Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Drosophila Fotoreseptörlerinde Lipid Sinyalizasyonunun Kütle Spektrometresi Kullanılarak Analizi

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63516

⸱

7 Mart 2022

 ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences-TIFR, GKVK Campus, 2Department of Cell Biology, Yale University, 3Department of Neuroscience, Brown University

Bu makalede

Özet

El yazması, Drosophila fotoreseptörlerinden çeşitli lipit sınıflarını tanımlamak ve ölçmek için çok yönlü, sağlam ve hassas kütle spektrometresi protokolleri sunar.

Özet

Fosfolipaz Cβ'nın (PLCβ) aktivasyonu, Drosophila fotoreseptörlerinde duyusal transdüksiyon sırasında önemli bir adımdır. PLCβ aktivitesi, membran lipid fosfatidilinositol 4,5 bifosfatın [PI(4,5)P2] hidrolizi ile sonuçlanır ve sonuçta geçici reseptör potansiyeli (TRP) ve TRP benzeri (TRPL) kanalların aktivasyonuna yol açar. PLCβ'nın aktivitesi daha sonra birçok lipid türünün üretilmesine yol açar ve bunların birçoğunun TRP ve TRPL aktivasyonunda rol oynadığı öne sürülmüştür. Ek olarak, optimal duyusal transdüksiyon için sinyal reaksiyonlarını optimize etmek için fotoreseptörlerin hücre biyolojisini düzenlemede kilit rol oynamak için birkaç lipit sınıfı önerilmiştir. Tarihsel olarak, bu keşifler, spesifik lipitlerin seviyelerini kontrol eden enzimler için Drosophila mutantlarını izole etme ve bu mutantlarda fotoreseptör fizyolojisinin analizini gerçekleştirme yeteneği tarafından yönlendirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip lipitlerin izolasyonu ve kantitatif analizi için güçlü kütle spektrometresi yöntemleri geliştirilmiştir. Bunlar, radyonüklid etiketlemeye ihtiyaç duymadan fotoreseptörlerden lipid analizinin artık mümkün olduğu Drosophila'da kullanım için özellikle uygundur. Bu makalede, Drosophila fotoreseptörlerindeki çeşitli sinyal lipidlerinin sağlam, hassas ve doğru kantitatif değerlendirmesi için lipid kütle spektrometresinin kullanımındaki kavramsal ve pratik hususlar ele alınmaktadır. Moleküler genetik ve fizyolojik analizdeki mevcut yöntemlerin yanı sıra, bu tür lipitlerin, biyolojideki keşifler için bir model sistem olarak fotoreseptörlerin gücünü arttırması muhtemeldir.

Giriş

Drosophila'daki fototransdüksiyona, ışıkla aktive edilen kanallar TRP ve TRPL1'in aktivasyonuna yol açan G-proteinine bağlı bir PLCβ kaskad aracılık eder. PLCβ, zara bağlı fosfolipid, fosfatidilinositol 4,5 bifosfatı [PI(4,5)P2] hidrolize eder ve diasilgliserol (DAG) ve inositol 1,4,5 trisfosfat (IP3) üretir. DAG daha sonra fosfatidik asit (PA) oluşturmak için DAG-kinaz ile edilir. Daha sonra, lipid ara maddelerinin oluşumunu içeren bir dizi reaksiyon yoluyla, PI(4,5)P2 yeniden üretilir2. Bu PI(4,5)P2 döngüsünün birkaç bileşeni Drosophila fotoreseptörlerinde işlevlere sahiptir. PLC aktivasyonunun TRP ve TRPL kanal kapısına yol açtığı mekanizma çözülmemiştir. Bununla birlikte, birkaç kanıt, PI (4,5) P2 hidrolizi ile üretilen lipid ara ürünlerinin bu işlemearacılık edebileceğini düşündürmektedir 3. Bu nedenle, Drosophila fototransdüksiyonunda TRP ve TRPL'nin aktivasyon mekanizmasına ışık tutmak için bu lipid ara ürünlerinin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi çok önemlidir. Kendi başına fototransdüksiyondaki rollerine ek olarak, lipitler ayrıca fotoreseptörlerin hücresel organizasyonunda birkaç önemli rol oynar (3'te gözden geçirilmiştir). Lipitlerin bu fonksiyonel rollerini anlamak, seviyelerini in vivo olarak tespit etme ve ölçme yeteneği ile desteklenir. Bu makale, Drosophila fotoreseptörlerinden lipitlerin miktarını belirlemek için yöntemlerin seçimi ve uygulanması için protokollerin yanı sıra bir genel bakış sağlar.

Tarihsel olarak, lipit analizi, kimyasal sınıflara göre fraksiyonlamadan ve ardından bireysel sınıfların analizinden oluşuyordu. Lipidleri başarılı bir şekilde tanımlamak ve miktarını belirlemek için, hedefli veya hedefsiz lipid analizleri olan birçok analitik yöntem geliştirilmiştir 4,5,6,7,8,9,10. Hedeflenen analiz, bilinen lipitlere odaklanır ve bu spesifik lipitlerin kantitatif analizi için yüksek hassasiyete sahip özel bir yöntem kullanır. Hedeflenmemiş lipid analizi, bir numunedeki birçok lipid türünü aynı anda tespit etmeyi amaçlar. Bu analitik yöntemler arasında ince tabaka kromatografisi (TLC)4, gaz kromatografisi (GC)5, sıvı kromatografisi (LC)6, enzime bağlı immünosorbent testleri (ELISA)7, nükleer manyetik rezonans (NMR)8, radyonüklid etiketleme ve kütle spektrometresi (MS)9,10 bulunur. Radyoaktif etiketleme, lipitlerin tespiti için hassas bir yöntem olmasına ve kültürlenmiş hücreler bağlamında kullanılabilmesine rağmen, Drosophila gibi bozulmamış organizmalarda lipitlerin analizinde kullanımı, canlı uçan hayvanların radyo-etiketlemesinin güvenlik hususları nedeniyle zordur. Radyoaktif etiketleme ile ilgili diğer zorluk, tüm öncü havuzların dengeye yakın olarak etiketlenmesine bağlı olmasıdır ve bu, in vivo modeller bağlamında zor olabilir.

MS kullanılarak yapılan kapsamlı lipid analizi, modern MS teknolojilerinin gelişmesiyle mümkün olan yeni bir gelişmedir11. Lipitlerin MS tabanlı analizi, küçük numune boyutları, hayvan modellerinden alınan numunelere uygulanabilirlik, yüksek hassasiyet, özgüllük ve yüksek verim gibi çeşitli avantajlar sunar. Özellikle, elektrosprey iyonizasyonunun yaygın kullanımı, lipid analizi için MS'in performansında bir iyileşmeye yol açmıştır. Farklı kütle analizörlerinin kombinasyonu da dahil olmak üzere kütle spektrometrelerinde kütle analizörlerinin iyileştirilmesi, ekstra avantajlar katmış ve yüksek çözünürlüklü bir kütle analizörünün geliştirilmesi, lipid çalışmalarını yeniden canlandırmıştır11. MS tabanlı analiz, lipid moleküllerini iki ana yolla karakterize eder: (1) MS deneylerinin lipidom içindeki küresel değişikliklerin hızlı kantitatif karakterizasyonunu amaçladığı ve yalnızca bozulmamış lipid öncüllerinin doğru kütlelerine dayandığı yukarıdan aşağıya lipidomikler12; (2) Tandem MS13,14 kullanarak karakteristik yapısal parça iyonlarını tespit ederek bireysel moleküler türleri ölçen aşağıdan yukarıya lipidomikler.

