Yöntem makalesi

Yarı İletken Tabanlı Yeni Nesil Dizileme Platformunda Anöploidi için İmplantasyon Öncesi Genetik Test

2.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63493

⸱

17 Ağustos 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Protokol, yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme platformunda anöploidi için implantasyon öncesi genetik testlerde gerekli olan genel laboratuvar içi prosedürleri sunar. Burada tüm genom amplifikasyonunun, DNA fragmanı seçiminin, kütüphane yapımının, şablon hazırlamanın ve dizileme çalışma akışının ayrıntılı adımlarını temsili sonuçlarla sunuyoruz.

Özet

Yeni nesil dizileme, genetik varyantların belirlenmesinde klinik uygulamada giderek daha fazla önem kazanmıştır. İmplantasyon öncesi genetik testte, bu tekniğin ölçeklenebilirlik, verim ve maliyet açısından benzersiz avantajları vardır. Anöploidi analizi için implantasyon öncesi genetik test için, burada sunulan yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme (NGS) sistemi, yapısal genetik varyantları minimum 8 Mb çözünürlükte belirlemek için kapsamlı bir yaklaşım sunmaktadır. Örnek alımından nihai rapora kadar, çalışma süreci protokollere sıkı sıkıya bağlı kalarak birden fazla adım gerektirir. Çeşitli kritik adımlar amplifikasyonun sonucunu, kütüphanenin kalitesini, okumaların kapsamını ve verilerin çıktısını belirleyebildiğinden, kelimeler dışında görsel gösterim içeren açıklayıcı bilgiler, tüm kritik adımların sonuçları üzerinde büyük bir etkisi olabilecek işlem ve manipülasyon için daha fazla ayrıntı sunabilir. Burada sunulan yöntemler, biyopsi yapılan Trofektoderm (TE) hücrelerinin tüm genom amplifikasyonunda (WGA), genomik kütüphane yapımında, sıralayıcı yönetiminde ve son olarak kopya numarası varyantlarının raporlarının oluşturulmasında yer alan prosedürleri gösterecektir.

Giriş

Anöploidi, bir veya daha fazla ekstra kromozomun varlığı veya bir veya daha fazla kromozomun yokluğu ile kromozom sayısındaki anormalliktir. Bir X kromozomunun kaybı (Turner sendromu), otozom 21 (Down sendromu), 13 (Patau sendromu) ve 18 (Edwards sendromu) trizomileri gibi otozomların ekstra kopyaları veya 47, XXY (Klinefelter sendromu) ve 47, XXX (Triple X sendromu) gibi ekstra cinsiyet kromozomları gibi bir tür anöploidi taşıyan embriyolar, doğum kusurları1 ile terim olarak hayatta kalabilir. Anöploidi, ilk trimester düşüklerinin ve in vitro fertilizasyon (IVF) başarısızlığının birincil nedenidir2. IVF pratiğinde anöploidi oranının doğal siklus ve ilaçlı kontrol grubunun farklı yaş katmanları boyunca %25.4-%84.5 arasında değişebileceği bildirilmektedir3.

Yeni nesil dizileme teknolojisi, genetik bilginin klinik olarak belirlenmesinde çılgınca uygulanmaktadır; verimlilik ve yüksek verim ile genom dizisine pratik erişim sağlar. Özellikle, yeni nesil dizileme, genetik faktörlere sahip bozuklukların teşhisinde ve genomdaki anormallik testlerinde de devrim yarattı4. Biyo-reaksiyon dizilemedeki kimyasal sinyalleri doğrudan dijital verilere aktarmak için yarı iletken dizileme teknolojisini kullanan yarı iletken tabanlı dizileme sistemi, verileri 3-7 saat 5,6'da sıralamak için doğrudan, gerçek zamanlı bir algılama sağlar.

Bir IVF prosedüründe, implantasyon öncesi genetik test (PGT), IVF sonucunu iyileştirmek ve yenidoğanlarda genetik bozukluk riskini azaltmak için uterusa transfer edilmeden önce embriyonun genetik profilini araştırır 1,7. PGT'de NGS teknikleri ile kombine edildiğinde, 10'dan az hücreden ekstrakte edilen genetik materyal, tüm genom amplifikasyon kitleri veya bağımsız olarak geliştirilmiş bir bütün genom amplifikasyon reaktifi ile çoğaltılır. Bu, amplifikasyon aşamasında sadece bir adım gerektirir ve tüm genom amplifikasyon ürünlerini elde etmek için ön amplifikasyon gerektirmez. Kopya numarası varyantı ve özel gen lokus dizilimi için astarlar veya paneller tasarlanmış ve oluşturulan kütüphanede uygulanmıştır.

NGS'de implantasyon öncesi genetik test-anöploidi (PGT-A) tipik bir iş akışı seri prosedürleri içerir ve laboratuvar personelinin yoğun bir iş yükünü gerektirir8. Prosedürün geri alınmasına neden olan bazı yanlış işlemler, laboratuvarın hem zamanının hem de kaynaklarının istenmeyen şekilde kaybedilmesine neden olabilir. PGS-NGS iş akışı için kısa ve net bir standart çalışma prosedürü (SOP) yararlıdır; ancak, sözcük biçimindeki protokoller, bir video protokolünde görselleştirilebilen örnek işleme, cihaz manipülasyonu ve enstrümanların ayarları hakkında daha ayrıntılı bilgi sunamaz. Bu makalede, çalışma detayının görselleştirilmiş bir gösterimi ile birleştirilmiş doğrulanmış bir iş akışı, yarı iletken bir sıralama platformunda PGT uygulamasında daha doğrudan ve sezgisel yönlendirme protokolleri sunabilir.

Buradaki protokol, paralel olarak 16 embriyo biyopsisine kadar parti yapılmasını destekleyen bir yöntemi açıklamaktadır. Daha büyük partiler için, Reproes-PGS gibi yarı iletken dizileme için ticari kit tabanlı bir protokol kullanılması önerilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada uygulanan tüm protokoller ve trofektoderm (TE) biyopsisi (1.1.1.1 bölümü) 18 Eylül 2017 tarihinde 924 No'lu hastanenin insan araştırmaları etik kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (NO: PLA924-2017-59). Hastalar/katılımcılar bu çalışmaya katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onamlarını vermişlerdir.

