Lupus Eğilimli MRL/lpr Farelerde Proteinüri, Lökositlerin Renal İnfiltrasyonu ve Proteinlerin Renal Birikimi Analizleri

Böbreğin birincil işlevi, su ve tuzların homeostazını korurken idrar yoluyla toksik maddelerin elimine edilmesidir¹. Bu fonksiyon, sistemik lupus eritematozuslu (SLE) hastalarda tehdit altındadır ve lupus nefritine (LN) yol açar. LN, bağışıklık sisteminin böbreğe saldırmasının bir sonucudur, bu da kalıcı böbrek iltihabına yol açar, bu nedenle atıkları kandan temizleme ve tuz ve sıvı konsantrasyonlarını düzenleme yeteneğini kaybeder. Bu sonunda ölümcül olabilen böbrek yetmezliğine yol açacaktır. Nefritik süreç sırasında, dolaşımdaki B hücreleri, T hücreleri ve monositler böbreğe alınır, kemokinler, sitokinler ve immün kompleks oluşturan otoantikorlar salgılanır. Bu sonuçta endotel hücre hasarı, membranöz yaralanmalar, renal tübüler atrofi ve fibroz² ile sonuçlanır.

MRL / Mp-Fas lpr (MRL / ^lpr) lupus eğilimli fareler, insan SLE^3'e benzeyen lupus benzeri klinik bulgular sergileyen klasik bir fare modelidir. Bu model, SLE hastalarında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri olan lupus nefritinin (LN)⁴ anlaşılmasında etkili olmuştur. Hem insan hem de fare SLE'sinde LN, immün komplekslerin renal birikimi ile tetiklenen kademeli inflamasyon, ardından kompleman aktivasyonu, enflamatuar hücrelerin işe alınması ve böbrek fonksiyon kaybı ile karakterizedir⁵. İmmün kompleks birikimi, intrinsik böbrek hücreleri tarafından kemokin ve sitokin üretimini indüklemek için ilk adımdır ve bu da immün hücreleri işe alarak enflamatuar yanıtı genişletir⁶. Mevcut protokol, böbrek hastalığı progresyonunu takip etmek için hücre infiltrasyonunu ve immün kompleks birikimini analiz eden çeşitli teknikler sunmaktadır.

Her hafta toplanan idrar, lupus başlangıcından önce, sırasında ve sonrasında proteinürinin zaman seyrinin tespit edilmesini ve görselleştirilmesini sağlar. Bir biyobelirteç olarak proteinüri, LN'nin biyolojik ilerlemesini belirleyebilir. Bu tekniğin diğer avantajları, invaziv olmayan, uygun maliyetli ve uygulanması kolay^{olmasıdır 7}. Böbrek mükemmel çalıştığında, proteinüri seviyesi sürekli olarak düşüktür; Bununla birlikte, MRL / lpr farelerinde, 8-9 haftalıktan sonra, proteinüri seviyesinde, sonunda böbrek yetmezliğine neden olacak kadar yüksek olan kademeli bir artış gözlenir⁸. Sorunu izlemek için çok sayıda reaktif şeridi ve kolorimetrik reaktifler ticari olarak temin edilebilir. Bununla birlikte, Bradford testi, proteinürinin başlangıcını ve lupus nefritinin seyrini belirlemede ucuz ve çok doğrudur. Bu tahlil hızlıdır ve reaktif, numunenizde bulunabilecek çözücülerin, tamponların, indirgeyici ajanların ve metal şelatlama ajanlarının varlığından etkilenmez 9,10,11.

