Çift Eksenli Mekanik Karakterizasyon ve Mikroyapısal Niceleme için Triküspid Vana Broşürlerinin Katman Mikrodiseksiyonu

Özet

Bu protokol, iki eksenli mekanik karakterizasyonu, polarize uzamsal frekans alanı görüntüleme tabanlı kollajen nicelleştirmesini ve triküspid kapak broşürlerinin mikrodiseksiyonunu tanımlar. Sağlanan yöntem, broşür katmanlarının bütünsel broşür davranışlarına nasıl katkıda bulunduğunu açıklar.

Özet

Triküspid kapak (TV), oksijensiz kanın sağ atriyumdan sağ ventriküle tek yönlü akışını düzenler. TV, her biri benzersiz mekanik davranışlara sahip üç broşürden oluşur. Üç TV broşürü arasındaki bu varyasyonlar, atriyalis (A), spongiosa (S), fibroza (F) ve ventricularis (V) olmak üzere dört anatomik tabakaları incelenerek daha da anlaşılabilir. Bu katmanlar her üç TV broşüründe de mevcut olsa da, kalınlıklarında ve mikroyapısal bileşenlerinde, kendi mekanik davranışlarını daha da etkileyen farklılıklar vardır.

Bu protokol, katmana özgü farklılıkları aydınlatmak için dört adım içerir: (i) bozulmamış TV broşürünün mekanik ve kollajen lifi mimari davranışlarını karakterize etmek, (ii) TV broşürünün kompozit katmanlarını (A / S ve F / V) ayırmak, (iii) kompozit katmanlar için aynı karakterizasyonları gerçekleştirmek ve (iv) post-hoc yapmak histoloji değerlendirmesi. Bu deneysel çerçeve, bozulmamış TV dokusunun kompozit katmanlarının her biriyle doğrudan karşılaştırılmasına benzersiz bir şekilde izin verir. Sonuç olarak, TV broşürlerinin mikroyapısı ve biyomekanik fonksiyonu ile ilgili ayrıntılı bilgiler bu protokol ile toplanabilir. Bu tür bilgiler, TV hastalığının klinik tedavisi için rehberlik sağlamaya çalışan TV hesaplama modelleri geliştirmek için potansiyel olarak kullanılabilir.

Giriş

TV, kalbin sağ atriyumu ile sağ ventrikülü arasında yer almaktadır. Kardiyak döngü boyunca TV, TV ön broşürünün (TVAL), TV posterior broşürünün (TVPL) ve TV septal broşürünün (TVSL) döngüsel olarak açılıp kapanması yoluyla tek yönlü kan akışını düzenler. Bu broşürler karmaşıktır ve benzersiz mikroyapısal bileşenlere sahip dört ayrı anatomik katmana sahiptir - atriyalis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) ve ventrikülis (V). Atriyal ve ventrikülisteki elastin lifleri, mekanik yüklemeden sonra dokunun deforme olmamış geometrisine geri dönmesine yardımcı olur¹. Buna karşılık, fibroza, broşürlerin yük taşıma kapasitesine katkıda bulunan yoğun bir dalgalı kollajen lifleri ağı içerir². Esas olarak glikozaminoglikanlardan oluşan spongiosa, kalp kapağı fonksiyonu³ sırasında broşür tabakaları arasında kesmeyi sağlamak için hipotez edilmiştir. Her üç broşür tipi de aynı anatomik katmanlara sahip olsa da, tabakaların kalınlıklarında ve broşüre özgü mekanik davranışlar için etkileri olan bileşen oranlarında farklılıklar vardır.

Araştırmacılar, düzlemsel mekanik karakterizasyonları, histomorfolojik değerlendirmeleri ve kollajen lif mimarisinin optik karakterizasyonlarını kullanarak TV broşürlerinin özelliklerini araştırdılar. Örneğin, düzlemsel iki eksenli mekanik karakterizasyonlar, dokuya dik yer değiştirmeler uygulayarak ve ilişkili kuvvetleri kaydederek fizyolojik yükü taklit etmeye çalışır. Ortaya çıkan kuvvet-yer değiştirme (veya stres-gerilme) gözlemleri, her üç TV broşürünün de radyal doku yönünde ^4,5,6 yönünde daha belirgin broşüre özgü tepkilerle doğrusal olmayan^, yöne özgü mekanik davranışlar sergilediğini ortaya koymuştur. Bu broşüre özgü davranışların, standart histolojik teknikler kullanılarak gözlemlenen mikroyapısal özelliklerdeki farklılıklardan kaynaklandığına inanılmaktadır ^6,7. Ayrıca, ikinci harmonik jenerasyon görüntüleme⁶, küçük açılı ışık saçılması⁸ ve polarize uzamsal frekans alanı görüntüleme⁷ (pSFDI) bu mikroyapısal özellikleri anlamayı amaçlamaktadır ve kollajen lif oryantasyonunda ve lif kıvrımında, gözlemlenen doku düzeyinde mekanik davranışlar üzerinde etkileri olan broşüre özgü farklılıklar göstermiştir. Bu çalışmalar, doku mikroyapısını ve doku düzeyindeki davranışlardaki rolünü anlamamızı önemli ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, doku mekaniğini ve altta yatan mikroyapıyı deneysel olarak birbirine bağlamada ele alınması gereken çok şey var.