1. İnsan embriyo biyopsisinden DNA izolasyonu ve tüm genomik amplifikasyon

  1. Tüm genom amplifikasyonu için protokol 9,10
    NOT: Pico PLEX WGA Kiti, tüm genom amplifikasyonunu gerçekleştirmek için kullanılır.
    1. Örnek toplama ve depolama
      1. Trofektoderm biyopsisi: Aşağıdaki amplifikasyon için nitelikli miktarda DNA elde etmek için yardımlı kuluçkalamadan sonra D5/6 embriyosunun fıtıklaşmış TE'sinden ortalama altı ila dokuz hücre alın.
      2. Numune hücrelerini 5 μL PBS'de bir PCR tüpüne aktarın.
      3. Protokol doğrudan DNA ekstraksiyonuna geçmezse, örnekleri derhal -80 ° C'de dondurun.
    2. Hücre lizisi
      NOT: Ek Dosya 1, hücre lizisi sırasında ana karışımı hazırlarken ve 1, 8, 16 ve 32 örneklik partilerin tüm genom amplifikasyonu sırasında (pipetleme hatalarını karşılamak için fazla kullanımla) her bileşenin önerilen hacimlerini listeler ve referans görevi görür. Bu protokolün diğer ana karışımlarını formüle ederken, tekrarlanan pipetlemenin neden olduğu bileşen tüketimine uyum sağlamak için her bileşenin hacmi ayrıca artırılır. Tüm kısa santrifüjleme, oda sıcaklığında (RT) 2-10 s için masa üstü mini santrifüjde, 5.300 x g santrifüj kuvveti ile 10.000 sabit RPM'de gerçekleştirilir. Santrifüj kuvveti 2.000 x g ile 12.000 x g arasında olmalıdır.
      1. Hücre lizis karışımını, numune başına ekstraksiyon enzimi seyreltme tamponunun 4.8 μL'si ve hücre ekstraksiyon enziminin 0.2 μL'si ile hazırlayın.
      2. Taze hazırlanmış hücre lizisinin 5 μL'lik pipeti, PCR tüplerindeki her 5 μL hücre örneğine karışır ve tüpü RT'de 5 sn boyunca kısaca santrifüj eder. Tüpü vortekse etmeyin.
      3. Numuneyi bir termal bisikletçide aşağıdaki gibi inkübe edin: 75 ° C, 10 dakika; 95 °C, 4 dk; 25 °C, 14 dk. Kuluçkadan sonra tüpü kısaca santrifüj (5 s) yapın.
    3. Tüm genom DNA'sının ön amplifikasyonu
      1. Ön amplifikasyon karışımını, numune başına 4,8 μL ön amp tamponu ve 0,2 μL ön amplifikatör enzimi ile hazırlayın.
      2. Ön amplifikasyonun 5 μL'lik pipeti, tüpün duvarlarından numune tüplerine karışır ve kısaca 3 sn santrifüj yapar. Ucun tüpün dibine ulaşmasını önleyin ve tüpü vortekse etmeyin.
      3. Numuneyi Tablo 1'de belirtilen termal bisikletçi programına göre inkübe edin.
    4. Tüm genom DNA amplifikasyonu
      1. Numuneyi kısaca 5 sn'lik santrifüj edin ve amper öncesi inkübasyon ürününü buzun üzerine yerleştirin.
      2. Tüm genom amplifikasyon karışımını 25 μL amplifikasyon tamponu, amplifikasyon enziminin 0.8 μL'si ve numune başına 34.2 μL nükleaz içermeyen su ile hazırlayın.
      3. Taze hazırlanmış tüm genom amplifikasyon karışımının 60 μL'sini, 15 μL ön amplifikatör inkübasyon ürünü ile karıştırın; toplam hacmin 75 μL olması gerekir. Ucun tüpün dibine ulaşmasını önleyin ve tüpü vortekse etmeyin.
      4. PCR tüpünü termal bisikletçi üzerine yerleştirin ve Tablo 2'de belirtilen termal bisikletçi programını çalıştırın.
      5. Tüpleri 5 sn'lik kısa bir süre santrifüj edin ve ürünleri yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
      6. WGA ürün konsantrasyonunu bir florometre11 ile ölçün. Numuneler, bir sonraki adıma geçilmediği takdirde geçici olarak -20°C'de 2 aydan daha kısa bir süre saklanabilir.
  2. Bağımsız olarak geliştirilen WGA reaktiflerinin protokolü.
    1. Örnek toplama ve depolama
      1. Aşağıdaki amplifikasyon için yardımlı kuluçkalamadan sonra hücreleri D5/6 embriyosundan çekin.
      2. 1.5 μL PBS içeren numune hücrelerini, 2 μL PBS içeren bir PCR tüpüne aktarın.
        NOT: PBS, Mg2+ ve Ca 2+ içermez.
      3. Doğrudan DNA ekstraksiyon protokolüne geçilmediği takdirde numuneleri hemen -80 ° C'de dondurun.
    2. Hücre lizisi
      1. RT'de hücre lizis tamponunu (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), %1 (v/v) Triton X-100, 5 mM sodyum pirofosfat, 2 mM β-gliserofosfat, %0,1 SDS) eritin ve buzun üzerine yerleştirin. Her numuneye 2 μL hücre lizis tamponu ekleyin ve kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın.
        NOT: Tüpü vortekse etmeyin ve hücreleri veya DNA'yı reaksiyon sisteminden çıkarmamak için pipet ucunun tüpteki sıvı yüzeye temas etmesini önleyin.
      2. Numuneyi bir termal bisikletçide aşağıdaki gibi inkübe edin: 55 °C, 20 dakika; 95 °C, 10 dk; 4 °C, basılı tutun. Tüpü inkübasyondan sonra RT'de 10 sn boyunca kısaca santrifüj edin.
    3. Tüm genom DNA amplifikasyonu
      1. Hücre lizis ürününü kısaca 5 sn'lik santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin.
      2. 16 μL amplifikasyon önceden karıştırılmış çözelti, 1 μL amplifikasyon enzimi ve 28 μL nükleaz içermeyen su ile karıştırarak her numune için tüm genom amplifikasyon karışımını hazırlayın. Yavaşça karıştırın, kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın ve karışımı buzun üzerine yerleştirin. Tüpü vortekse etmeyin.
      3. Pipet, taze hazırlanmış tüm genom amplifikasyon karışımının 45 μL'lik kısmının, adım 1.2.2.2'de hazırlanan hücre lizis ürününe; hafifçe karıştırın ve 5 saniye boyunca kısaca santrifüj yapın.
        NOT: Tüpü vortekse etmeyin ve pipet ucunun tüpteki sıvıya temas etmesini önleyin.
      4. PCR tüpünü termal döngüleyiciye yerleştirin ve programı Tablo 3'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalıştırın.
      5. Tüpleri kısa bir süre 5 sn'lik santrifüj yapın ve ürünleri yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
      6. WGA ürün konsantrasyonunu bir florometre11 ile ölçün ve sonuçları QA (kalite analizi) sayfasına kaydedin. Nitelikli konsantrasyonlara sahip ürünler, bir sonraki adıma geçilmediği takdirde geçici olarak -20 °C'de 2 aydan daha kısa bir süre saklanabilir.

2. Amplifikasyon parçası seçimi

NOT: Bu bölümde kullanılan materyaller Kütüphane Hazırlama Kiti'nde (Malzeme Tablosu) mevcuttur.