Genel olarak, Drosophila fotoreseptörlerindeki lipitlerin analizi iki adımdan oluşur: birincisi, göz / kafa dokusundan lipitlerin çıkarılması ve ikincisi, ekstrakte edilen lipitlerin MS ile analizi. Bu, aşağıdaki yöntemlerden biri kullanılarak gerçekleştirilebilir: lipitlerin MS'ye bağlı sıvı kromatografisi (LC) ile veya shotgun lipidomik/doğrudan infüzyon MS (DIMS) kullanılarak kromatografik ayırma olmadan ayrılması. Her iki lipid profilleme yaklaşımı da elektrosprey iyonizasyon MS (ESI-MS) kullanımına dayanmaktadır ve hassas, kantitatif ve verimli olduğu kanıtlanmıştır10,15. DIMS analizinde, lipitlerin tanımlanması, öncü iyon kütlesine, nötr kayıp taramalarına ve lipid sınıfına özgü imzalaradayanmaktadır 14,16,17,18. Bu yaklaşım, analiz hızını ve sağlamlığı birleştirirken, numunede yüksek bollukta ve yüksek polarize olabilen lipidlerin varlığına bağlı olarak düşük bolluktaki lipitlerin iyon baskılanmasından kaçınılamaz. Bu nedenle, fosfoinositidler ve PA gibi düşük miktarda bulunan lipitler, diğer nedenlerin yanı sıra iyon baskılanması nedeniyle standart DIMS platformları tarafından genellikle tespit edilmez veya yetersiz tespit edilir19,20. MS'den önce sıvı kromatografisi ayırma (LC-MS), iyon baskılanmasının üstesinden gelmenin yanı sıra, ilgilenilen belirli lipid sınıflarının veya türlerinin analizine odaklanmaya yardımcı olabilir21.

Bu makalede, Drosophila fotoreseptörlerinde ilgilenilen başlıca lipitlerin ölçülmesinde yer alan adımlar açıklanmaktadır. Bu bağlamda, üç farklı MS yaklaşımı optimize edilmiştir: (1) yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanan DIMS, (2) üçlü dörtlü kütle spektrometresi kullanan türevlendirme sonrası ters fazlı sıvı kromatografisi-MS (RPLC-MS) ve (3) normal faz sıvı kromatografisi-çoklu reaksiyon izleme-geliştirilmiş ürün iyon taraması-MS (NPLC-MRM-EPI-MS), gelişmiş bir ürün iyon tarama işlevine sahip üçlü dörtlü kütle spektrometresi kullanarak. Bu yöntemler arasındaki seçim, araştırılan belirli araştırma soruları tarafından belirlenir. Fototransdüksiyonda yer alan her türlü gliserofosfolipidin küresel bir tanımı ve analizi için DIMS kullanılmalıdır. Bununla birlikte, bu yaklaşımda fosfoinositidler gibi düşük polarize olabilen ve düşük bollukta gliserofosfolipidlerin tespit edilme olasılığının düşük olduğu unutulmamalıdır22. Bu düşük bolluktaki lipitleri tespit etmek için türevlendirme sonrası RPLC-MS yapılmalıdır. Bu yaklaşımı kullanarak, fosfatidik asit (PA)23,24,25, fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol 5 fosfat (PI5P)26, fosfatidilinositol 4 fosfat (PI4P) ve PI(4,5)P 2 27'yi başarıyla tespit ettik ve miktarını belirledik. DIMS ve türevlendirme sonrası RPLC-MS yöntemleri, lipid sınıfı düzeyinde bilgi üretir. Örneğin, bu iki yöntemi kullanarak, m/z'si aşağıdakiler dahil olmak üzere birden fazla moleküler türle tutarlı olan PA (34:2) ölçülebilir: (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0) ve (viii) PA (20:0/14:2). Bu yöntemler kullanılarak, numunede bulunan PA'nın (34:2) yağlı asil zincir bileşimi hakkında bilgi elde edilemez. Bu zorluk, LC ayrımı, çoklu reaksiyon izleme (MRM) ve gelişmiş ürün iyon taramasını (EPI) birleştiren hibrit bir MS yöntemi ile aşılabilir. Bu yöntem hem hassas hem de nicelikseldir ve şunlara izin verir: doğrudan ölçüm, yani numunenin herhangi bir ön etiketlemesi veya işlenmesi olmadan ve kesin yağlı asil zincir bilgisi ile moleküler türleri oluşturur25. Bu yöntemi kullanarak, çok sayıda moleküler PA türü tanımladık ve gliserol omurgasının SN1 ve SN2'sindeki yağlı asil zincirlerinin tam bileşimini belirledik. Bu yaklaşım, fotoreseptörlerdeki herhangi bir lipit sınıfının spesifik moleküler türlerinin işlevini analiz ederken faydalı olacaktır. Bu analiz türlerinin her biri için burada sunulan ayrıntılı protokoller, Drosophila fotoreseptör fonksiyonu ile ilgili diğer sinyal lipidlerine uyarlanabilir (şemalar için bkz. Şekil 1). Diğer birkaç lipit sınıfının (bu makalede ele alınmamıştır) lipidomik analizi için ayrıntılı yöntemlerin başka bir yerde açıklandığına dikkat edilmelidir. Bunlar arasında seramidler28,29, sfingolipidler30,31, digliseritler ve trigliseritler32,33 gibi nötr lipitler ve steroller15,33 bulunur. Bazı durumlarda, bu lipitlerin analizi için yöntemler Drosophila larva dokuları için tanımlanmıştır ve fotoreseptörlerde kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Sinek yetiştiriciliği ve kimyasalların hazırlanması