Son zamanlarda, bu laboratuvar bir mikrodiseksiyon tekniği⁹ kullanılarak iki kompozit tabakaya (A / S ve F / V) ayrılmış TV broşür katmanlarının mekanik karakterizasyonlarını gerçekleştirmiştir. Bu önceki çalışma, katmanların mekanik özelliklerindeki farklılıkları vurguladı ve katmanlı mikroyapının doku mekanik davranışlarına nasıl katkıda bulunduğuna dair fikir vermeye yardımcı oldu. Bu araştırma, TV broşürü mikroyapısını anlamamızı geliştirmiş olsa da, tekniğin birkaç sınırlaması vardı. İlk olarak, kompozit tabakaların özellikleri doğrudan bozulmamış doku ile karşılaştırılmamıştır, bu da mekanik-mikroyapı ilişkisinin tam olarak anlaşılmamasına neden olmuştur. İkincisi, kompozit tabakaların kollajen lif mimarisi incelenmemiştir. Üçüncüsü, diğer iki TV broşüründen kompozit katmanların toplanmasındaki zorluklar nedeniyle sadece TVAL'in katmanları araştırıldı. Burada açıklanan yöntem, bu sınırlamaların üstesinden gelen bütünsel bir karakterizasyon çerçevesi sağlar ve TV broşürlerinin ve bunların kompozit katmanlarının tam karakterizasyonunu sağlar.

Bu yazıda, iki eksenli mekanik ve mikroyapısal karakterizasyonlar için üç TV broşürünü kompozit katmanlarına (A / S ve F / V) ayıran mikrodiseksiyon tekniği açıklanmaktadır^10,11,12. Bu yinelemeli protokol, (i) sağlam broşürün iki eksenli mekanik testi ve pSFDI karakterizasyonunu, (ii) kompozit TV katmanlarını güvenilir bir şekilde elde etmek için yeni ve tekrarlanabilir bir mikrodiseksiyon tekniğini ve (iii) kompozit TV katmanlarının iki eksenli mekanik testini ve pSFDI karakterizasyonunu içerir. Doku, mekanik test için çeşitli kuvvet oranlarıyla çift eksenli çekme yüküne maruz bırakıldı. Daha sonra, çeşitli yüklü konfigürasyonlarda kollajen lifi oryantasyonunu ve hizalamasını belirlemek için pSFDI kullanıldı. pSFDI, doğal kollajen fiber mimarisini korur, yüke bağımlı analize izin verir ve ikinci harmonik nesil görüntüleme veya küçük açılı ışık saçılması gibi kollajen lifi mimarisi analizi için tipik doku sabitleme veya temizleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Son olarak, dokular doku mikroyapısını görselleştirmek için standart histoloji teknikleri kullanılarak hazırlandı. Bu yinelemeli ve bütünsel çerçeve, TV broşürünün mekanik ve mikroyapısal özelliklerinin kompozit katmanlarıyla doğrudan karşılaştırılmasını sağlar.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Oklahoma Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvan dokuları USDA onaylı bir mezbahadan elde edildi.