  1. Başlamadan önce hazırlık
    1. RT'de 30 dakika boyunca saflaştırma için manyetik boncukları (n x 100 μL) dengeleyin.
    2. Önceki WGA ürününü RT'ye geri yükleyin. Vortex ürünü RT'de 30 saniye boyunca santrifüj etmeden önce.
    3. Taze% 70 etanol hazırlayın.
  2. Parça seçim prosedürü
    1. WGA ürünlerinin pipeti 25 μL'dir ve önceden yüklenmiş 25 μL nükleaz içermeyen su ile 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarılır.
    2. Vorteks yapın ve DNA saflaştırma boncuklarını iyice karıştırın. Aliquot 50 μL her numune tüpüne (orijinal numune: boncuklar (hacim) = 1: 1), vorteks ve santrifüj kısaca (5 s). DNA bağlama işlemi için tüpü RT'de 5 dakika ayarlayın.
    3. 1,5 mL santrifüj tüpünü bir mıknatıs rafına yerleştirin ve tüm manyetik boncuklar tüpün yan duvarına çekilene kadar bekleyin. Süpernatantı dikkatlice yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Boncukları pipetlemekten kaçının.
    4. Orijinal numune hacmine göre, pipet 30 μL (orijinal numune: boncuklar (hacim) = 1:0,6) manyetik boncuk, vorteks ve santrifüj kısaca (5 sn). DNA bağlama işlemi için tüpü RT'de 5 dakika ayarlayın.
    5. 1,5 mL santrifüj tüplerini mıknatıs rafına yerleştirin ve tüm manyetik boncuklar tüpün yan duvarına çekilene kadar 5 dakika bekleyin. Süper natantı dikkatlice çıkarın ve atın. Boncukları pipetlemekten kaçının.
    6. 1,5 mL santrifüj tüpüne 300 μL %70 etanol pipetin, tüpü 180° açıyla iki kez yavaşça döndürün ve iyice yıkamak için boncukları tüp duvarı boyunca hareket ettirin. Pipet takın ve süpernatanı atın. Boncukları pipetlemekten kaçının.
    7. Yıkama prosedürünü bir kez tekrarlayın.
    8. 1,5 mL santrifüj tüpünü mıknatıs rafından çıkarın ve santrifüjü kısa bir süre (5 sn) çıkarın. Tüpleri mıknatıs rafına geri yerleştirin ve tüm manyetik boncuklar tüpün yan duvarına çekilene kadar bekleyin.
    9. Altta kalan sıvıyı dikkatlice pipetleyin. Boncukları RT'de 3-5 dakika kurutmak için tüpü açık tutun. Nemi boncuklardan uzak tutun.
      NOT: Boncuk topağında herhangi bir çatlak ortaya çıkarsa kapağı hemen kapatın.
    10. Tüpleri manyetik raftan çıkarın, DNA elüsyon tamponunun 25-30 μL'sini bir tüpe pipetleyin ve kapağı ve girdabı kapatın. Bulanık sıvıyı tüpün dibine almak için kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın ve tüpü 5 dakika boyunca RT'ye ayarlayın.
    11. Tüpleri manyetik raflara geri yerleştirin ve tüm boncuklar boru yan duvarına çekilene ve süpernatant şeffaf hale gelene kadar bekleyin. DNA çözeltisini dikkatlice yeni 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın. Boncukları pipetlemekten kaçının.
    12. Bir florometre11 ile fragman seçiminden sonra DNA konsantrasyonunu ölçün, -20 ° C'de saklayın. Tipik olarak, seçilen DNA fragmanının konsantrasyonu 1.5-2.4 ng / μL arasında değişmektedir.

3. DNA kütüphanesinin hazırlanması12

NOT: Bu bölümde kullanılan materyaller Kütüphane Hazırlama Kiti'nde (Malzeme Tablosu) mevcuttur.