  1. Arka sinekler (Drosophila melanogaster), iç aydınlatma olmadan 25 ° C'de% 50 bağıl neme sahip bir inkübatörde standart sinek yemi üzerinde. 80 g/L mısır unu, 20 g/L D-glikoz, 40 g/L sakaroz, 8 g/L agar, 15 g/L maya özütü, 4 mL propiyonik asit, 0,7 g/L TEGO (metil para hidroksibenzoat) ve 0,6 mL ortofosforik asit ekleyerek sinek yemi hazırlayın ve ayrıca34'te tarif edildiği gibi https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. ~2.000 lux'lük sürekli beyaz ışık aydınlatması ile 25 ° C'de tutulan soğutulmuş bir inkübatörde, eklosiyon sonrası bir sinek seti büyütün.
  2. 250:500:200 (hacim/hacim/hacim) oranında kloroform:metanol:2,4 M hidroklorik asit ekleyerek fosfoinositid elüsyon tamponu (PEB) hazırlayın. Metanol: 1 M hidroklorik asit: 235: 245: 15 (hacim / hacim / hacim) oranında kloroform ekleyerek alt faz yıkama tamponu (LPWS) hazırlayın. 8:4:3 (hacim/hacim/hacim) oranında kloroform:metanol:su ekleyerek türevlendirme sonrası yıkama solüsyonu hazırlayın.
    NOT: MS sınıfı çözücüler ve kimyasallar kullanın. PEB ve LPWS tamponunu 3 aydan fazla saklamayın.
  3. Fosfoinositidler, PI4P ve PI (1.7) P 100 içinC4 (4,5 μm x 1 mm x 2 mm) sütununu ve PA, fosfatidilkolin (PC) ve fosfatidilinositol (PI) için C18 sütununu (1.0 mm x 100 mm x 1.7 mm) kullanın. NPLC-MRM-EPI yöntemi için silika kolonunu (1 mm x 150 mm x 3 μm) kullanın.
  4. 68:30:2 (hacim/hacim/hacim) oranında heksan:izopropil alkol:100 mM sulu amonyum asetat ekleyerek eluent A'yı ve heksan:izopropil alkol:100:70:20:10 (hacim/hacim/hacim) oranında 100 mM sulu amonyum asetat ekleyerek eluent B'yi hazırlayın. Suya% 0.1 formik asit ekleyerek fosfoinositidler için çözücü A'yı ve asetonitrilde% 0.1 formik asit ekleyerek çözücü B'yi hazırlayın.

2. Doku izolasyonu

  1. Karbondioksit (CO2) anestezisi (sinekler saniyeler içinde hareketsiz hale gelir) kullanarak numune başına 10 sinek toplayın ve bir CO2 anestezi plakası üzerinde keskin bir bıçak kullanarak sineklerin başını alın.
  2. 1,5 mL'lik tüplerde tanımlanmış yaştaki (12-24 saat eski) koyu veya ışığa adapte olmuş sinekleri toplayın ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Sinekleri asetonda -80 ° C'de 48 saat boyunca bir cam şişede35 kurutun. Retina dokusu için, dondurularak kurutulmuş sineklerden 100 retina toplayın. Bir neşter kullanarak, gözleri başın geri kalanından çıkarın ve retinayı çıkarın.
  3. Fosfoinositidler PI4P ve PI(4,5)P2 analizi için, taze retina ile çalışırken, aydınlatma sırasında lipid seviyelerini ölçmek için uygun aydınlatma koşulları altında yetiştirilen sineklerden ve karanlıkta lipid seviyelerini ölçmek için ışıksız yetiştirilen sineklerden numune başına 25 retina kullanın. Ekstraksiyona hazır olana kadar kuru buz üzerinde homojenizatör tüplerinde 50 μL 1x PBS'de saklayın.

3. Lipid ekstraksiyonu

DİKKAT: Kloroform toksik bir çözücüdür ve doğası gereği kanserojendir. Üreme sistemini etkiler ve cildi ve gözü tahriş eder. Bu kimyasalın kullanımında önlem alınmalıdır. Kloroform içeren tüm adımlar iyi havalandırılan bir kimyasal başlıkta gerçekleştirilmelidir.

  1. PI4P ve PI(4,5)P2 dışındaki tüm gliserofosfolipidler için
    1. Her numune için, 0.1 mL 0.1 N buz gibi soğuk metanolik HCl ve 30 μL dahili standart karışım (PA (17:0/14:1), PC (17:0/14:1), lizofosfatidik asit (LPA; 13:0), lizofosfatidilkolin (LPC; 13:0), LPC (17:1), PA (17:0/17:0), PA (16:0-D31/18:1), LPA (17:1), LPC (19:0), PI (12:0/13:0), PA (12:0/13:0) ve PC (12:0/13:0)). Herhangi bir lipit standardının nihai miktarı, kütle spektrometresinin doğrusal tepki eğrisi içinde kalacak şekilde standartlar hazırlayın.
    2. Tüm numunelerin hızlı ve eş zamanlı olarak işlenmesini sağlayan otomatik bir homojenizatör kullanarak dokuları homojenize edin. Tüpleri bir masa üstü santrifüjde kısaca döndürün ve pelet oluşmadığından emin olun - bu tam homojenizasyonu gösterir. Metanolik homojenatı 2 mL kapaklı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    3. Tüpteki kalıntı materyali geri kazanmak için 0,2 mL buz gibi 0,1 N metanolik HCl ekleyin ve 2 mL'lik tüpte birleştirin. 0.1 mL 0.1 N buz gibi soğuk metanolik HCl ve ardından 0.8 mL kloroform ekleyin ve iyice karıştırın. Doku homojenatı içeren karışımın 10 dakika buz üzerinde durmasına izin verin ve ardından 0.4 mL% 0.88 KCl ekleyin ve 30 saniye boyunca girdap yapın.
    4. Sulu ve organik fazları ayırmak için karışımı 1.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Sulu faz ile karıştırmadan lipit içeren alt organik fazı çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve 2 mL'lik taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Lipid ekstraksiyonu sırasında, aşağı akış lipid analizini engelleyebilecek sulu faz ile karıştırmayı önlemek için alt organik fazı çok dikkatli bir şekilde aktarın.
    5. Bu lipit çözeltisini 4 °C'de bir vakumlu evaporatörde kurutun, tam kurumayı sağlamak için numuneyi görsel olarak inceleyin. Analiz için 420 μL 2: 1 metanol: kloroform karışımı içinde yeniden süspanse edin. Numuneleri depolamadan hemen analiz edin.
  2. Fosfoinositidler PI4P ve PI(4,5)P2 için
    1. 25 retinayı 950 μL fosfoinositid elüsyon tamponunda (PEB; 250 mL CHCl3, 500 mL metanol ve 200 mL 2.4 M HCl) homojenize edin ve dahili standartlar ekleyin (fosfatidiletanolamin (PE) 17:0/14:1; PI (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); ve numune başına 50 ng PI, 25 ng PI4P, 50 ng PI(4,5)P2 ve 0.2 ng PE içeren PI(4,5)P2 (16:0/16:0)) karışımı.
    2. Her biri 250 μL kloroform ve 2.4 M HCl ekleyin, ardından 2 dakika sonikasyon ve faz ayrımı için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleme yapın. Alt organik fazı yeni bir tüpe alın, 900 μL LPWS ile yıkayın ve 1.000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    3. Adım 3.2.2'deki gibi bir faz ayrımı gerçekleştirerek bir kez daha kalan sulu fazdan lipitleri çıkarın. Toplanan organik fazları 4 °C'ye ayarlanmış bir vakumlu santrifüjde kurutun, tam kurumayı sağlamak için numuneleri görsel olarak inceleyin.

