$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Farklı kökenlere sahip RPE hücrelerinin subretinal implantasyonu, AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 gibi retinal dejeneratif bozuklukların tedavisi için göz araştırmalarında çok umut verici bir eğilimdir . Bu yaklaşımın ana fikri, hasarlı RPE'leri ex vivo kültürlenmiş sağlıklı RPE'lerle değiştirmektir (Ek Dosya 1)44,45,46,47,48. Ekili RPE hücrelerini nakletmek için hücre taşıyıcılarının kullanılması en makul yaklaşımı temsil eder, çünkü gözenekli membranlar polarize RPE hücre tabakasını fotosensör tabakaya göre doğru yönde tutar.
Optimal hayvan modeli
Bu tür tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesinde kritik bir adım, optimal hayvan modeli49'un kullanılmasıdır. Geçmişte, tavşanlar, köpekler, domuzlar ve insan olmayanprimatlar 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29 dahil olmak üzere küçük ve büyük hayvan modelleri kullanılmıştır. Bu yazıda, Liběchov minipig modelinin kullanımını öneriyoruz ve sağlam transplantasyon etkinliklerini sağlayan preoperatif, cerrahi ve postoperatif adımları tanımlıyoruz. Liběchov minipig aslen yaklaşık 20 yıl önce yetiştirildi ve Parkinson ve Huntington hastalığı29,50 gibi nörodejeneratif hastalıklar alanında biyomedikal araştırmalarda sıklıkla kullanıldı. Domuz, insanlardakine benzer bir kan kaynağı ve immünolojik yanıtı olan nispeten büyük bir beyne sahip olduğundan, allojenik transplantasyon deneyleri için de bir hayvan modeli olarak kullanılmıştır51,52,53,54. Minipiglerin retinası insan benzeri bir makula ve foveaya sahip olmasa da, retinanın yüksek konsantrasyonda koni fotoreseptörleri30 olan bölgeleri olan alan centralis ve görsel çizgileri içerir. İnsan gözüne benzer boyut, koni ile zenginleştirilmiş merkezi retinanın varlığı, iyi tanımlanmış bağışıklık sistemi ve ameliyat sonrası morfolojiyi ve işlevi değerlendirmek için yöntemlerin varlığı, sunulan çalışmada bu büyük hayvan modelinin kullanımı için önemli argümanlardır.
Cerrahi prosedür
Bildiğimiz kadarıyla, taşıyıcılar üzerinde RPE hücrelerinin vitreoretinal transplantasyonu için standartlaştırılmış ve yaygın olarak kabul görmüş cerrahi teknikler bulunmamaktadır. Hücre replasman tedavisinin en önemli konularından biri, retina dekolmanı, hipotoni, episkleral, koroidal ve / veya retina kanaması ve iskele hasarına yol açabilecek yüksek göz içi türbülansı ile bağlantılı intraoperatif ve postoperatif komplikasyon riski taşıyan zorlu cerrahi tekniktir. Postoperatif dönemde proliferatif vitreoretinopati, endoftalmi, hipotoni, retina dekolmanı ve katarakt oluşumu riski 4,10,13,14,15'tir.
Hücre taşıyıcılarını kullanan yaklaşımlarla ilgili ilk çalışmalar çinçilla tavşanlarında 13,16,25 gerçekleştirilmiştir. Bu hayvanlar küçük bir hayvan modelini temsil etse de, ameliyatın teknik yönlerine odaklanan sonuçlar, büyük hayvan modellerinde prosedürlerin geliştirilmesinde çok önemliydi ve bu nedenle aşağıda özetlenmiştir.
Özel yapım bir 23 G infüzyon kanülü başlangıçta jet akımını yönlendirmek için iki yan portla kullanıldı, bu da blebin çöküşünü ve bunun sonucunda retina dekolmanı13'ün çözülmesine yardımcı oldu. Bu çalışmada, bleb'in böyle bir çöküşünü fark etmedik. Bunun olası nedeni, göz küresinin daha büyük boyutu ve kanül infüzyon bölgesindeki çevrede korunmuş vitreus ile çekirdek vitrektominin performansı olabilir, bu da yönlendirilmiş jet akımının kuvvetini azaltabilir.