  1. Onarımı sonlandırma
    1. RT'deki manyetik boncukları 30 dakika boyunca dengeleyin.
    2. Adım 2.2.12'deki parça seçiminin DNA ürününü RT'ye dengeleyin.
    3. DNA son onarım sistemini, 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde 30 μL DNA ürünleri, 10 μL uç onarım tamponu, 0,5 μL uç onarım enzimi ve 9,5 μL nükleaz içermeyen su ile hazırlayın. Tüpü 30 sn vorteks yapın ve tüm sıvıyı tüp tabanına almak için RT'de kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın.
    4. 30 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin ve inkübasyondan sonra tüpü kısaca santrifüj (5 sn) yapın.
    5. Manyetik boncukları vorteks veya tersine karıştırın ve manyetik boncukların 75 μL'sini son onarılmış DNA örnekleri içeren bir tüpe aktarın (orijinal örnek: boncuklar (hacim) = 1: 1.5). Boncukları iyice karıştırmak için pipet veya hafifçe vorteks yapın ve tüm süspansiyonu tüpün dibine kadar döndürmek için kısaca santrifüj (5 sn). DNA bağlama işlemi için tüpü RT'de 5 dakika ayarlayın. Boncukları dağınık tutmak için tüpleri yavaşça çevirin.
    6. Santrifüj tüplerini mıknatıs rafına yerleştirin ve tüm manyetik boncuklar yanak kenara çekilene ve süpernatant şeffaf hale gelene kadar 5 dakika bekleyin. Süper nantantı çıkarın ve pipetleme sırasında tüpleri rafta tutarak boncukları pipetlemekten kaçının.
    7. Yeni hazırlanan% 70 etanolün 300 μL'sini tüplere aktarın, tüpleri 180 ° 'lik bir açıyla iki kez yavaşça döndürün ve iyice yıkamak için boncukları tüp duvarı boyunca hareket ettirin. Pipet takın ve süpernatanı atın. Boncukları pipetlemekten kaçının.
    8. Yıkama prosedürünü bir kez tekrarlayın.
    9. 1,5 mL santrifüj tüplerini mıknatıs rafından çıkarın ve kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın. Tüpleri mıknatıs rafına geri yerleştirin ve tüm manyetik boncuklar tüpün yan duvarına çekilene kadar 5 dakika bekleyin.
    10. Altta kalan sıvıyı dikkatlice pipetle çıkarın. 1,5 mL santrifüj tüplerinin kapağını açın ve boncukları RT'de 3-5 dakika kurutun. Nemi boncuklardan uzak tutun.
      NOT: Boncuk topağında herhangi bir çatlak ortaya çıkarsa kapağı hemen kapatın.
    11. Pipet 33 μL DNA elüsyon tamponunu bir tüpe yerleştirin, kapağı kapatın ve girdap yapın. Bulanık süspansiyonu tüpün dibine getirmek için kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın ve tüpü 5 dakika boyunca RT'ye ayarlayın.
    12. Tüpleri manyetik raflara geri yerleştirin ve tüm boncuklar yanaklara çekilene ve çözelti şeffaf hale gelene kadar bekleyin. DNA çözeltisini, boncukların pipetlenmesini önleyerek uygun etikete sahip yeni 1,5 mL santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın.
  2. Barkod ligasyonu
    1. Tüm donmuş reaktifleri eritmek için barkod ligasyon reaktiflerini adım 3.2.2'de buz üzerine yerleştirin.
    2. Ligasyon sistemini 32 μL son onarımlı DNA ürünleri, 10 μL nükleaz içermeyen su, 5 μL ligaz tamponu, 1 μL ligaz ve 1 μL P1 ile hazırlayın ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne adapte olun. Her bir barkod reaktifinin 1 μL'sini pipetle bir numune için tüpteki çözelti karışımına, 5 sn vortekse ve tüp tabanındaki tüm sıvıyı almak için kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın.
      NOT: Barkodları eklerken, barkod ve numune sayısının karşılık geldiğini onaylayın; barkodların karışık kirlenmesini önlemek için her seferinde yalnızca bir barkod şişesi açın; Eklenen her beş veya altı barkod için eldivenleri değiştirin.
    3. Tüpleri 30 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
    4. Pipet 75 μL (orijinal numune: boncuklar (hacim) = 1:1.5) manyetik boncukların bir tüpe ve pipet veya hafifçe vorteks boncukları iyice karıştırmak için. Tüm süspansiyonu aşağıya doğru döndürmek için kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın ve boncuk kümelenmesini önleyin. DNA bağlama işlemi için tüpü RT'de 5 dakika ayarlayın. Boncukları dağınık tutmak için tüpleri yavaşça çevirin.
    5. Santrifüj tüplerini mıknatıs rafına yerleştirin ve tüm manyetik boncuklar yanak duvara çekilene ve süpernatant şeffaf hale gelene kadar 5 dakika bekleyin. Süpernatantı çıkarın ve pipetleme sırasında tüpleri rafta tutarak boncukları pipetlemekten kaçının.
    6. Yeni hazırlanan% 70 etanolün 300 μL'sini tüplere aktarın, tüpleri 180 ° 'lik bir açıyla iki kez yavaşça döndürün ve iyice yıkamak için boncukları tüp duvarı boyunca hareket ettirin. Pipet takın ve süpernatanı atın. Boncukları pipetlemekten kaçının.
    7. Yıkama prosedürünü bir kez tekrarlayın.
    8. 1,5 mL santrifüj tüplerini mıknatıs rafından çıkarın ve santrifüjü kısa bir süre (5 sn) alın. Tüpleri mıknatıs rafına geri yerleştirin ve tüm manyetik boncuklar tüpün yan duvarına çekilene kadar 5 dakika bekleyin. Altta kalan süpernatantı dikkatlice pipetleyin.
    9. Boncukları RT'de 3-5 dakika kurutmak için tüp kapağını açık tutun. Nemi boncuklardan uzak tutun.
      NOT: Boncuk topağında herhangi bir çatlak ortaya çıkarsa kapağı hemen kapatın.
    10. DNA elüsyon tamponunun 15 μL'lik pipeti, tüpün içine alınır. Boncukların peletini tüpün dibine kadar durulayın, kapağı kapatın ve girdap yapın. Bulanık süspansiyonu tüpün dibine getirmek ve tüpü RT'de 5 dakika sabit tutmak için kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın.
  3. Parça amplifikasyonu
    1. Dondurulmuş reaktif çözündüğünde kütüphane binareaktiflerini buzun üzerine yerleştirin.
    2. Enzim karışımının 47.5 μL'sini ve astar karışımının 2.5 μL'sini, salınımlı DNA ve boncuklar, 5 s'lik vorteks ve tüm sıvıyı tüp tabanına almak için kısa bir süre (5 sn) santrifüj içeren tüpe aktarın.
    3. Tüpü 5 dakika boyunca RT'ye ayarlayın. Tüpleri manyetik raflara geri yerleştirin ve tüm boncuklar yanaklara çekilene ve süpernatant şeffaf hale gelene kadar bekleyin. DNA çözeltisini, etiketleri açıkça işaretlenmiş 0,2 mL PCR tüplerine dikkatlice aktarın ve boncukların pipetlenmesini önleyin.
    4. Numuneyi aşağıdaki programla bir termal döngü setinde inkübe edin: 72°C, 20 dk; 98 °C, 2 dk; 98 °C, 15 sn; 62 °C, 15 sn; 70 °C, 1 dakika (6 döngü); 70 °C, 5 dk. Reaksiyon bittiğinde tüpü kısaca santrifüj (5 sn) ve ürünleri 4 °C'de saklayın.
    5. PCR ürünlerini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın (düşük ataşman). Reaksiyon sona erdiğinde tüpe 97,5 μL (orijinal numune hacmi: boncuklar (hacim) = 1:1,5) manyetik boncuklar, boncukları iyice karıştırmak için pipet veya hafifçe vorteks ekleyin ve tüm sıvıyı tabana doğru döndürmek için kısaca santrifüj (5 sn) ekleyin. Boncuk toplamadan kaçının. Tüpü 5 dakika boyunca RT'ye ayarlayın. Boncukları dağınık tutmak için tüpleri yavaşça çevirin.
    6. Santrifüj tüplerini mıknatıs rafına yerleştirin ve tüm manyetik boncuklar yanak duvara çekilene ve süpernatant şeffaf hale gelene kadar 5 dakika bekleyin. Süper nantantı çıkarın, boncukları pipetlemekten kaçının ve tüpleri rafta sabit tutun.
    7. Yeni hazırlanan% 70 etanolün 300 μL'sini tüplere aktarın, tüpleri 180 ° 'lik bir açıyla iki kez yavaşça döndürün ve iyice yıkamak için boncukları tüp duvarı boyunca hareket ettirin. Pipet takın ve süpernatanı atın. Boncukları pipetlemekten kaçının.
    8. Yıkama prosedürünü bir kez tekrarlayın.
    9. 1,5 mL santrifüj tüpünü mıknatıs rafından çıkarın ve santrifüjü kısa bir süre (5 sn) çıkarın. Tüpü mıknatıs rafına geri yerleştirin ve tüm manyetik boncuklar tüpün yan duvarına çekilene kadar 5 dakika bekleyin. Altta kalan sıvıyı dikkatlice pipetle çıkarın.
    10. Boncukları RT'de 3-5 dakika kurutmak için tüp kapağını açık tutun. Nemi boncuklardan uzak tutun.
      NOT: Boncukların peletinde herhangi bir çatlak ortaya çıkarsa kapağı hemen kapatın.
    11. DNA elüsyon tamponunun 22 μL'lik pipeti tüpe girer, boncukların peletini durulayın ve kapağı ve girdabı kapatın. Bulanık sıvıyı tüpün dibine almak için kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın ve tüpü 5 dakika boyunca RT'ye ayarlayın.
    12. Yapılandırılmış DNA kütüphanesinin konsantrasyonunu bir florometre11 ile ölçün ve inşa edilen DNA kütüphanesini -20 ° C'de saklayın; seçilen DNA parçasının konsantrasyonu 0.6-10 ng / μL arasında değişmektedir. kütüphane bilgilerini kütüphane veritabanında yeniden kodlayın ve örnekleri buna göre saklayın.

4. Sıralama şablonunun hazırlanması13,14

NOT: Bu bölümde kullanılan malzemeler, Sıralama Reaksiyonları Universal Kit'in (Malzeme Tablosu) Şablon Hazırlama Kiti Seti'nde (Reaktifler/Çözeltiler/Malzemeler) mevcuttur.