4. Organik fosfat tahlili

  1. 7.34 mM KH2PO4'lük bir stok çözeltisi yapın. Standart seyreltmeleri, damıtılmış su kullanarak, Tablo 1'e göre mikrosantrifüj tüplerinde yapın. Tüpleri hafifçe girdaplayın ve standart seyreltmeleri fosfat içermeyen cam tüplere aktarın.
  2. Lipid örneklerini içeren ayrı bir cam tüp seti hazırlayın. Lipid numunelerinin hacmini, 630 nm'deki absorbans (bu protokolün tamamlanmasından sonra) standart KH2PO4 (0 ila 20x olan) aralığına düşecek şekilde optimize edin.
  3. Standart seyreltmeler içeren cam tüpleri kuruluğu tamamlamak için 120 °C'de ısıtın. Lipid numunelerini içeren cam tüpleri (standart KH2PO4 aralığında absorbansa sahip olması gereken toplam numunehacminin 1/8'ini alın) kuruluğu tamamlamak için 90 ° C'de ısıtın.
  4. Tüm tüplere 50 μL %70 perklorik asit ekleyin ve 180 °C'de 30 dakika ısıtın. Tüpleri oda sıcaklığına soğutun. Her tüpe 250 μL su, 50 μL %2.5 amonyum molibdat ve 50 μL %10 askorbik asit ekleyin.
    NOT: %2,5 amonyum molibdat ve %10 askorbik asit ağırlık/hacim konsantrasyonlarıdır. Taze yapılmaları gerekir ve 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilirler.
  5. Tüpleri 37 °C'de 1 saat çalkalanan bir inkübatörde tutun. 130 μL numuneyi 96 oyuklu bir plakaya alın ve bir spektrofotometre kullanarak 630 nm'de absorbansı ölçün.

5. Türevlendirme

DİKKAT: Trimetilsilildiazometanın (TMSD) insanlarda birçok toksikolojik etkiye sahip olduğu bildirilmektedir. Çözeltideki TMSD böbrek, karaciğer, gastrointestinal sistem, iskelet kasları, merkezi sinir sistemi ve solunum ve üreme sistemlerini hedefler. Bu kimyasalı kullanırken son derece dikkatli olunmalıdır. Tüm işlem iyi havalandırılan bir kimyasal davlumbazda gerçekleştirilmelidir.

  1. Adım 3.2.3.'ün sonundan elde edilen numunelerin alt organik fazına 50 μL 2 M TMSD ekleyin. Reaksiyonun 250 rpm'de sürekli çalkalama ile oda sıcaklığında 10 dakika ilerlemesine izin verin. 10 dakika sonra, çözeltideki sarı rengin kaybolmasıyla gösterilen reaksiyonu söndürmek için 10 μL buzlu asetik asit ekleyin.
  2. Söndürme reaksiyonunda oluşanN2'yi çıkarmak için tüplere dokunun ve dikkatlice açın. N2 gazı çıktıktan sonra tüpleri kapatın ve döndürün. Daha sonra 600 μL derivasyon sonrası yıkama solüsyonu ekleyin ve 250 rpm'de bir karıştırıcıda 2 dakika vorteksleyin.
  3. Oluşacak üst fazdan ~ 400 μL atın. Adım 5.2'yi tekrarlayın. Tüm üst fazı atın ve alt faza 50 μL %90 metanol ekleyin ve karıştırın.
  4. Numuneleri, vakumda çalışan 800 x g'lık bir santrifüj yoğunlaştırıcıda 2 saat kurutun. Kuruduktan sonra, tüpler kalan numuneden ~ 20 μL içermelidir. 180 μL %100 metanol ekleyin, iyice karıştırın ve LC-MS/MS'den önce 2-3 güne kadar 4 °C'de saklayın.

6. Veri toplama ve analizi

  1. Doğrudan infüzyonda veri toplama MS (DIMS)
    NOT: MS, doğrudan infüzyon veya sıvı kromatografisi MS (LC-MS) yöntemi ile yapılabilir. Bu bölümde, doğrudan infüzyon bazlı MS'i tarif ediyoruz.
    1. Deneye başlamadan önce, kütle spektrometresini üreticinin talimatlarına göre kalibre edin.
    2. Sentetik standartların seyreltme serisi için doğrusal bir yanıt eğrisi oluşturun ve cihazın doğrusal tepkisine bağlı olarak, numuneyi, lipid analitinin yoğunluğu cihazın doğrusallığı içine düşecek şekilde seyreltin. Toplam lipid ekstraktlarını veya lipid standartlarını 2:1 metanol:kloroform (hacim/hacim) karışımıyla seyreltin. Her deney için toplam lipid ekstraktlarının ve sentetik standartların ayrı ayrı seyreltilmesini seçin.
    3. Ekstraktları ve standartları ayrı şişelere aktarın. Numunelerin MS numune şişelerine aktarılması sırasında hava kabarcıklarından kaçının. Hava kabarcıkları kolonda yüksek basınç oluşturacak ve lipit analizini engelleyecektir.
    4. Analizden önce, numuneleri 9 dakika boyunca 6.440 x g'da santrifüjleyin ve 96 oyuklu bir plakaya yükleyin ve alüminyum folyo ile kapatın.
    5. Doğrudan infüzyon yöntemini kullanarak yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresi üzerinde MS analizleri gerçekleştirin. 4.1 μm çapında püskürtme nozullarına sahip çipler kullanarak robotik bir nanoakış iyon kaynağı kullanarak gliserofosfolipidlerin kararlı ESI bazlı iyonizasyonunu elde edin.
    6. Özel bir kütle spektrometresi yazılımı kullanarak iyon kaynağını kontrol edin ve iyonizasyon voltajlarını pozitif ve negatif modlarda sırasıyla +1,2 kV ve -1 kV'a ayarlayın; her iki modda da 1 psi'de geri basınç; ve 180 ° C'de iyon transfer kılcal damarının sıcaklığı. Kütle çözünürlüğünde edinimi gerçekleştirin, Rm/z400 = 100.000. Kütle spektrometresi parametrelerini ayarlamak için yazılım arayüzü için Şekil 2A'ya bakın.
    7. Kurutulmuş toplam lipid ekstraktlarını 400 μL kloroform:metanol (1:2) içinde yeniden çözün. Analiz için, 60 μL numuneyi 96 oyuklu bir plaka iyon kaynağına yükleyin ve alüminyum folyo ile kapatın. PC, fosfatidilserin (PS), fosfatidiletanolamin (PE), PE-O (eter bağlı fosfatidiletanolamin), seramid (Cer) ve seramid fosfatı (Cer-P) tespit etmek için her numuneyi pozitif iyon modunda 20 dakika boyunca analiz edin.
    8. PA ve PI'nin tespit edildiği 20 dakika boyunca negatif iyon modunda bağımsız bir alım gerçekleştirin. Yüksek çözünürlüklü MS için veri toplama için cihaz kurulumunun belirli ayrıntıları ve veriye bağlı edinme (DDA) kurulumuna dahil edilen PA türlerinin hedeflenen bir listesi için Şekil 2B'ye bakın.
      NOT: DDA yönteminin kurulumu için yazılım arayüzü Şekil 2C'de gösterilmiştir. Bu yaklaşımda hedeflenen PA moleküllerinin listesi Tablo 2'de listelenmiştir. DDA yaklaşımındaki deneysel sonucun bir ekran görüntüsü Şekil 2D'de gösterilmektedir.
  2. Direkt infüzyon MS'de veri analizi (DIMS)
    NOT: Her tür kütle spektrometresi tarafından üretilen kütle verilerinin analizi, otomatik bir lipid analiz platformu gerektirir. LipidXplorer36 , her türlü DIMS lipid deneyini destekleyen, ticari olmayan bir yazılımdır. Bu yazılımı burada bulabilirsiniz: https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. Veriler, adım 6.1'de açıklanan yöntemler kullanılarak elde edildikten sonra, monoizotopik tepe noktalarının m/z'sini karşılık gelen temel bileşim kısıtlamalarıyla eşleştirerek bir lipit analiz platformu kullanarak lipit türlerini tanımlayın. Veri içe aktarma örneği Şekil 3A'da gösterilmiştir. Kütle spektrometresi yazılımı tarafından bildirilen gürültü seviyesine göre kütle toleransını 10 ppm ve yoğunluk eşiğini ayarlayın.
    2. İçe aktardıktan sonra, Şekil 3B'de gösterilen PA'nın kimyasal yapısına dayalı olarak PA için moleküler parçalanma sorgu dili (MFQL) sorgularını derleyin. Lipid analiz platformunda ayarlanan MFQL için Şekil 3C'ye bakın.
    3. Benzer bir yaklaşım kullanarak, lipid analiz platformu yazılımında diğer gliserofosfolipidler için MFQL'yi derleyin. Her sorgu bir lipid sınıfını hedefler ve tek bir yürütmede birçok sorgu kullanılabilir.
    4. Çalıştır düğmesine tıklayarak tüm MFQL'leri çalıştırın. Tanımlanan tüm lipid türleri, lipitlerin müteakip miktar tayini için karşılık gelen öncü ve/veya fragman iyonlarının bollukları ile birlikte .csv dosya formatında tek bir sonuç dosyasında rapor edilir. Çıktının bir örneği Tablo 3'te verilmiştir.