1. Çift eksenli mekanik karakterizasyon

1. Doku hazırlama
   1. Dondurucudan bir TV broşürü, tıraş bıçağı, cerrahi kalem, forseps, deiyonize (DI) su içeren bir pipet ve bir kesme paspası alın. TV broşürünü 2-3 damla oda sıcaklığında DI suyu kullanarak çözün.
      NOT: Katman mikrodiseksiyonu için PBS kaynaklı zorlukları önlemek için fosfat tamponlu salin (PBS) yerine DI suyu kullanılır.
   2. Numuneyi, ventrikülis tabakası (yani, kordae yerleştirmelerinin bulunduğu yüzey) yukarı bakacak şekilde kesme paspası üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Numuneyi, radyal yön Y yönüyle ve çevresel yön X yönüyle aynı hizada olacak şekilde konumlandırın.
      NOT: Çevre yönü, valfin çevresi boyunca yönlendirilir.
   3. Dokunun kordae yerleştirme yerlerini inceleyin. İdeal olarak ~ 12 x 12 mm'lik bir alanı, son derece ince (yani şeffaf) alanlardan kaçınırken, en az miktarda büyük korda eklemesi ile belirleyin (Şekil 1).
   4. Numuneyi ters çevirin, böylece atriyal yüzey (yani, korda yerleştirme yapılmayan yüzey) yukarı bakacaktır. Çevre ve radyal broşür yönlerinin sırasıyla X ve Y eksenleriyle aynı hizada kaldığından emin olun.
   5. Broşür dokusundan, adım 1.1.3'te tanımlanan büyük kordae yerleştirmelerini veya ince alanları önleyen kare 12 x 12 mm'lik bir örnek kesin. Broşür dokusunun kesilmiş kısımlarını forseps ile çıkarın ve bir atık kabına yerleştirin.
      1. Büyük korda yerleştirmelerinden tamamen kaçınmak mümkün değilse, dokuları kare numunenin kenarı boyunca olacak şekilde kesin. Korda yerleştirmelerinden kaçınmak, daha sonraki mikrodiseksiyon için sorunları önlemeye yardımcı olduğu için önemlidir.
   6. Numunenin yönünü izlemek üzere sağ üst köşeye küçük bir nokta yerleştirmek için cerrahi kalem kullanın. Mürekkebin yaklaşık 30 sn kurumasını bekleyin.
   7. Numuneyi ventriküler yüzey (yani, kordal yerleştirmeli yüzey) yukarı bakacak şekilde çevirin. Kordayı broşürden gererek ve yerleştirme yerinin yakınında kesmek için bir tıraş bıçağı kullanarak dokunun arkasındaki kordal ataşmanları kesin. Atriyal yüzey (yani pürüzsüz yüzey) yukarı bakacak şekilde numuneyi tekrar çevirin.
2. Kalınlık ölçümü
   1. Temassız bir lazer yer değiştirme sensörü alın. Kesme paspasının kesilmiş dokunun yakınındaki düz bir bölümünde yer değiştirme sensörünü sıfırlayın.
      DİKKAT: Lazeri doğrudan gözlere parlatmayın.
   2. Lazeri numunenin merkezi bölgesi üzerine yerleştirin. Broşür yüzeyinin altında sıkışan havayı temizleyin, çünkü ölçüm hatalarına neden olabilir. Sıkışmış havayı serbest bırakmak için, kabarcığı dokunun kenarına itmek için cımbız kullanın veya dokunun bir köşesini kaldırın.
   3. Deplasman sensörünün ekranında gösterilen kalınlığı kaydedin. Numunenin diğer yerlerinde iki ölçüm daha tekrarlayın.
   4. Önceki adımda kaydedilen üç ölçümü kullanarak ortalama broşür kalınlığını hesaplayın. İki eksenli mekanik karakterizasyon protokollerini oluştururken bu değeri kullanın.
3. Çift eksenli test cihazı kurulumu ve doku montajı
   1. İn vivo fizyolojik koşullar altında sıcaklığı sağlamak için test sisteminin yönergelerini izleyerek 37 ° C'de bir DI su banyosu hazırlayın.
   2. Forsepsleri, doku örneğini, montaj donanımını, ince uçlu bir aleti, sıvı siyanoakrilat yapıştırıcıyı ve siyah boyalı cam boncukları (çap: 300-500 μm) alın.
      NOT: Montaj donanımı çatalları, montaj köprüsünü ve montaj kauçuğunu içerir.
   3. Doku örneğini test sistemine monte edin. Dokunun çevresel yönünün, daha önce adım 1.1.6'da yerleştirilen nokta tarafından desteklenebilen X yönüyle hizalandığından emin olun.
      NOT: Burada kullanılan çatallar, tüm doku kenarı uzunluğu boyunca eşit aralıklarla yerleştirilmelidir. Etkili kenar uzunluğu, sağlam doku için 10 mm ve kompozit tabakalar için >3,3 mm olarak ayarlanmıştır.
4. Güvenilir işaretleyici yerleştirme