Hücre taşıyıcısının aletten atılması sırasındaki zorluklar, "aletle sıkışmış" olarak sınıflandırılan küçük hayvan modellerinde başka bir intraoperatif engeldi. Ek olarak, yazarlar retina yüzeyindeki kalıntı vitreusun, implantasyondan sonra taşıyıcının retinotomi deliğinden geriye doğru "sıçramasına" neden olabileceğini öne sürmüşlerdir. Bu sorun, hücre taşıyıcısının subretinal boşluğa düzgün, sürekli olarak atılmasını sağlayan enzim yardımlı bir vitrektomi ile çözülebilir. Vakaların çoğunda, yazarlar implantın retinotomiden daha uzak bir yerini elde etmek için taşıyıcıyı yeniden konumlandırdılar. Vaka serimizde, hücre taşıyıcısının enjektörün ucuna bağlı kaldığı bir durum da yaşadık. Bununla birlikte, bu, ışık borusunun ve enjektörün ucunun yavaş ve nazik manipülasyonu ile yönetildi. Olgularımızın hiçbirinde retinotomi bölgesinde herhangi bir rezidüel vitreus gözlenmedi. Ameliyatlarda TA yardımlı PPV'nin kullanılması, rezidüel olarak bağlanmış vitreus riskini azaltmak için bir yöntem olarak önerilebilir. Üst kısımdaki vitreusun tamamen çıkarılması için TA ile çoklu boyama gerekebilir.
Farklı bir çalışmada, polyester membran üzerinde polarize hücresel tek tabaka olarak yetiştirilen insan RPE kök hücrelerinin subretinal implantasyonunun sonuçları bildirilmiştir24. Deneyler sırasında, daha önce tarif edilen aynı cerrahi teknik kullanıldı13, ancak iki portlu bir PPV yaklaşımı uygulandı. Son olarak, tavşanlarda hücre taşıyıcı cerrahisinin subretinal implantasyonu için adım adım bir protokol daha sonra yayınlanmıştır25. Bu çalışma, ameliyat öncesi ve sonrası bakım da dahil olmak üzere, cerrahi prosedürün önceki deneyimlere dayanan çok ayrıntılı ve kolay tekrarlanabilir bir tanımını sunmaktadır.
Daha sonraki çalışmalarda büyük hayvan modellerinin kullanımı sırasında, sadece teknik sorular değil, aynı zamanda nakledilen hücrelere karşı bağışıklık reaksiyonu ve hücre taşıyıcısı büyüklüğü ile ilgili sorunlar ile ilgili sorular da ele alınmıştır. Cynomolgus maymunlarını (Macaca fascicularis) kullanan bir çalışma, insan kök hücresinden türetilmiş RPE monokatmanlarının subretinal implantasyonunun sonuçlarını tanımlamıştır15. Tüm hayvanlara ameliyattan 7 gün önce başlayan ve ameliyattan 3 ay sonra süren sirolimus (yükleme dozu 2 mg, günlük doz 1 mg) ve tetrasiklin (7.5 mg/kg- BW) içeren sistemik immünsüpresyon uygulandı. Cerrahi işlem daha öncetarif edilen protokollere göre yapıldı 24,25. Yazarlar, avize endo-aydınlatmalı 25 G üç portlu bir PPV yaklaşımı kullandılar. Önemli olarak, posterior retinada rezidüel vitreoretinal adezyonu dışlamak için TA yardımlı PVD kullanıldı. Orijinal olarak tarif edilen prosedüre ek olarak, yazarlar 20 G ısmarlama uzatılabilir döngü aleti kullanarak gelecekteki implantasyon alanında konakçı RPE katmanını çıkardılar.
Minipig çalışmamızda sistemik immünsüpresyon da kullandık. Bununla birlikte, immünsüpresyon tipi yukarıda tarif edilenden farklıydı. Hücre grefti reddini ve enflamatuar reaksiyonları engellemek için depo olarak takrolimus salınımlı polimer mikrosferlerin deri altı enjeksiyonunu 0.25 mg / kg BW dozunda uyguladık. Ameliyat sırasında konakçı RPE hücre tabakasını çıkarmadık, çünkü birincil amacımız prosedürün güvenliğini ve implante edilen hücrelerin yaşayabilirliğini analiz etmekti, ancak konakçı retinaya entegrasyonlarını değil.
