Method Article

Lupus Eğilimli MRL/lpr Farelerde Proteinüri, Lökositlerin Renal İnfiltrasyonu ve Proteinlerin Renal Birikimi Analizleri

DOI:

10.3791/63506

⸱

June 8th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, farelerde lupus ilerlemesini izlemek için bir yöntem açıklamaktadır. Böbreklerde hücre infiltrasyonu ve protein birikimine bağlı lupus nefritini karakterize etmek için iki ek prosedür sunulmuştur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistemik lupus eritematozus (SLE), tedavisi bilinmeyen otoimmün bir hastalıktır ve böbrekler de dahil olmak üzere birçok organda kalıcı inflamasyon ile karakterizedir. Bu koşullar altında, böbrek atıkları kandan temizleme ve tuz ve sıvı konsantrasyonlarını düzenleme yeteneğini kaybeder ve sonunda böbrek yetmezliğine yol açar. Kadınlar, özellikle doğurganlık çağındakiler, erkeklerden dokuz kat daha sık teşhis edilir. SLE hastalarında böbrek hastalığı önde gelen mortalite nedenidir. Mevcut protokol, toplanan idrarda atılan protein seviyelerini ölçmek ve zaman içinde lupus ilerlemesini izlemek için hızlı ve basit bir yöntem tanımlamaktadır. Ek olarak, lökositlerin renal infiltrasyonunu araştırmak için boyut ve yoğunluk seçimine dayalı olarak böbrek mononükleer hücrelerini izole etmek için bir yaklaşım sağlanmıştır. Ayrıca, glomerüllerde protein birikimini ve tübülointerstisyel boşlukta lökosit infiltrasyonunu karakterize etmek için immünohistokimyasal bir yöntem geliştirilmiştir. Birlikte, bu yöntemler lupus eğilimli MRL / lpr farelerinin böbrekleri ile ilişkili kronik inflamasyonun ilerlemesini araştırmaya yardımcı olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böbreğin birincil işlevi, su ve tuzların homeostazını korurken idrar yoluyla toksik maddelerin elimine edilmesidir1. Bu fonksiyon, sistemik lupus eritematozuslu (SLE) hastalarda tehdit altındadır ve lupus nefritine (LN) yol açar. LN, bağışıklık sisteminin böbreğe saldırmasının bir sonucudur, bu da kalıcı böbrek iltihabına yol açar, bu nedenle atıkları kandan temizleme ve tuz ve sıvı konsantrasyonlarını düzenleme yeteneğini kaybeder. Bu sonunda ölümcül olabilen böbrek yetmezliğine yol açacaktır. Nefritik süreç sırasında, dolaşımdaki B hücreleri, T hücreleri ve monositler böbreğe alınır, kemokinler, sitokinler ve immün kompleks oluşturan otoantik....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, Virginia Tech'teki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Lupus hastalığı kadınlarda daha yüksek bir insidansa sahip olduğundan, sadece dişi MRL / lpr fareleri kullanılmıştır. Numune toplama 4 haftalıkken başlatıldı ve 15 haftada bitirildi. Fareler ticari kaynaklardan elde edildi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve kurumsal yönergeleri izleyerek belirli bir patojensiz ortamda yetiştirildi ve muhafaza edildi.

1. Proteinüri testi

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek idrar toplayın.
    1. % 70 etanol püskürterek davlumbazları sterilize edin. Yüzeye steril....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, lupus nefriti için MRL / lpr farelerini değerlendirmek için birden fazla yöntem kullanır. İlk olarak, zamanla böbrek fonksiyon bozukluğuna bağlı olarak artan proteinüri seviyelerini incelemek için bir prosedür tanımlanmıştır. Şekil 1'de gösterildiği gibi, dişi fareler kontrol grubu olarak 200 μL fosfat tamponlu salin (1x PBS) oral gavajı ve tedavi grubu olarak probiyotik Lactobacillus reuteri ile haftada iki kez 109 cfu / mL konsantrasyonunda tedavi edildi. Teda.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LN, SLE hastalarında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir ve hastalığı şiddetlendiren faktörler belirsizliğini korumaktadır. Bu protokolün uygulanması, proteinüri ölçümü, izole böbrek lökositlerinin FACS analizi ve donmuş böbrek bölümlerinin immünofloresan boyanması dahil olmak üzere çoklu yöntemler kullanarak böbrek fonksiyonunu karakterize etmektir.