Dikkate alınması gereken önemli bir husus, böbrekte hücre infiltrasyonudur. Bu infiltrasyonlar, inflamasyonu kötüleştirmek için sitokinler gibi çözünür faktörlerin salgılanmasını tetikleyerek patogenezi teşvik eder¹². Sızıntılarda hangi hücre popülasyonlarının bulunduğunu daha iyi anlamak için, yararlı bir yöntem lökositleri izole etmektir¹³. Burada, B hücrelerinin renal infiltrasyonunun tespiti örnek olarak kullanılmıştır. Prosedür, deoksiribonükleaz (DNaz) ve kollajenaz içeren bir sindirim işlemi ile başlar, ardından döküntüleri, kırmızı kan hücrelerini ve yoğun granülositleri gideren yoğunluk gradyanı ayrımı ile devam eder. B hücrelerini (CD19+) ve plazma hücrelerini (CD138⁺) izole etmenin nedeni, lupus böbreklerinin bu hücreleri konsantre edebilmesidir¹⁴. Böbrekteki küçük agregalarda B hücrelerinin varlığının klonal genişlemeyi ve dolayısıyla immünoglobulin (Ig) üretimini gösterebileceği öne sürülmektedir. Plazma hücrelerinin bu agregalarda da mevcut olduğu iyi bilinmektedir¹⁵. Lökositler izole edildikten sonra, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), farklı floresan konjuge antikorlarla boyandıktan sonra ilgili hücreleri analiz etmek için kullanılabilir.

İmmünofloresan, 4 μm kalınlığındaki böbrek dokusu örneklerinde proteinlerin floresan olarak görüntülenmesini sağlayan immünohistokimya (IHC) tespit yöntemlerinden biridir. Diğer IHC tespit yöntemleri, analitlerin doğasına, bağlayıcı kimyaya ve diğer faktörlere bağlıdır¹⁶. İmmünofloresan, antijeni spesifik bir florokrom (veya floresan boya) ile etiketlenmiş muadili antikora maruz bırakan hızlı bir tanımlama yöntemidir. Heyecanlandığında, floresan mikroskobun tespit edebileceği ışık üretir. Bu teknik, kompleman C3 ve IgG2a^17'nin birikimini gözlemlemek için kullanılabilir. Aşırı kompleman kaskad aktivasyonu, kontrolsüz bir immün yanıt ve fonksiyon kaybı ile ilişkili olabilir¹⁸. Böbrekte anti-çift sarmallı DNA (anti-dsDNA) otoantikorlarının immün birikimi, IgG2a izotipine sahip olanların LN²⁰ ile ilişkili olduğu büyük bir endişe kaynağıdır¹⁹. Spesifik olarak, anti-dsDNA antikorları, nükleer materyallere daha fazla patojenite ve afinite göstererek bağışıklık kompleksleri oluşturur²¹. IgG2a mevcut olduğunda, bağışıklık komplekslerini temizlemek için C3 dahil olmak üzere kompleman kaskadı aktive edilir²². C3 ve IgG2a belirteçleri ayrı ayrı ölçülebilir veya korelasyonlarını oluşturmak için üst üste bindirilebilir.

Özellikle, serum kreatinin ölçümü, LN^23'ü teşhis etmek için mikroskobik hematüri ve böbrek biyopsileri ile birlikte kullanılabilecek başka bir güvenilir tekniktir. Bununla birlikte, proteinüri varlığı glomerüler hasarın güçlü bir göstergesidir. Bu anlamda, lupus sırasında proteinüri seviyesinin izlenmesi, hastalığın başlangıcını tespit edebilir ve lupus tanısı için diğer yöntemleri tamamlayabilir. Ek olarak, glomerüllerde biriken bağışıklık kompleksleri enflamatuar bir yanıtı indükleyebilir, kompleman sistemini aktive edebilir ve daha fazla enflamatuar hücre alabilir. Bu protokolün dikkat çeken bir diğer noktası da böbrekte B hücresi infiltrasyonudur. Bu, infiltre edilmiş T hücreleri ile birlikte, organ hasarını tetikleyen lokal bağışıklık tepkilerini arttırır. Daha da önemlisi, LN'nin sınıflandırılması sadece mikroskopide görülen glomerüler morfolojik değişikliklere değil, aynı zamanda immünofloresan ile gözlenen immün birikintilere de dayanmaktadır. Bu nedenle, bu protokolde, laboratuvar ortamlarında böbrek fonksiyonlarının analizi için doğru ve uygun maliyetli yöntemler sunulmaktadır.