Daha önce, katlanabilir parçalanamayan ağ destekli bir submikron parilen-C membranı (6.25 mm x 3.5 mm, 0.4 μm kalınlığında) üzerine tek katmanlı bir hESC türevli RPE'nin subretinal implantasyonunun güvenliği ve fizibilitesi 14 dişi Yucatán minipig10'da değerlendirildi. Ekimden sonra, hücreler ağ destekli bir zar üzerine ekildi. İmmünsüpresyon, sistemik takrolimus uygulaması (rejim ve doz belirtilmemiş) ve ameliyat sonunda 0.7 mg deksametazon implantının intravitreal enjeksiyonları kullanılarak gerçekleştirildi. PPV 20 G yaklaşımı ile yapıldı. Yazarlar, vitreus gövdesinin daha iyi görselleştirilmesi için intravitreal bir triamsinolon asetonid enjeksiyonu kullandılar. Büyük sklerotominin büyüklüğü 2 mm ile 3 mm arasındaydı. Subretinal enjeksiyondan sonra, retina geçici bir perflorokarbon sıvısı enjeksiyonu ile düzleştirildi. Akışkan-hava değişiminden sonra silikon yağı tamponadı (1.000/5.000 cSt) uygulandı. Postoperatif bakım, ameliyattan 1 hafta sonra deksametazon/neomisin/polimiksin B merheminin oküler uygulamasını içeriyordu. Yazarlar %91'lik bir başarı oranı bildirmişlerdir (yani, etkili subretinal implantasyon ve yeterli postoperatif görüntüleme verileri). Çalışmamızda TA kristallerinin intravitreal enjeksiyonu intraoperatif olarak ve esas olarak vitreus cismini görselleştirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu ilacın lokal immünosüpresif etkisi belirsizliğini korumaktadır. Çalışmamızda kullanılan nanofibröz hücre taşıyıcıları 5.2 mm x 2.1 mm kalınlığında ve 3.7 μm kalınlığında, gözenek boyutları 0.4 μm idi. Ameliyat sırasında perflorokarbon sıvısı enjekte etmek yerine direkt faks uyguladık. Cerrahi başarı oranımız (%93.1) Koss ve ark.10 ile tutarlı ve biraz daha iyiydi.
Subretinal implantasyon için tamamen parçalanabilir hücre taşıyıcılarının (iskele) subretinal transplantasyonu ilk olarak 2019 yılında Yorkshire domuzlarındaincelenmiştir 14. Çalışma esas olarak fibrin hidrojel implantların biyolojik olarak parçalanabilir özelliklerine odaklanmıştır. Yazarlar, evcil domuzlarda kullanılan agresif immünosupresyonun, fibrin hidrojel implantlarının biyolojik olarak parçalanması sırasında potansiyel olarak ortaya çıkan lokal bir enflamatuar reaksiyonu inhibe edebileceğini belirtmişlerdir. Bununla birlikte, domuzlarda kullanılan immünosüpresif tedaviyi belirtmediler. PPV sırasında, subretinal implantasyon cihazının limbusa paralel ve yaklaşık 3.5 mm posterior olarak yerleştirilmesi için 3.6 mm uzunluğunda bir sklerotomi uyguladılar. Ek olarak, parmak manipülasyonunun neden olduğu el yerleştirme dengesizliğini azaltmayı amaçlayan pnömatik tahrikli bir enjeksiyon sistemi kullandılar. Olgu serimizde tüm sklerotomilerle limbustan 2.5 mm ile 3.0 mm arasında değişikliğe gidildi. Enjektörün yerleştirilmesi için büyük sklerotomi 3 mm uzunluğundaydı. Çalışmamızda kullanılan implantasyon enjektörü elle ameliyat edildi. Siliyer cismin pars planasının tam koterisi ve büyük sklerotominin içinde yeterli bir kesik, iyatrojenik periferik retina dekolmanı, kanama ve implant kaybı gibi intraoperatif komplikasyonlardan kaçınmak için çok önemli görünmektedir.
Özetle, Liběchov minipig modelinin biyolojik olarak parçalanabilen taşıyıcılar üzerindeki RPE hücrelerinin transplantasyonu için kalıtsal ve edinsel retina hastalıkları için bir tedavi seçeneği olarak kullanımını açıklıyoruz. Göz anatomisi ve fizyolojisindeki benzerliklerin yanı sıra bağışıklık sistemi ile ilgili benzerlikler, insan göz bozukluklarının tedavisine kolayca aktarılabilen hücrelerin subretinal implantasyonu için cerrahi teknikleri ve enstrümantasyonu geliştirmemize ve iyileştirmemize olanak tanır. Minipigler üzerindeki ameliyatların, insan ameliyatlarında kullanıldığında aynı enstrümantasyon (implantasyon dağıtım araçları dahil) kullanılarak gerçekleştirilmesini sağlamak önemlidir, böylece kazanılan deneyim ve bilgi birikiminin insanlara uygulanmasını kolaylaştırır. İnsan olmayan primatlar gibi bir makula alanının varlığına sahip alternatif büyük gözlü hayvan modelleri, merkezi retinal bölgede subretinal implantasyon sonrası anatomik ve fonksiyonel değişikliklerin takibi ve analizi için yararlı olabilir. Preoperatif, cerrahi ve postoperatif bakım prosedürlerinin ayrıntılı olarak tanımlanması, etkin ve standartlaştırılmış veri üretimini artırarak gelecekteki çalışmalar için yararlı olacaktır.