  1. Kütüphane karışımı
    1. Sunucu sisteminde bir ön çalıştırma kayıt sayfası formunu doldurun ve numune tüpünü kütüphane konsantrasyonu ve barkod numarası ile etiketleyin. Aynı barkodları tek seferde farklı numunelerde kullanmaktan kaçının.
    2. Vorteks yapın ve kütüphane örneğini karıştırın ve kısaca santrifüj yapın (5 sn). Tüm numuneleri nükleaz içermeyen su, 30 sn vorteks ile 100 pM'ye kadar seyreltin ve numuneyi kısaca santrifüj edin.
      NOT: DNA'nın ortalama uzunluğu 260 bp ve 1 bp'nin 660 g/mol olduğu göz önüne alındığında, aşağıdaki denklemi kullanarak ng/μL'nin pM'ye dönüşümünü hesaplayın: 1 ng/μL = 5.827,5 pM/L.
    3. Pipet, 100 pM'lik 10 μL'lik kütüphaneyi 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne, 30 sn'lik vortekse ve 2 sn'lik kısaca santrifüje seyreltir. Karışık kütüphaneyi buz üzerinde tutun.
  2. Şablon hazırlama
    1. Şablon amplifikasyon sistemini başlatın ve temiz programı seçin. Reaksiyon yağını tüpün 1 / 2'sine ekleyin ve emülgatör kırma çözeltisini tüpün 1 / 3'üne ekleyin.
    2. Amplifikasyon plakasının ve yıkama adaptörünün AÇIK konumda ayarlandığını onaylayın. Atık şişesini temizleyin ve atıkları toplamak için yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne bir iğne koyun. Şablon amplifikasyon sisteminin ekranında işlenen adımları onaylayın. Yaklaşık 15 dakika sürecek temiz bir program başlatmak için İLERİ'ye basın.
    3. Temizleme programından sonra amplifikasyon plakasını yenisiyle değiştirin, 150 μL kırma çözeltisi II içeren toplama tüplerini rotora yerleştirin ve köprüyü toplama tüplerinin üzerine yerleştirin. Reaksiyon yağını tüpün 1 / 2'sine ve emülgatör kırma çözeltisini tüpün 1 / 3'üne ekleyin.
    4. PCR reaktif preparatını emülsifiye edin: RT'deki emülsifiye PCR tamponunu çözünene kadar dengeleyin, tüm reaktifleri kısaca santrifüj (5 s) ve kullanmadan önce buzun üzerine yerleştirin.
    5. Emülsifiye PCR enzim karışımının 120 μL'lik pipeti, 100 μL şablon İyon Küresi Parçacığı (ISP'ler) tamponu, 170,5 μL nükleaz içermeyen su ve karışık kütüphanenin 9,5 μL'si (100 pM) 2.000 μL emülsifiye PCR tamponu içeren bir tüpe yerleştirin. Çözeltiyi tekrarlanan pipetleme ile iyice karıştırın.
      NOT: Karışık çözelti, şablon amplifikasyon sistemine 15 dakika içinde yüklenmelidir; RT'deki tüm prosedürleri yerine getirmek.
    6. Numune portalı yukarı doğru olacak şekilde tüp rafına sabit bir şekilde şablon hazırlama için yeni bir filtre yerleştirin. Çözeltiyi 5 sn'lik vorteks, kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın ve 800 μL'yi üç kez tekrar tekrar pipetledikten sonra çözeltiyi filtrenin numune portalına aktarın. Son enjeksiyondan önce kabarcıkları azaltmak için tüpü santrifüj edin. Filtreye hava enjekte etmekten kaçının. Karışık çözeltiyi takiben 200 μL reaksiyon yağı II enjekte edin.
    7. Filtrenin örnek portalını aşağı doğru çevirin ve yıkama uyarlamasını filtreyle değiştirin. Numune iğnesini rotor kapağının orta deliğine yerleştirin ve ardından iğneyi tabana bastırın.
    8. Ekrandaki RUN düğmesine basın, ilgili kite göre programı seçin ve tüm adımları kontrol etmek için ASSISTED tuşuna basın. Çalıştırma başlatılana kadar İLERİ'ye basın; bitmesi yaklaşık 4,5 saat sürer.
    9. Program bittiğinde İLERİ'ye basın; sistem 10 dakikalık bir santrifüjleme başlatacaktır. Santrifüjleme durduğunda, Kapağı Aç düğmesine basın ve toplama tüplerini raflara taşıyın. İşlem 15 dakika içinde bir sonraki adıma geçmezse, yeniden santrifüj yapmak için Son Dönüş'e basın.
    10. Toplama tüpündeki süpernatantı çıkarın ve tüpte 100 μL çözelti bırakın. Kalan numuneyi pipetle karıştırın ve numuneyi OT (One touch 2 sistemi) işaretli yeni 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın.
      NOT: Süper natantı pipetletirken, yan taraftaki tüp tabanına dokunmaktan kaçının.
    11. Pipet, toplama tüplerinin her birine 100 μL nükleaz içermeyen su ve tekrarlanan pipetleme ile yıkanmış OT tüpüne transfer çözeltisi. Toplam hacmi 1 mL, 30 s vorteks yapmak için OT tüpüne 600 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve 8 dakika boyunca 15.500 x g'de santrifüj yapın.
    12. OT tüpündeki süpernatantı 100 μL kalacak şekilde yavaşça çıkarın ve yağ tabakasını iyice atmak için ucu kullanın. 900 μL nükleaz içermeyen su, 30 s vorteks ve 8 dakika boyunca 15.500 x g'de santrifüj ekleyin.
    13. 20 μL kalana kadar süpernatantı çıkarın, hacmi 100 μL, 30 s vorteks yapmak için şablon süspansiyon çözeltisi ekleyin ve 2 s için kısaca santrifüj yapın.
      NOT: Bu adımda elde edilen çözüm, 12 saatten daha kısa bir sürede bir sonraki adıma geçmelidir.
    14. Gücünü kesmeden önce şablon yükseltme sisteminde temiz programı çalıştırın.
  3. Şablon zenginleştirme
    1. Eriyik karışımını 280 μL ara-80 ve 40 μL 1 M NaOH ile hazırlayın.
    2. C1 boncuklarını yıkayın. 30 s için C1 boncuk çözeltisini vorteksleyin. 100 μL boncukları 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, tüpü 2 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı atın.
    3. C1 boncuk yıkama çözeltisinin 1 mL'sini 30 saniye boyunca tüpe ve girdaba aktarın. Kısa bir süre (5 sn) santrifüj yapın, tüpü 2 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin ve süpernatanı atın. Pipet 130 μL C1 boncuk ressüspansiyon çözeltisini tüpe yerleştirin ve tekrar pipetleme yaparak boncukları karıştırın. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
    4. Seyreltilmiş kütüphanenin 100 μL'sini, 130 μL C1 boncuklarını, 300 μL x 3 şablon yıkama çözeltisini ve 300 μL'lik erime çözeltisini Şekil 1'de gösterildiği gibi sekiz kuyucuklu şeritlere yükleyin.
    5. Sekiz delikli şeritleri zenginleştirme modülüne takın, pipetleme ucunu yükleyin ve 200 μL santrifüj tüpünü toplama konumuna getirin. Programı çalıştırmak için BAŞLAT'a basın; yaklaşık 35 dakika sürer.
    6. Numune otomatik olarak 200 μL santrifüj tüpünde toplanacaktır; kapağı kapatın ve 5 dakika boyunca 15.500 x g'de santrifüj yapın. Herhangi bir C1 boncuğu kalıp kalmadığını doğrulamak için tüp tabanını kontrol edin.
    7. C1 boncukları kalıyorsa, şablon çözeltisi 10x'i tekrar tekrar pipetleyin ve tüpü 4 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Tüm süpernatantı yeni bir 0,2 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 15.500 x g'de santrifüj yapın.
    8. Görünür bir C1 boncuk kalmazsa, süpernatantı 10 μL kalana kadar atın, 200 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve 10x pipetleyerek karıştırın. 5 dakika boyunca 15.500 x g'de santrifüj.
    9. Süpernatantı 10 μL kalmış olarak atın ve toplam 100 μL hacme ulaşmak için 90 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. çözeltiyi, 5 s'lik vorteksi ve kısaca santrifüjü (5 s) karıştırmak için 10x yukarı ve aşağı pipet. Çözelti 2-8 ° C'de 3 günden az saklanabilir.