7. Türetilmiş numunelerin sıvı kromatografisi ve tandem MS'si

  1. Adım 5.4'ten elde edilen numuneleri, ultra performanslı bir sıvı kromatografi sistemi kullanarak sıvı kromatografisi ile ayırın. Bu sistemi seçerken, yazılımının analiz için kullanılan kütle spektrometresinin yazılımıyla entegre olabildiğinden emin olun.
  2. Sistemi üçlü dört kutuplu kütle spektrometresine bağlayın. Bir ayırma sütunu seçin. PI4P ve PI(4,5)P2 dışındaki lipitlerin ayrılması için bir C18 sütunu (1.0 mm x 100 mm x 1.7 mm) seçin. PI4P ve PI(4,5)P2 için, 300 ş(1,0 mm x100 mm x 1,7 μm) boyutlarında bir C4 sütunu seçin.
  3. Amonyum formatı önce kütle spesifikasyon dereceli suda ve daha sonra organik çözücülerde çözerek amonyum format içeren mobil fazı hazırlayın. Hava kabarcıklarını gidermek için kütle spektrometresinde kullanılan tüm çözücüleri 20 dakika boyunca sonikleştirin.
  4. Su + %0.1 formik asit içeren çözelti A ve asetonitril + %0.1 formik asit içeren çözelti B'yi infüze ederek sütunu dengeleyin.
  5. Elüatı sıvı kromatografi sisteminden (1-20 μL aralığında enjeksiyon hacmi) analiz için kütle spektrometresine enjekte edin. Akış hızını 0.1 mL/dk'ya ve kolonun sıcaklığını oda sıcaklığına ayarlayın. Kolondan çıkan tüm elüte hacmini kütle spektrometresine enjekte edin.
  6. Numune enjeksiyon dizisinde, her zaman boş bir çözücü enjeksiyonu (metanol) ile başlayın ve kütle spektrometresi çalışması kalite kontrol kontrolleri (her altıncı çalışmada bir) için biyolojik numuneler arasında aralıklı olarak temiz standart numuneler bulundurun.
  7. Hibrit üçlü dört kutuplu iyon tuzağı kütle spektrometresi deney kurulumu için, deneye başlamadan önce kütle spektrometresini üreticinin talimatlarına göre kalibre edin. PA, PC ve PI için, iyonları oluşturmak için elektrosprey iyonizasyonu (ESI) kullanın ve pozitif yüklü lipid türlerini tespit etmek için pozitif modda çalışın. Verileri elde edin ve sistemle birlikte kurulu veri analiz yazılımını kullanarak analiz edin.
  8. Analiz için parametreleri, kullanılan ilgili dahili standarda göre optimize edin. Kütle spektrometresi parametreleri aşağıdaki gibidir: bekleme süresi = 30 ms; CAD (çarpışma ile aktive edilen ayrışma) = 3 psi; GS1 (kaynak gaz 1) = 24 psi ve GS2 (kaynak gaz 2) = 21 psi; CUR (perde gazı) = 30 psi; IS (ESI voltajı) = 4,5 kV; ve TEM (kaynak sıcaklığı) = 450 °C.
  9. PI4P ve PI(4,5)P2 için pozitif modda kütle spektrometresi kullanın. Kütle spektrometresi parametreleri aşağıdaki gibidir: bekleme süresi = 65 ms; CAD (çarpışma ile aktive edilen ayrışma) = 2 psi; GS1 (kaynak gaz 1) ve GS2 (kaynak gaz 2) =20 psi; CUR (perde gazı) = 37 psi; IS (ESI voltajı) = 5.2 kV; ve TEM (kaynak sıcaklığı) = 350 °C.

