promega MC500C için Conrad immage işleme için Linux tabanlı listeler

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evalua....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Filaman z SiyanobakterilerKriyoprezervasyon Y ntemiDNA EkstraksiyonuFloresan MikroskopiHareketlilik AnaliziKanamisin DirenciPromot r Kar la t rmas

İlgili makaleler