5. Yeni nesil sıralama 9,15

NOT: Bu bölümdeki tüm yordamlar DA8600 sıralama platformunda gerçekleştirilir. Bu bölümde kullanılan malzemeler, Dizileme Reaksiyonları Universal Kit'in (Malzeme Tablosu) Sıralama Kiti Seti'nde (Reaktifler / Çözeltiler / Malzemeler) mevcuttur.

  1. Çalışan bir sıralama platformunda gerekli olan tüm reaktifleri ve malzemeleri kontrol edin.
    1. Dizileme reaktifi: -30-10 °C arasında depolanan dizileme enzim çözeltisinin (6 μL), dizileme primerlerinin (20 μL), kalite kontrol şablonunun (5 μL) ve dGTP/dCTP/dATP/dTTP'nin (70 μL) kullanılabilirliğini kontrol edin.
    2. Sıralama çözeltisi: 4 °C'de depolanan sıralama çözeltisi II (100 mL), sıralama çözeltisi III (50 mL), tavlama tamponu (1.015 μL), yükleme tamponu (10 μL), köpürtücü madde (2 μL), klor tableti (1 tablet) ve Streptavidin boncuklarının (100 μL) kullanılabilirliğini kontrol edin.
    3. Malzemeler: RT'de depolanan 250 mL reaktif tüpü (8), 250 reaktif tüp kapağı (8), sipper II (8), sipper (1), 2 L reaktif şişesi (1) ve sıralama çipinin (1) kullanılabilirliğini kontrol edin.
  2. Kullanmadan önce çipi yıkayın.
    1. Bir talaş bir çalışma plakasına sabit tutun, numune deliğine 100 μL nükleaz içermeyen su enjekte edin, çözeltiyi çıkış portalından çıkarın ve prosedürü tekrarlayın.
    2. Çipe 100 μL 0,1 M NaOH çözeltisi enjekte edin ve RT'de 1 dakika inkübe edin.
    3. Numune deliğine 100 μL izopropanol enjekte edin, çıkış portalındaki ekstra çözeltiyi çıkarın ve prosedürü tekrarlayın.
    4. Çıkış portalını bir filtre kağıdıyla örtün, çipin akış hücresinde kalan izopropanolü kurutmak için azotun içine akın ve kullanıma hazır çipi RT'de tutun.
  3. Sıralayıcı başlatma
    1. Azot valfini açın ve basıncı 30 psi'ye ayarlayın. Sıralayıcıyı başlatın, ana ekranda TEMİZLE tuşuna basın ve makineyi buna göre yıkamak için su veya klorür seçin.
      NOT: Her çalıştırmadan önce suyla yıkayın, her hafta klorürle veya makinenin 48 saatten fazla reaktiflerle beklediği süre boyunca yıkayın.
    2. Klorür yıkama: Klorür yıkama için belirtilen bir reaktif şişe seçin, şişeyi iki kez 18 MΩ suyla yıkayın ve şişeyi 1 L 18 MΩ su ile doldurun. Şişeye bir klorür tableti koyun, tableti 10 dakika çözün, 1 mL 1 M NaOH ekleyin ve ardından çözeltiyi karıştırmak için şişeyi ters çevirin. Klorür çözeltisini hazırlandıktan sonra 3 saat içinde kullanın.
    3. 100 mL klorür çözeltisini 0,45 μm filtre ile filtreleyin ve iki tüp ile toplayın. İki klorür tüpünü C1 ve C2 konumlarına takın. Ana ekranda CLEAN tuşuna basın ve klorür yıkama için bir çip donatın.
    4. İLERİ'ye basın ve yıkama programını başlatmak için ekrandaki tüm adımları kontrol edin; Program 30 dakika içinde sona erecektir. Klorür yıkamadan sonra suyla yıkamaya başlayın.
    5. Su yıkama: C1 ve C2 ile suya özgü iki tüpü işaretleyin ve tüpleri iki kez 18 MΩ suyla yıkayın. Su yıkama tüplerinin her birine 100 mL 18 MΩ su ekleyin ve bunları sırasıyla C1 ve C2 konumlarına ayarlayın.
    6. CLEAN programını seçin, suyla yıkama için hazırlanan çipi takın, İLERİ'ye basın ve ardından yıkama programını başlatmak için ekrandaki tüm adımları kontrol edin.
  4. İlklendirme
    1. Yıkama şişesini yıkama çözeltisi II ile temizleyin, W2 olarak işaretleyin ve 18 MΩ su ile üç kez yıkayın.
    2. Azot tüpünü hava ile serilmiş kağıtla temizleyin, tüp tabanına yerleştirin ve hava akışını 0,5 L/dk'ya ayarlayın. Şişedeki oksijeni boşaltın ve şişeyi 1.920 mL 18 MΩ su ile doldurun. Şişeye sekans çözeltisi II ve 10 μL 1 M NaOH ekleyin, kapağı kapatın ve çözeltiyi karıştırmak için şişeyi birkaç kez ters çevirin.
    3. İki yeni tüpü W1 ve W3 olarak işaretleyin. W1'e 32 μL 1 M NaOH ekleyin, W3'e 40-50 mL 1x dizi çözeltisi III ekleyin ve kapakları kapatın.
      NOT: 1x sıralı çözelti III, ilk kullanıldığında 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosunda olmalıdır. Sequence solution II ışıktan korunmalı ve RT'de saklanmalıdır. Yıkama şişesi 20 kez kullanıldıktan sonra yenisiyle değiştirilmelidir.
    4. Ana ekranda BAŞLAT'a basın, W1, W2 ve W3 konumlarındaki sipper'ı değiştirin, tüpleri uygun şekilde konumlarına ayarlayın ve döndürerek sıkıca kapatın. Başlatma için bir çip takın ve makinenin durum parametrelerini kontrol edin.
    5. Başlatma programını başlatmak için İLERİ'ye basın; ilk bölümde 40 dakika sürer.
      NOT: Yudumlayıcının gövdesinin kirlenmesini önlemek için yeni sipper'ı değiştirmeden önce eldivenler değiştirilmelidir. Su yıkama ve başlatma için kullanıldıktan sonra, talaşlar başlatmaya uygulanabilir, ancak başlatma için klorür yıkama talaşları için kullanılan talaşları kullanmayın.
    6. dGTP, dCTP, dATP ve dTTP'yi buz üzerinde çözün ve vorteksi karıştırın. Dört yeni tüpü G, C, A ve T olarak işaretleyin ve tüpün etiketine göre çözeltinin 70 μL'sini pipetleyin.
  5. Kitaplığı çalışmaya hazırlayın.
    1. Kalite kontrol şablonunu, primerleri ve enzim çözeltisini buzun üzerine yerleştirin.
    2. Başlatma programı yaklaşık 20 dakika kaldığında DNA kütüphanesini hazırlayın. Vortex kalite kontrol şablonunu 30 s karıştırmak ve kısaca 2 s için santrifüj yapmak. Kalite kontrol şablonunun 5 μL'sini şablon çözeltisine, 5 sn'lik vortekse aktarın ve tüpü 5 dakika boyunca 15.500 x g santrifüj edin. Süpernatantı dikkatlice pipetleyerek çıkarın, pelete dokunmaktan kaçının ve tüpte 10 μL'lik bir hacim bırakın.
    3. Tüpe 15 μL tavlama tamponu ekleyin; çözeltinin toplam hacmi 25 μL'dir.
    4. Vorteks dizisi astarları buz üzerinde tamamen çözündüğünde ve 2 saniye boyunca kısa bir süre santrifüj yapın. Dizi astarlarının 20 μL'sini önceki adımdan tüpe aktarın, 5 s için vorteks, 2 s için kısa bir süre santrifüj yapın ve daha sonra kullanmadan önce RT'de saklayın.
  6. Numunenin yüklenmesi ve sıralanması
    1. Pipet, önceki adımda hazırlanan numune çözeltisinin 55 μL'sini çipin numune deliğine enjekte eder.
    2. Çipi santrifüj üzerine yerleştirin; çentiği dışarıya ve numune portalını içeride tutun, kullanılmış başka bir çiple dengeleyin ve 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    3. Yükleme çözümünü hazırlayın.
      1. 0,5 mL tavlama tamponunu ve 0,5 mL nükleaz içermeyen suyu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde karıştırın. % 50 tavlama tamponu olarak işaretleyin ve 7 gün içinde kullanın.
      2. 0.5 mL izopropanol çözeltisi ve 0.5 mL tavlama tamponu karıştırın. % 50 yıkama tamponu olarak işaretleyin ve 24 saat içinde kullanın.
      3. 6 μL sekans enzimi ve 60 μL% 50 tavlama tamponu karıştırın. Enzim reaksiyon tamponu olarak işaretleyin ve hazırlandıktan sonra çözeltiyi buzun üzerine yerleştirin.
      4. 49 μL% 50 tavlama tamponu ve 1 μL köpürtücü maddeyi karıştırın ve köpürtücü çözelti olarak işaretleyin.
    4. Köpüklenme çözeltisine 100 μL hava üfleyin, kabarcıklar yoğun bir köpük durumuna gelene kadar çözeltiyi tekrar tekrar pipetleyin ve köpük hacmini 250 μL civarında tutun.
    5. Çipi santrifüjden sonra tezgahın üzerine yerleştirin, numune deliğine 100 μL köpük enjekte edin ve ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalından çıkarın. Çipi santrifüje geri yerleştirin ve 30 saniye boyunca kısa bir süre santrifüj yapın.
    6. 5.6.4-5.6.5 arasındaki adımları yineleyin.
    7. 100 μL% 50 yıkama tamponunu iki kez enjekte edin ve her enjeksiyondan sonra ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalından çıkarın.
    8. Üç kez 100 μL% 50 tavlama tamponu enjekte edin ve her enjeksiyondan sonra ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalından çıkarın.
    9. 65 μL% 50 enzim reaksiyon tamponu enjekte edin, kabarcıklardan kaçının ve ekstrüde edilmiş çözeltiyi çıkış portalından çıkarın.
    10. RT'de yüklü çipi 5 dakika boyunca stabilize edin ve çipi sıralayıcı çip portalına takın. 6. adımda programlanan planı seçin, bilgileri kontrol edin ve çalıştırmayı başlatın; bitmesi yaklaşık 1,5 saat sürer.
    11. Koşu bittikten sonra 72 saat içinde suyla yıkama programını gerçekleştirin. Klorür yıkamayı, süre 72 saati aştığında suyla yıkamadan önce yapın. Sıralayıcıyı kapatın ve azot valfini kapatın.