8. Normal faz sıvı kromatografisi-çoklu reaksiyon izleme-geliştirilmiş ürün iyon taraması MS (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. Kromatografik koşullar
    1. PA'yı diğer fosfolipidlerden ayırabilen bir silika sütunu kullanarak normal bir faz LC yöntemi kullanın. Mobil faz A olarak 68:30:2 oranında heksan:izopropil alkol:100 mM suluNH4COOH ve mobil faz B olarak 70:20:10 oranında izopropil alkol:heksan:100 mM suluNH4COOH kullanın.
      NOT: Bu kombinasyon, farklı moleküler PA türlerinin en iyi ayrılmasını ve tepe seçiciliğini sağlamıştır.
    2. Optimum koşulları seçmek için referans bileşiklerin (iç standartlar) çözünürlük ve tepe şekli açısından kromatografik davranışını kullanın.
    3. Ultra performanslı bir sıvı kromatografi kolonunda oda sıcaklığında normal fazlı bir silika kolonunda (1 mm x 150 mm x 3 μm) kromatografik ayırma gerçekleştirin. Otomatik örnekleyici enjeksiyon hacmini 6 μL'ye ve eluent akış hızını 210 μL/dk'ya ayarlayın.
    4. Mobil faz A'nın %100'ü ile 5 dakikalık dengelemeden sonra, mobil faz B'yi doğrusal olarak 5 dakikada %30'a, 5 dakikada %80'e, ardından 5 dakikada %100'e yükseltin ve 5 dakika boyunca %100'de sabit tutun. Son olarak, sütunu 9 dakika boyunca yeniden dengeleyin.
  2. Kütle spektrometresi
    1. Negatif ESI modunda çalışan hibrit bir üçlü dört kutuplu iyon tuzağı kütle spektrometresi kullanın. Sağlanan analiz yazılımını kullanarak sistemin çalışmasını ve veri toplamayı kontrol edin. Deneye başlamadan önce, kütle spektrometresini üreticinin talimatlarına göre kalibre edin.
    2. Dahili standart karışımın akış enjeksiyon analizini kullanarak kaynak parametrelerini optimize edin. Buna göre, iyon püskürtme voltajını = -4,5 kV, kaynak sıcaklığını (TEM) = 450 °C, çarpışmayla etkinleştirilen ayrışma gazını (CAD) = 3 psi olarak ayarlayın. Çarpışma gazı olarak nitrojen gazı kullanın ve nebulizatör gazı (GS1) = 24 psi, yardımcı gaz (GS2) = 21 psi ve perde gazı (CUR) = 30 psi'yi ayarlayın.
    3. Bileşiğe bağlı iyon yolu parametrelerini, iç standart karışım çözeltisinin sürekli infüzyonu kullanılarak optimize edilmiş, küme çözme potansiyeli (DP) = -42 V, giriş potansiyeli (EP) = -6 V ve çarpışma hücresi çıkış potansiyeli (CXP) = -12 V olarak ayarlayın. Kütle spektrometresinde bulunan EPI tarama işlevini kullanarak parçalanma analizi için 12 eV'den 40 eV'ye kadar değişen çarpışma enerjisine (CE) sahip ürün MRM geçişlerinin öncüsü ile birlikte tam ürün spektrumlarını kaydedin.
      NOT: MRM ile tetiklenen IDA tabanlı EPI, öncü iyon ürününü, iyon taramasını ve anında MS/MS edinimini aynı anda kaydeder. MRM, dört kutuplu 1'de (Q1) iyon tarama aralığını daralttı ve iyon tuzağı, Q2'den geçen iyon parçalarını geliştirdi, böylece özellikle öncü iyondan kaynaklanan tüm parçaların yakalanması için dört kutuplu MS / MS'nin kalitatif yeteneğini büyük ölçüde geliştirdi. EPI modunda, öncü iyonlardan kaynaklanan çoklu parça iyonları, Q3'te daha iyi sinyal-gürültü oranıyla tespit edilir.
    4. Yüksek hassasiyet elde etmek için 39 eV CE ile MRM deneyleri yapın. Çalışma sırasında herhangi bir zamanda kromatografik kolondan çıkan herhangi bir spesifik molekülün MRM'sini algılamak ve kaydetmek için maksimum MRM sayısını 75 ile sınırlayın ve bekleme süresini 30 ms ile sınırlayın. Bu, makinenin görev döngüsünü artırır.
    5. Yukarıda açıklandığı gibi PA için en iyi iyonizasyon parametrelerine karar vermek için deneysel ayarlama yapın. Bu deney için, iyon püskürtme voltajını = -4.5 kV, kaynak sıcaklığını (TEM) = 450 °C, çarpışmayla aktive olan ayrışma gazını (CAD) = 3 psi olarak ayarlayın. Çarpışma gazı olarak nitrojen gazı kullanın. Nebulizatör gazı (GS1) = 24 psi, yardımcı gaz (GS2) = 21 psi ve perde gazı (CUR) = 30 psi'yi ayarlayın.
    6. İyonizasyon parametrelerinin ve ürün iyonlarının doğru seçimini sağlamak için tüm ayar verilerini manuel olarak inceleyin. Ürün iyonunu seçerken MRM kanalları arasındaki potansiyel paraziti en aza indirmeyi göz önünde bulundurun. Tüm PA moleküler türlerinin analizi için kullanılan deneysel parametreler Tablo 4'te gösterilmektedir.
      NOT: Hibrit üçlü dört kutuplu doğrusal iyon tuzağı kütle spektrometresi, MRM tarama modunu iyon tuzağı tarama işleviyle birleştirmemize olanak tanır, böylece tespit edilen her öncünün yararlı tandem kütle spektrumlarını kaydetmek için EPI taraması gibi yöntemleri kullanarak hızlı ve yüksek tarama sağlar. Bu çalışmada, PA'nın farklı moleküler türlerini tanımlamak için, analiz yazılımı tarafından kontrol edilen iyon tuzağının EPI tarama özelliğine sahip geleneksel üçlü dört kutuplu iyon yoluna dayanan bu MRM-EPI tabanlı MS/MS yaklaşımından yararlandık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