Mevcut protokol, Virginia Tech'teki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Lupus hastalığı kadınlarda daha yüksek bir insidansa sahip olduğundan, sadece dişi MRL / lpr fareleri kullanılmıştır. Numune toplama 4 haftalıkken başlatıldı ve 15 haftada bitirildi. Fareler ticari kaynaklardan elde edildi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve kurumsal yönergeleri izleyerek belirli bir patojensiz ortamda yetiştirildi ve muhafaza edildi.

1. Proteinüri testi

1. Aşağıdaki adımları izleyerek idrar toplayın.
   1. % 70 etanol püskürterek davlumbazları sterilize edin. Yüzeye steril bir plastik tabaka yerleştirin. Yaklaşık 20 μL sıvı toplamak için uçlar, 1,5 mL tüpler ve bir pipet hazırlayın.
      NOT: Uçlar ve tüpler steril olmalı ve herhangi bir ön işlem yapılmamalıdır.
   2. Kafesi alın ve kaputun içine koymadan önce% 70 etanol püskürtün.
   3. Fareyi bir elinizle tutun ve ventral bölgeye yukarıdan aşağıya nazikçe masaj yapmak için diğer elinizi kullanın.
   4. İdrarı doğrudan toplamak için 1,5 mL'lik bir tüp veya pipet kullanın veya numune düşerse, plastik tabakadan toplayın. Her numune için yeni eldivenler, çarşaflar ve ipuçları kullanın.
      NOT: Bu işe yaramazsa, fareyi izole etmek için steril bir beher kullanın, ardından fare idrara çıktıktan sonra idrarı beherden toplayın.
   5. Fareyi tekrar kafese koyun. Başka bir fare çıkarın ve 1.1.3-1.1.4 arasındaki adımları tekrarlayın.
      NOT: Her fare için numuneyi topladıktan sonra plastik tabakayı ve beheri daima %70 etanol ile temizleyin. İstatistiksel anlamlılık için grup başına en az beş fare gereklidir. İdrar örnekleri 12 aya kadar kullanılıncaya kadar -80 °C'de saklanabilir.
2. Bradford yöntemi²⁴ ile proteinleri sayısallaştırın.
   1. İdrar örneklerinin, Albümin standardının ve Bradford reaktifinin 10-20 dakika boyunca dondurucunun dışında tutarak oda sıcaklığına (RT) gelmesine izin verin.
      NOT: Bradford reaktifi ve Albümin standardı, piyasada satılan bir kitte yer almaktadır (bkz. Albümin standardının başlangıç konsantrasyonu 2 mg/mL'dir. Seri seyreltmeler (1:2 altı kez) su ile yapılmalıdır.
   2. Bradford reaktifini seyreltilmemiş 96 delikli bir plakaya (200 μL / kuyu) ekleyin.
   3. Kuyucuk başına 5 μL seyreltilmemiş idrar numunesi pipeti alın ve düzgün bir şekilde karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapmak için ucu kullanın.
   4. Kopyalar halinde standartlar (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dL) ekleyin. Birkaç kuyuyu boşluk olarak bırakın.
      NOT: Numunelerin ve standartların eklenmesi hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
   5. RT'de 5-10 dakika bekletin.
   6. Plakayı, üreticinin protokolüne göre bir plaka okuyucuda 595 nm'de okuyun (bkz.