6. Raporlayıcı sunucu sisteminde talimatlı bir sıralama çalıştırması planlayın16

NOT: Bu bölümdeki tüm prosedürler, muhabir sunucu sistemi ile İyon Proton Sıralayıcısı üzerinde gerçekleştirilir.

  1. Sunucu sisteminde oturum açın, Plan sekmesini seçin ve Plan Şablonu Çalıştırma'ya tıklayın. Çalıştırma türü olarak Tüm Genom'u seçin ve planlanan çalıştırma şablonları listesinden uygun şablonu seçin.
  2. Plan sekmesinde, aşağıdaki seçimleri girin veya yapın:
    1. Örnek grubuna göre yeni bir çalışma planı adı girin, Referans Kitaplığı açılır listesinden hg19 (Homo sapiens) öğesini seçin ve Hedef Bölgeler ve Etkin Nokta Bölgeleri açılır listelerinden Hiçbiri'ni seçin.
    2. Numune setinde kullanılan barkod sayısını girin, her numune için açılır listeden bir barkod seçin ve numuneyi gruplandırmaya ve izlemeye yardımcı olabilecek benzersiz, açıklayıcı bir ad girin. Varsayılan Örnek 1 ve benzerlerini kullanmaktan kaçının.
    3. İyon Raporlayıcı sekmesinde Hiçbiri'ni seçin, İleri'ye tıklayın ve uygulamada DNA'yı ve hedef teknik olarak Tüm Genom'u seçin.
    4. Kitler sekmesinde, seçimleri doğrulayın veya çalıştırma için uygun olduğunda değişiklikler yapın.
      1. Ion Plus Fragment Library Kit From From Library Kit (Kütüphane Kiti Türü) açılır listesinden Ion Plus Fragment Library Kit seçin. Template Kit açılır listesinden Ion PI HI-Q OT2 200 kit'i seçin ve varsayılan olarak OneTouch'ı seçin. Sequencing Kit açılır listesinden Ion PI HI-Q Sequencing 200 kit seçin.
      2. 300 akış girin, Chip Type (Çip Türü) açılır listesinden Ion PITM Chip öğesini seçin ve Barcode Set (Barkod Kümesi açılır listesinden IonXpress) öğesini seçin.
      3. Yinelenen Okumalar Olarak İşaretle seçimini ve Yeniden Hizalamayı Etkinleştir seçimini iptal edin.
    5. 7. adımda veri analizi yapmak için Eklentiler sekmesinden uygun eklentiyi seçin. Projeler adımındaki seçimleri tamamlayın, İleri'ye tıklayın ve Planlanan Çalışmaları listelemek için sağ alt köşedeki Plan Çalıştırma'ya tıklayın.
    6. Planlı Çalıştırmalar sekmesinde, yeni oluşturulan çalıştırmayı seçin ve gözden geçirme penceresindeki tüm ayarları kontrol edin.