MS'de ölçümün doğrusallığının belirlenmesi. Doğrusallık, MS yönteminin lipid analitinin konsantrasyonu ile doğru orantılı sonuçlar sağlama yeteneğidir. Doğrusallık, (a) lipid analitinin iyonlaşma verimliliğine bağlıdır ve (b) lipid analitinin farklı konsantrasyonlardaki iyonlaşma davranışı, kullanılan iyon kaynağına bağlıdır. Bu çalışmada kullanılan elektrosprey iyonizasyonunda (ESI), doğrusallık, (a) ESI kaynağından kütle analizörüne iyon taşınmasına ve (b) kütle analizörü tasarımına ve dedektörün sinya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bir dizi kanıt, Drosophila fotoreseptörlerinin organizasyonunu ve işlevini düzenlemede sinyal lipitlerinin çoklu rolleri üzerinde birleşmektedir. Lipitlerin fototransdüksiyon3'ü düzenlemedeki iyi çalışılmış rolüne ek olarak, sinyal lipitleri ayrıca protein kaçakçılığı ve hücre altı organizasyonda da rol oynamıştır 23,30,39,40,41.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu el yazmasında anlatılan çalışma, Hindistan Hükümeti Atom Enerjisi Bölümü tarafından desteklenmiştir (Proje Kimlik No. RTI 4006), Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü (BT/PR4833/MED/30/744/2012) ve Hindistan İttifakı Kıdemli Bursu (IA/S/14/2/501540) ile PR. NCBS Kütle Spektrometresi Tesisi'ne, özellikle Dr. Dhananjay Shinde ve PR laboratuvarı üyelerine bu yöntemlerin geliştirilmesine katkılarından dolayı teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.1 N metanolik HCLToplam lipid izolasyonu için
%0.88 KClSigma AldrichP9541Toplam lipid izolasyonu için
1.5 ml / 2ml LoBind Eppendorf tüpleriEppendorf,022431081/022431102Toplam lipid izolasyonu için
2.3.18 16:0/18:1 Dieter PEAvanti polar lipidler999974Lipid İç Standardı
%37 saf HClSigma Aldrich320331Toplam lipid izolasyonu için
96 oyuklu plakaToplam Organik Fosfat tahlili
AsetonFisher Scientific32005Diseksiyonlar için
Amonyum molibdatToplam Organik Fosfat tahlili
Askorbik AsitToplam Organik Fosfat tahlili
Banyo sonikatörü
BEH300 C18 sütunu [1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
Bıçak tutucuİnce Bilimsel Araçlar10052-11Diseksiyonlar için
BOD inkübatörüToplam Organik Fosfat tahlili
Kırılabilir bıçaklarİnce Bilimsel aletler10050-00Diseksiyonlar için
Yağlı kağıtGE sağlık10347671Diseksiyonlar için
C4, 300 A0, [1.7 μ m x1 mm x 100 mm] sütunSular Hindistan Pvt. Ltd.186004623LC
Kromatografi kehribar renkli cam şişeler, eklerile Merck27083-U
d18:1/17:0)Avanti polar lipidler860517Lipid Dahili Standart
d5-Fosfatidilinositol 3,5-bifosfat [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Avanti polar lipidler850172Lipid Dahili Standart
Diseksiyon mikroskoplarıOlympusSZ51Diseksiyonlar için
Kuru ısı banyosu.
Eluent AHeksan: İzopropil alkol: 100 mM sulu amonyum asetat (68: 30: 2), LC
için Eluent BHeksan: İzopropil alkol: 100 mM sulu amonyum asetat (70: 20: 10), LC için
Filtre kağıdıIndica-HM274039Diseksiyonlar için
ŞişelerBorosilDiseksiyonlar için
Sinekler NANARaghu Padinjat lab
Fly foodNANANCBS lab mutfak, bileşim: mısır unu 80 g/L, D-glikoz 20 g/L, sükroz 40 g/L, agar 8 g/L, maya özütü 15 g/L, propiyonik asit 4 mL, TEGO (metil para hidroksibenzoat) 0,7 g/L, ortofosforik asit 0,6 mL)
Forsepsİnce Bilimsel Araçlar11254-20Diseksiyonlar için
Çeker ocak
HunisiBorosilDiseksiyonlar için
Buzlu asetik asitFisher ScientificA35-500Türevlendirme için
Cam şişeler: şeffaf ve kehribar rengiToplam lipid izolasyonu için
Yüksek sıcaklığa dayanıklı fosfat içermeyen cam tüpler.Toplam Organik Fosfat tahlili
Zirkonyum oksitToplam lipid izolasyonu için
Homojenizatör cihazıPrecellys
Nemlendirilmiş CO2 sinek pedlerineSinek itme için
Aydınlatma kontrollü inkübatörlerPanasonic SanyoMIR-553Sinek için yetiştirme
İlk organik karışımmetanol: kloroform (2: 1), Toplam lipid izolasyonu için
LC-MS sınıfı KloroformSigma Aldrich650498Toplam lipid izolasyonu için
LC-MS sınıfı MetanolSigma Aldrich34860Toplam lipid izolasyonu için
LC-MS sınıfı suSigma Aldrich34877Toplam lipid izolasyonu için
Işık metreHTC aletleriLX-103
Düşük tutma uçlarıEppendorf0030072006/72014/72022/72030Toplam lipid izolasyonu için
LTQ Orbitrap XL cihazıThermo Fisher Scientific, Bremen, Almanya
Lizofosfatidik asit (LPA)- 13:0Avanti polar lipidlerLM-1700Lipid Dahili
Standart Lizofosfatidik asit (LPA) - 17: 1Avanti polar lipidlerLM 1701Lipid İç
Standardı Lizofosfatidilkolin (LPC) -13:0Avanti polar lipidlerLM-1600Lipid İç Standart
Lizofosfatidilkolin (LPC) -17:1Avanti polar lipidler855677Lipid İç
Standardı Lizofosfatidilkolin (LPC)- 19:0Avanti polar lipidler855776Lipid İç Standardı
Perklorik asit.Toplam Organik Fosfat tahlili
Fosfat standardı potasyum dihidrojen fosfatToplam Organik Fosfat tahlili
Fosfat tamponlu salin (PBS)NANABileşimi: 137mMNaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4 ve 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Fosfatidik asit (PA)- 12:0/13:0Avanti polar lipidler, LM-1400  Lipid İç
Standart Fosfatidik asit (PA) - 17: 0 / 14: 1Avanti polar lipidlerLM-1404Lipid Dahili
Standart Fosfatidik asit (PA) - (17: 0/17: 0)Avanti polar lipidler830856Lipid Dahili
Standart Fosfatidik asit (PA) -16: 0-D31 / 18: 1Avanti polar lipidler860453Lipid Dahili
Standart Fosfatidilkolin (PC) -12: 0/13: 0Avanti polar lipidlerLM-1000Lipid İç
Standart Fosfatidilkolin (PC)- 17:0/14:1Avanti polar lipidlerLM-1004Lipid İç Standart
Fosfatidiletanolamin (PE) - 17:0/14:1Avanti polar lipidlerLM-110Lipid İç
Standart Fosfatidilinositol (PI) - 17:0/14:1Avanti polar lipidlerLM-1504Lipid İç Standardı
Fosfatidilinositol 4,5-bifosfat [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Avanti polar lipidlerLM-1904Lipid İç
Standart Fosfatidilinositol 4-fosfat (PI4P) - 17:0/20:4Avanti polar lipidlerLM-1901Lipid Dahili
Standart Robotik nanoflow iyon kaynağıTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, ABD)
Rotospin enstrümanTarsons3090X
Silikon pedlerDiseksiyonlar
çözücü Asuda% 0.1 formik asit, LC
için çözücü B% 0.1 formik asit asetonitrilde, LC
için Masa üstü santrifüj
Termo-karıştırıcı
TMS-diazometanAcrosAC385330050Türevlendirme için
Üçlü dört kutuplu kütle spektrometresiAB SciexQTRAP 6500
UPLC sistemiSular Acquity
Vakum santrifüj yoğunlaştırıcıScanvac, Labogene
Vorteks makinesi
boncuklu homojenizasyon tüpleri bağlı için için