2. Böbrek hücrelerinin izolasyonu

1. Fareyi CO₂ (akış hızı: %30-%70 hacim/dak, bilinç kaybı veya ölüm elde etmek için) ile bir odada ötenazi hale getirin ve ardından servikal çıkık elde edin. Her iki böbreği de toplamak için diseksiyona devam edin. Bir buçuk böbreği buz gibi soğuk bir C10 ortamına yerleştirin. Diğer yarım böbreği OCT'ye koyun (adım 3.1.1).
   NOT: C10, %10 fetal sığır serumu, 1 mM sodyum piruvat, %100x MEM esansiyel olmayan amino asitler, 10 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanol ve 100 U/mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640 ile yapılır (bkz.
2. Böbrekleri tane büyüklüğünde (1-2 mm³ adet) kesin ve 1 mg / mL kollajenaz ve 0.2 mg / mL DNaz I içeren 5 mL sindirim tamponunda (bkz. Malzeme Tablosu) RPMI 1640 ortamında 10 mmol / L HEPES içeren 1 saat boyunca 37 ° C'de sürekli hafif sallama ile sindirin.
   NOT: Steril 2 mL'lik bir tüpe 1 mL sindirim tamponu ekleyin ve böbreği kesmek için steril makas kullanın.
3. 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 10 mL 1x buz gibi soğuk PBS ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra süspansiyonu iki kez vorteksleyin.
4. Hücre süspansiyonunu 100 μM'lik bir süzgeçten süzün ve 10 mL HBSS dolu olarak yıkayın.
   NOT: HBSS dolu, 5 mM EDTA, %0,1 BSA ve 10 mM HEPES içerir.
5. RT'de 10 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj.
6. %30,% 37 ve% 70 Stok İzotonik Percoll (SIP) çözeltisi hazırlayın.
   NOT: SIP hazırlamak için 1 parça hacim 10x PBS ve 9 parça Percoll hacmini karıştırın (bkz. SIP'i %30, %37 ve %70 SIP değerlerine kadar seyreltmek için HBSS dolu kullanın.
7. Hücreleri %30 SIP'lik 5 mL'lik bir sürede yeniden askıya alın ve 5 mL'nin %37'sini (üstte) ve 5 mL'nin (altta) %70'ini yükleyerek SIP gradyanını yavaşça bir pastör pipetle yapın.
8. RT'de 30 dakika boyunca 1000 x g'de Up9 down0 (veya fren 0) ile santrifüj.
9. Lökositleri% 37-70% arayüzünden toplayın ve bunları 5 mL C10'da yeniden askıya alın.
10. 4 °C'de 10 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj.
11. Hücre peletini 3 mL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Hücreler FACS boyaması için hazırdır.
    NOT: FACS tamponu 1x PBS ve %0,1 Sığır Serum Albümini (BSA) içerir.
12. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı (SN) atarak yaklaşık 50 μL bırakın.
    NOT: Süpernatanı çıkarmak için, çözeltiyi dikkatlice katıdan uzağa dökün veya pipetleyin ya da süpernatanı aspire etmek için yarı otomatik bir vakum kullanın.
13. Tüp başına 50 μL FcR bloğu ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) (1x PBS'de önceden seyreltilmiş 1/50); 10 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
14. Yıkamak için 2 mL FACS tamponu ekleyin.
15. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın ve SN'yi atarak yaklaşık 50 μL bırakın.
16. Uygun floresan boyadan 20 μL ekleyin (1/100'ü 1x PBS ile seyreltin, Malzeme Tablosuna bakın) ve buz üzerinde 15-30 dakika bekletin.
17. Tüp başına 50 μL antikor 15 karışımı ekleyin: CD138-BV711 (1x PBS'de 1/200) ve CD45-AF700 (^1x PBS'de 1/200) (bkz.
18. Karanlıkta 15-30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın ve 3 mL FACS tamponu ekleyin.
19. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın ve SN'yi vakumlayın, yaklaşık 50 μL. 200 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın. Bu şimdi akış sitometrisi ile analiz edilmeye hazırdır.