İdrar toplarken göz önünde bulundurulması gereken önemli bir nokta, günün saati ve idrar toplama yeri ile tutarlı olması gerektiğidir. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik destek için Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Fralin Imaging Center at Virginia Polytechnic Institute ve State University'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma çeşitli NIH ve dahili hibelerle desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Tris-Tamponlu Tuzlu Su (TBS)Thermo Fisher ScientificJ60764. K2
2-merkaptoetanolThermo Fisher Scientific21985-023
Anti-İnsan / Fare C3SedirCL7632F
Anti-Fare CD138 BV711Biolegend142519
Anti-Fare CD45 AF700Biolegend103127
Sığır SerumuAlbümini Sigma-AldrichA9418-100G
Kollajenaz DSigma-Aldrich11088882001
Konfokal Mikroskop LSM 880ZeissLSM 880
Coplin kavanozFisher Scientific50-212-281
CryomoldFisher ScientificNC9511236
Yoğunluk gradyan ortamıGE Healthcare17-1440-02Percoll
DEPC-Arıtılmış suTermo Fisher ScientificAM9906
DNase ISigma-AldrichD4527
dsDNA-ECInvivoGentlrl-ecdna
Etilendiamintetraasetik AsitFisher ScientificS311-500EDTA
EVOS M5000 Mikroskop görüntüleme sistemiThermo Fisher ScientificAMF5000
FACS Füzyon Hücre sıralayıcıBD BiosciencesFACS Fusion
Fetal Sığır Serumu - Premium, Isıyla İnaktive EdilmişR& D sistemleriS11150H
Fisherbrand 96 Kuyulu Polistiren PlakalarFisher Scientific12-565-501
Graphpad prizmaGraphPadN/A
Hank' s Dengeli Tuz ÇözeltisiThermo Fisher Scientific14175-079
HEPESThermo Fisher Scientific15630-080
ImageJ yazılımıUlusal Sağlık EnstitüleriN/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.ATCC23272
MEM esansiyel olmayan amino asitlerThermo Fisher Scientific11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Fareler (MRL/lpr)Jackson Lab485
Tırnak minesiN/AN/AHerhangi bir geleneksel mağaza
OCT bileşiğiTisse-Tek4583
PAP kalemiSigma-AldrichZ377821
Peel-A-Way Tek Kullanımlık Gömme KalıplarıPolysciencesR-30
Penisilin-StreptomisinThermo Fisher Scientific15140-122
Fosfat tamponlu salin (PBS)Thermo Fisher Scientific70011069
Pierce 20x TBS TamponThermo Fisher Scientific28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Tahlil kitiThermo Fisher Scientific23236Albümin standardı dahildir
ProLon Altın Antifade MountantThermoFisherP36934
Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16/CD32BD Biosciences553141FcR blok
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
Sodyum piruvatThermo Fisher Scientific11360-070
SpectraMax M5Moleküler CihazlarN/ASoftMax Pro 6.1 yazılımı
Steril hücreli Süzgeçler 100 ve mikro; MFisher Scientific22363549
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Vankomisin HidroklorürGoldbioV-200-1
Zombie AquaBiolegend423102akış sitometrisi analizi için floresan boya

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Proteinuria AnalysisRenal Leukocyte InfiltrationRenal Protein DepositionLupus Prone MiceSystemic Lupus ErythematosusKidney Mononuclear CellsImmunohistochemical StainingPercoll Gradient IsolationFlow CytometryGlomerular Protein Deposition

Related Articles