7. Veri analizi

  1. Bir biyoinformatik iş akışı kullanarak kopya numarası değişkenlerini (CNV'ler) analiz edin.
    NOT: CNV'ler, gizli bir Markov modeline (HMM) dayanan bir algoritmanın uygulanmasıyla biyoinformatik iş akışında analiz edilmiştir17; Model, kopya sayısını veya tam sayı ploidi durumunu (yani, 0, 1, 2, 3, vb.) tahmin etmek için genom boyunca okuma kapsamını kullanır. Genel biyoinformatik boru hattı, Şekil 2'de gösterilen bir dizi sunucu sisteminin eklentisinde inşa edilmiştir. Biyoinformatik analiz adımının tamamlanması ortalama 4 saat sürer.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Makinede çalıştırma işleminden sonra dizi planı sona erdiğinde, dizi sunucusu sistemi, Şekil 2'de gösterildiği gibi, oluşturulan verilerin, çip durumunun, ISS yükleme hızının ve kitaplık kalitesinin açıklayıcı bilgileriyle özeti raporlar. Bu sonuç gösteriminde, toplam bazda 17.6 G veri elde edildi ve çipin toplam kuyularında ISP'nin toplam yükleme oranı% 88 idi; ısı haritası, numunenin çipin toplam alanına eşit olarak yüklendiğini göstermiştir (Şekil 2A). Temsil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Embriyoların kromozomal anöploidisi, doğal olarak veya in vitro fertilizasyon (IVF) olarak gebe kalmış olsun, gebelik kaybının büyük bir kısmının nedenidir. IVF'nin klinik pratiğinde, embriyo anöploidisinin taranması ve öploidi embriyosunun transferinin IVF'nin sonucunu iyileştirebileceği önerilmektedir. Floresan in situ hibridizasyon, cinsiyet seçimi ve PGT-A için benimsenen en eski tekniktir; Bununla birlikte, bu teknik laboratuvar personelinden daha fazla teknik uzmanlık gerektirir ve nispeten emek y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Dr. Zhangyong Ming ve Bay Rongji Hou'ya LIMS genişletilmiş uygulaması hakkındaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma PLA Aile Planlaması Özel Araştırma Projeleri (17JS008, 20JSZ08), Guangxi Anahtar Metabolik Hastalıklar Araştırma Laboratuvarı Fonu (No.20-065-76) ve Guangzhou Vatandaş Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Araştırma Projesi (201803010034) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.45 μ m Şırınga Filtre ÜnitesiMerkmilliporeMillex-HV
1.5 mL DNA LoBind TüpleriEppendorf30108051
15 mL tüplerGreiner Bio-One188261
2.0 mLDNA LoBind TüpleriEppendorf30108078
50 mL tüplerGreiner Bio-One227261
5x Anstart Taq Tamponu (Mg2+ Plus)FAPON
  Anstart Tap DNA PolimerazFAPON
AMPure XP reaktifi (dna bağlama için manyetik boncuklar)BeckmanA63881https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Hücre Lizis tamponuGüney Tıp Üniversitesi40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), %1 (h/h) Triton X-100, 5 mM sodyum içeren hücre lizis tamponu pirofosfat, 2 mM ve beta;-gliserofosfat, %0,1 SDS
ClinVarNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elüsyon tamponuNEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 Mıknatıs Yaşam Teknolojileri12321D
Etil alkolGuangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası Thermo Fisher Bilimselhttp://www.chemicalreagent.com/
Bağımsız olarak geliştirilen tüm genom amplifikasyon reaktifleriGüney Tıp ÜniversitesiReaktifler aşağıdaki bileşenlerden oluşur:
1. Hücre Lizisi
2. Amplifikasyon Önceden karıştırılmış çözelti
      1) Astar WGA-P2 (10 μ M)
      2) dNTP (10 mM)
      3) 5x Anstart Taq Tamponu (Mg2 + < / sup> Plus)
3. Amplifikasyon Enzimi
      1) Anstart Musluk DNA Polimeraz (5 U/μ L)
İyon PI Hi-Q OT2 200 KitiThermo Fisher ScientificA26434Kiti adım 4.2.8'de belirtilen
Ion PI Hi-Q Dizileme 200 Kiti ve nbsp;  Thermo Fisher ScientificA26433
İyon Proton SistemiYaşam Teknolojileri4476610
İyon Muhabiri Sunucu Sistemi ÖmrüTeknolojileri4487118
izopropanolGuangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikasıhttp://www.chemicalreagent.com/
Kütüphane Hazırlama KitiDaan Gene Co., Ltd114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
Nükleaz İçermeyen SuÖmrü TeknolojileriAM9932
Oligo WGA-P2Sangon Biotech5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNn
NNNNATGTGG-3'OneTouch
2 SistemÖmrü Teknolojileri4474779  Şablon amplifikasyon ve zenginleştirme sistemi
PCR tüpleriAxygenPCR-02D-C
PicoPLEX WGA KitiTakara Bio ABDR300671
Pipet uçlarıKaliteli Bilimsel Ürünlerhttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Taşınabilir Mini Santrifüj LX-300QilinbeierE0122
Qubit 3.0 FlorometreYaşam TeknolojileriQ33216Florometre
Kübit Test TüpleriYaşam TeknolojileriQ32856
Kübit dsDNA HS Test KitiYaşam TeknolojileriQ32851
Sıralayıcı sunucu sistemiThermo Fisher Scientific TorrentSuite Yazılım
Sıralama Reaksiyonları Evrensel KitDaan Gene Co., Ltd113https://www.daangene.com/pt/certificate.html
Bu kit aşağıdaki bileşenleri içerir:
1. Şablon Hazırlama Kiti Seti

1.1 Şablon Hazırlama Kiti:
Emülsiyon PCR tamponu
Emülsiyon PCR enzim karışımı
Şablon taşıyıcı çözümü

1.2 Şablon Hazırlama çözümleri:
Şablon hazırlama reaksiyon yağı I
emülgatör kırma çözeltisi II
Şablon Hazırlama Reaksiyon Yağı II
Nükleaz içermeyen su
Tween Çözüm
Emülsifikasyon çözümü I
Şablon yıkama solüsyonu
C1 boncuk yıkama solüsyonu
C1 boncuk yeniden süspansiyon çözümü
Şablon yeniden süspansiyonu çözümü

1.3 Şablon Hazırlama Malzemeleri:
Reaktif tüpü I
konektörü
Toplama tüpü
Reaktif tüp pipeti I
Amplifikasyon plakası
8 kuyu strip
Özel uçlar
Şablon hazırlama yıkama adaptörü
Şablon hazırlama filtresi

2. Sıralama Kiti Seti

2.1 Sıralama Kiti:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Dizileme enzim çözeltisi
Sıralama primerleri
Kalite kontrol şablonları

2.2  Sıralama Çözümleri: < br / > Sıralama çözeltisi II
Sıralama çözeltisi IIII
Tavlama tamponu
Yükleme tamponu
Köpürtücü ajan
Klor tabletleri
C1 boncuk

2.3 Sıralama Malzemeleri:
Reaktif Tüpü II
Reaktif tüp kapağı
Reaktif tüpü yudumlayıcı  II
Reaktif şişesi sipper
Reaktif şişeleri

3. Chip
Sodyum hidroksit çözeltisiSigma72068-100ML
Termal DöngüleyiciYaşam Teknolojileri4375786

Kaynaklar

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341(2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266(2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
  16. Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017).
  17. Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871(2016).
  18. Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
  19. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22(2014).
  20. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  21. Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
  22. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  23. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345(2013).
  24. Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
  25. de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585(2014).
  26. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  27. Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
  28. Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
  30. Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  31. McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
  32. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164(2010).
  33. Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170(2013).
  34. Darui laboratory information management system. Darui Reproduction Technology Co. , Available from: http://www.daruiart.com/newsitem/278327399 (2018).
  35. Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
  36. Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Aneuploidi Genetik TestiYar letken Sekanslama PlatformuT m Genom AmplifikasyonuTrofektoderm H creleriGenomik K t phane Olu turmaKopya Say s VaryantlarDNA Safla t rma BoncuklarSekanslay c Y netimi

İlgili makaleler