3. İmmünofloresan boyama

1. Örnek toplamayı gerçekleştirin.
   1. Yarım böbreği, Optimal Kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile küçük plastik kriyomolda yerleştirin (bkz.
   2. Bir polistiren köpük kutuya kuru buz ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve kriyomoldu dikkatlice kuru buzun üzerine koyun. Kriyokalıpların düz yerleştirildiğinden emin olun.
      NOT: OCT bileşiğinin katılaşması ve beyaza dönmesi 3-4 dakika sürer.
   3. Cryomold'u çıkarın ve alüminyum folyoya sarın. Daha fazla kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu, en az 1 yıl boyunca -80 ° C'de saklanabilir.
2. Numunenin kesitlemesini ve sabitlenmesini gerçekleştirin.
   1. Numuneleri 4 μm kesitler halinde kesin, kuruması için en az 2-3 saat bekleyin ve ardından 10 dakika boyunca soğuk asetonla (4 ° C'de) sabitleyin.
      NOT: Özel bir kimyasal başlık gerektiren aseton kullanırken dikkatli olun.
   2. Kızakları sabitledikten sonra, 0,5-1 saat boyunca hava kurutun ve -20 ° C'de kısa bir süre veya -80 ° C'de uzun süre saklayın.
3. Örnekleri lekeleyin.
   1. Slaytları 5-10 dakika boyunca soğuk asetonda yeniden sabitleyin.
   2. Bölümlerin RT'ye ısınmasına izin verin. Bölümün etrafında bir PAP kalemi kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve kurumasını bekleyin.
      NOT: Tırnak minesi de kullanılabilir. Bu adım, antikor seyreltmesinin kızağın her yerinde yüzmesini önler.
   3. Slaytları 20 dakika boyunca Coplin kavanozunda 1x Tris tamponlu salin (TBS) içine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız), kavanozu çalkalayıcının üzerine koyun ve hafifçe çalkalayın.
   4. 1x TBS dökün ve kavanozu 1x TBS,% 5 BSA ve% 0,1 Ara 20 ile doldurun. Çalkalayıcıda 20 dakika boyunca kuluçkaya yatırın, hafifçe sallayın.
   5. Slaytları çıkarın ve slaytların alt kısmını kurulayın. Gerekirse, slaytları kuru çalkalayın. Bölüme 100 μL konjuge antikorlar²⁵ C3-FITC (1/100) ve IgG2a-PE (1/100) ekleyin (bkz. RT'de nemlendirilmiş bir odada 1 saat boyunca inkübe edin.
   6. Bölümü 1x TBS,% 5 BSA ve% 0,1 Aradaki 20'de 3 kez çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca yıkayın.
   7. Slaytları sallayın ve bölümü bir antifade reaktifi (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından bir kapak parçası ile monte edin.
   8. Slaytları mikroskop altında görüntüleyene kadar 4 ° C'de saklayın (örneğin, konfokal mikroskop veya görüntüleme sistemi mikroskobu). Yazılım kullanarak görüntüleri ölçün ve bölgeler arasındaki floresan yoğunluğunu karşılaştırırken arka plan sinyallerini çıkarın.
   9. ImageJ yazılımını kullanarak görüntü analizi için (bkz. Malzeme Tablosu), istenen bölgeyi ana hatlarıyla belirtin.
   10. Analiz Et'e tıklayarak standart parametreleri ayarlayın, ardından sonuçları almak için Ölçümleri ve Ölçüm Alanını Ayarlayın.
   11. Hesaplama pencerelerinden elde edilen verileri bir elektronik tabloya aktarın.
       NOT: Görüntüden arka plan olarak küçük bir alan seçilebilir; herhangi bir floresan içermemelidir.
   12. İşiniz bittiğinde, bölgeyi ölçmek ve verileri önceki e-tabloya tekrar aktarmak için Analiz Et'i tıklayın.
   13. Birkaç bölge için 3.3.11-3.3.12 arasındaki adımları yineleyin.
   14. Ortalama floresanı Düzeltilmiş Hücre Floresansı (CCF) = Entegre yoğunluk - (Seçilen hücre bölgesi x Ortalama arka plan floresansı) olarak hesaplayın.
   15. Her bölge için hesaplama yapın ve grafik ve istatistik yazılımını kullanarak verileri analiz edin (bkz.