Kaynaklar

  1. Hardie, R. C. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413 (6852), 186-193 (2001).
  2. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. N. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  3. Hardie, R. C. TRP channels and lipids: from Drosophila to mammalian physiology. The Journal of Physiology. 578 (1), 9-24 (2007).
  4. Fuchs, B., Süss, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography--a review of the current state. Journal of Chromatography. A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
  5. Tang, B., Row, K. Development of gas chromatography analysis of fatty acids in marine organisms. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 599-607 (2013).
  6. Kinsey, C., et al. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. , (2021).
  7. Gandhi, A. S., Budac, D., Khayrullina, T., Staal, R., Chandrasena, G. Quantitative analysis of lipids: a higher-throughput LC-MS/MS-based method and its comparison to ELISA. Future Science OA. 3 (1), 157(2017).
  8. Ouldamer, L., et al. NMR-based lipidomic approach to evaluate controlled dietary intake of lipids in adipose tissue of a rat mammary tumor model. Journal of Proteome Research. 15 (3), 868-878 (2016).
  9. Li, L., et al. Mass spectrometry methodology in lipid analysis. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10492-10507 (2014).
  10. Welti, R., Wang, X. Lipid species profiling: a high-throughput approach to identify lipid compositional changes and determine the function of genes involved in lipid metabolism and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 7 (3), 337-344 (2004).
  11. Köfeler, H. C., Fauland, A., Rechberger, G. N., Trötzmüller, M. Mass spectrometry based lipidomics: an overview of technological platforms. Metabolites. 2 (1), 19-38 (2012).
  12. Schwudke, D., Liebisch, G., Herzog, R., Schmitz, F., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics by tandem mass spectrometry under data-dependent acquisition control. Methods in Enzymology. 433, 175-191 (2007).
  13. Ejsing, C., et al. Automated identification and quantification of glycerophospholipid molecular species by multiple precursor ion scanning. Analytical Chemistry. 78 (17), 6202-6214 (2006).
  14. Schwudke, D., et al. Top-down lipidomic screens by multivariate analysis of high-resolution survey mass spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4083-4093 (2007).
  15. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600(2012).
  16. Han, X., Gross, R. W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of Lipid Research. 44 (6), 1071-1079 (2003).
  17. Schwudke, D., et al. Lipid profiling by multiple precursor and neutral loss scanning driven by the data-dependent acquisition. Analytical Chemistry. 78 (2), 585-595 (2006).
  18. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  19. Fauland, A., et al. A comprehensive method for lipid profiling by liquid chromatography-ion cyclotron resonance mass spectrometry. The Journal of Lipid Research. 52 (12), 2314-2322 (2011).
  20. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  21. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist. Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  22. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), Palo Alto, Calif. 433-465 (2010).
  23. Thakur, R., et al. Phospholipase D activity couples plasma membrane endocytosis with retromer dependent recycling. eLife. 5, 18515(2016).
  24. Donaldson, K. The inhalation toxicology of p-aramid fibrils. Critical Reviews in Toxicology. 39 (6), 487-500 (2009).
  25. Panda, A., et al. Functional analysis of mammalian phospholipase D enzymes. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  26. Ghosh, A., Sharma, S., Shinde, D., Ramya, V., Raghu, P. A novel mass assay to measure phosphatidylinositol-5-phosphate from cells and tissues. Bioscience Reports. 39 (10), (2019).
  27. Balakrishnan, S. S., et al. Regulation of PI4P levels by PI4KIIIα during G-protein-coupled PLC signaling in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  28. Masood, M. A., Yuan, C., Acharya, J. K., Veenstra, T. D., Blonder, J. Quantitation of ceramide phosphorylethanolamines containing saturated and unsaturated sphingoid base cores. Analytical Biochemistry. 400 (2), 259-269 (2010).
  29. Acharya, U., et al. Modulating sphingolipid biosynthetic pathway rescues photoreceptor degeneration. Science. 299 (5613), New York, N.Y. 1740-1743 (2003).
  30. Hebbar, S., Schuhmann, K., Shevchenko, A., Knust, E. Hydroxylated sphingolipid biosynthesis regulates photoreceptor apical domain morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 219 (12), (2020).
  31. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in aging animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
  32. Subramanian, M., et al. Altered lipid homeostasis in Drosophila InsP3 receptor mutants leads to obesity and hyperphagia). DMM Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 734-744 (2013).
  33. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  34. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53756(2016).
  35. Fujita, S. C., Inoue, H., Yoshioka, T., Hotta, Y. Quantitative tissue isolation from Drosophila freeze-dried in acetone. TheBiochemical Journal. 243 (1), 97-104 (1987).
  36. Herzog, R., et al. LipidXplorer: a software for consensual cross-platform lipidomics. PloS One. 7 (1), 29851(2012).
  37. Itoh, Y. H., Itoh, T., Kaneko, H. Modified Bartlett assay for microscale lipid phosphorus analysis. Analytical Biochemistry. 154 (1), 200-204 (1986).
  38. Hsu, F. F., Turk, J. Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation. A mechanistic proposal. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 11 (9), 797-803 (2000).
  39. Acharya, J. K., et al. Cell-nonautonomous function of ceramidase in photoreceptor homeostasis. Neuron. 57 (1), 69-79 (2008).
  40. Dasgupta, U., et al. Ceramide kinase regulates phospholipase C and phosphatidylinositol 4, 5, bisphosphate in phototransduction. Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 20063-20068 (2009).
  41. Yonamine, I., et al. Sphingosine kinases and their metabolites modulate endolysosomal trafficking in photoreceptors. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 557-567 (2011).
  42. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  43. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  44. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  45. Garcia-Murillas, I., et al. lazaro encodes a lipid phosphate phosphohydrolase that regulates phosphatidylinositol turnover during Drosophila phototransduction. Neuron. 49 (4), 533-546 (2006).
  46. Raghu, P., et al. Rhabdomere biogenesis in Drosophila photoreceptors is acutely sensitive to phosphatidic acid levels. TheJournal of Cell Biology. 185 (1), 129-145 (2009).
  47. Ogiso, H., Suzuki, T., Taguchi, R. Development of a reverse-phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry method for lipidomics, improving detection of phosphatidic acid and phosphatidylserine. Analytical Biochemistry. 375 (1), 124-131 (2008).
  48. Raghupathy, R., et al. Transbilayer lipid interactions mediate nanoclustering of lipid-anchored proteins. Cell. 161 (3), 581-594 (2015).
  49. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  50. Schuhmacher, M., et al. Live-cell lipid biochemistry reveals a role of diacylglycerol side-chain composition for cellular lipid dynamics and protein affinities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (14), 7729-7738 (2020).
  51. Raghu, P. Functional diversity in a lipidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11191-11193 (2020).
  52. Khandelwal, N., et al. Fatty acid chain length drives lysophosphatidylserine-dependent immunological outputs. Cell Chemical Biology. 28 (8), 1169-1179 (2021).
  53. Piper, M. D. W., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  54. Wang, F., et al. FlyVar: a database for genetic variation in Drosophila melanogaster. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2015, (2015).
  55. Hammond, G. R. V., Balla, T. Polyphosphoinositide binding domains: Key to inositol lipid biology. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (6), 746-758 (2015).
  56. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).
  57. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  58. Yadav, S., Garner, K., Georgiev, P., Li, M., Gomez-espinosa, E. RDGB, a PI-PA transfer protein regulates G-protein coupled PtdIns (4, 5)P2 signalling during Drosophila phototransduction. Journal of Cell Science. 128 (17), 3330-3344 (2015).
  59. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, L. Quantitative Mass Spectrometry Imaging of Biological Systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fosfolipaz C BetaPI(45)P2 HidroliziTRP KanallarıTRPL KanallarıLipid KantifikasyonuMoleküler GenetikDuyusal Transdüksiyon

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.