Protokol, lupus nefriti için MRL / lpr farelerini değerlendirmek için birden fazla yöntem kullanır. İlk olarak, zamanla böbrek fonksiyon bozukluğuna bağlı olarak artan proteinüri seviyelerini incelemek için bir prosedür tanımlanmıştır. Şekil 1'de gösterildiği gibi, dişi fareler kontrol grubu olarak 200 μL fosfat tamponlu salin (1x PBS) oral gavajı ve tedavi grubu olarak probiyotik Lactobacillus reuteri ile haftada iki kez 109 cfu / mL konsantrasyonunda tedavi edildi. Tedavi 3 haftalıkken başladı ve 15 haftalıkken bitti. L. reuteri ile tedavi edilen fare grubu, kontrol grubundan daha agresif bir proteinüri ilerlemesine sahipti.

Şekil 1: MRL / lpr farelerinin idrarındaki protein seviyelerinin zamanla tespiti. n = Grup başına 5 fare. İstatistikler basit doğrusal regresyon testi ile gerçekleştirilmiştir. *P 0,05 <, **P 0,01 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2 , izole böbrek lökositlerinin FACS analizini göstermektedir. Bu deneyde fareler vankomisin (2 g / L) veya vankomisin artı E. coli dsDNA (80 μg) ile tedavi edildi. Vankomisin belirtilen süre zarfında içme suyu ile birlikte verildi. Bakteriyel DNA'nın oral gavajı, vankomisin ile tedavi edilen farelere haftada bir kez, 4, 5, 6 ve 7 haftalıkken art arda dört hafta boyunca uygulandı. E. coli dsDNA'nın, böbrek fonksiyonlarının tehlikeye girmesine yol açan plazma hücrelerinin renal infiltrasyonunu tetiklemesi bekleniyordu, ancak anlamlı bir fark bulunamadı.

Şekil 2: İzole böbrek lökositlerindeki plazma hücrelerinin analizi. (A) Sıralı geçiş stratejisi: toplam hücreler, tek hücreler, canlı hücreler, CD45 + hücreleri ve son olarak CD138 + hücreleri. (B) 3 hafta boyunca van (Vankomisin) veya van + DNA (Vankomisin + E. coli dsDNA) ile tedaviden sonra plazma hücrelerinin yüzdesi (grup başına n ≥ 5 fare). İstatistiksel anlamlılık ('ns') gözlenmedi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3'te kadın MRL/lpr böbrek kesitlerinde kompleman C3 ve IgG2a'nın immünofloresan boyanması görülmektedir. Bu deneyde, C3 ve IgG2a'nın renal birikimi ile ilgili çevresel faktörlerin etkisi karşılaştırılmıştır. Şirket içi fareler birkaç nesil boyunca hayvan tesisinde yetiştirildi ve yakın zamanda bir satıcıdan satın alınan farelerle karşılaştırıldı. İmmünohistokimyasal analiz, farklı tesisler arasında herhangi bir fark göstermedi.

Şekil 3: İmmünofloresan boyama yoluyla böbrek kesitlerinde kompleman C3 ve IgG2a'nın saptanması. (A) Anti-C3-FITC (Yeşil) ve anti-IgG2a-PE (Kırmızı) ile boyanmış böbrek kesitlerinin temsili resimleri. (B) İki grup arasında düzeltilmiş hücre floresansının (CCF) karşılaştırılması (grup başına n ≥ 5 fare). Ölçek çubuğu = 100 μM. İstatistiksel anlamlılık ('ns') gözlenmedi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.