   1. Monte edilmiş dokunun merkezi üçte bir kare bölgesini tanımlayın. Referans işaretleyici yerleşimi için bu alanın yaklaşık köşelerini kullanın.
   2. Cam boncukları açık yüzlü bir tartım teknesine yerleştirin ve ayrı bir tartım teknesinde küçük bir sıvı siyanoakrilat yapıştırıcı havuzu oluşturun. İnce uçlu aletin üstünü az miktarda yapıştırıcı ile kaplayın. Tartım teknesinin yan tarafındaki fazla tutkalı dablayın.
   3. Tutkal kaplı ucu dokuya hafifçe bastırarak merkezi üçte bir kare dizisinin bir köşesini oluşturun. Forseps kullanarak, bir cam boncuk alın ve dikkatlice tutkal noktasının üzerine yerleştirin. Boncuk yerleştirme konusunda yardım almak için iki eksenli test cihazının kamerasını kullanın.
   4. Kare dizisi tamamlanana kadar üç ek boncuk için 1.4.2 ve 1.4.3 adımlarını yineleyin. Boncukların güvenli bir şekilde tutturulduğundan ve ilgili tutkal noktalarının birbirine dokunmadığından veya yapışmadığından emin olun. Dokuyu su banyosuna indirmeden önce yapıştırıcıyı kurulayın.
      1. Boncuklar birbirine yapışmışsa, tutkalın kurumasını bekleyin, ardından boncuk veya yapıştırıcıyı hafifçe kavramak ve dokudan çekmek için forsepsleri kullanın.
         NOT: Tutkal ve boncuk (lar) çıkmalı ve boncuk yerleştirmenin yeniden denenmesine izin vermelidir.
5. Ön koşullandırma
   1. Kenar uzunluğu ve kalınlığına sahip dokunun, 40 N / m'lik bir pik membran gerilimi T_zirvesine% 3'lük bir ön yük ile% 3'lük bir ön yük ile T _tepe^{noktası 10'a} ve her biri 30 s×'lik gerilme ve geri kazanım sürelerine altı tekrar eşiki eksenli yükleme yapacağı kuvvet kontrollü bir ön koşullandırma protokolü oluşturun.
      1. Verileri gelecekteki hesaplamalar için geçici olarak depolayacak rasgele bir test dizini oluşturun. Yükleme hızını 4,42 N/m olarak ayarlayın.
      2. Preconditioning0 adıyla yeni bir test parametresi kümesi oluşturun. X ekseni ve Y ekseni kontrol modlarını zorlayacak şekilde ayarlayın ve kontrol işlevlerini adım adım ayarlayın. Yük büyüklüğünü T tepe noktası ile ilişkili kuvvet olarak tanımlayın, yani f tepe = T _tepe · L. Ön yük büyüklüğünü yalnızca ilk tekrarlama için f_tepesinin% 3'ü olarak tanımlayın ve hem gerilme süresini hem de iyileşme süresini 30 s olarak tanımlayın. Tekrar sayısını 10 olarak tanımlayın.
         NOT: Hesaplanan pik ilk Piola-Kirchhoff stresi, yani P tepe = T_tepe noktası / t, daha ince dokular için 200 kPa'yı aşabilir ve bu da test sırasında doku yırtılmasına neden olabilir. Bu senaryolarda, pik membran gerilimi maksimum ilk Piola-Kirchhoff gerilimi olan 200 kPa'ya ayarlandı.
   2. Ön koşullandırma protokolünü yürütün. Ön koşullandırmayı takiben, iki eksenli test protokollerinde kullanılmak üzere numunenin mevcut X ve Y boyutlarını kaydedin.
6. İki eksenli test protokollerinin oluşturulması ve yürütülmesi
   1. İstenilen yer değiştirme hızı ile önceden koşullandırılmış konfigürasyondan pik eşeksenel konfigürasyonu elde etmek için gereken süreyi belirleyin. Sabit bir deplasman oranı göz önüne alındığında, kalan yükleme oranları için yükleme sürelerini hesaplayın (yani, T XX: T YY = 1: 0.5 ve T _XX: T _YY = 0.5: 1).
   2. Belirli bir yükleme oranı için hedef kuvvetlere uyacak şekilde lineer aktüatörleri manuel olarak çalıştırın. Bu işlemi tekrarlayın ve tüm yükleme oranları için broşür boyutlarını kaydedin.
   3. Dokuyu önceden koşullandırılmış konfigürasyondan adım 1.6.2'de kaydedilen konfigürasyonlara (yani, T _XX:T _YY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1) adım 1.6.1'de belirlenen süreler içinde iki eksenli olarak yer değiştiren yer değiştirme kontrollü bir test protokolü hazırlayın. Mekanik davranışın tekrarlanabilirliği için her protokolün üç yükleme/boşaltma döngüsüne sahip olduğundan emin olun.
      1. Gelecekteki hesaplamalar için verileri depolayacak bir test dizini oluşturun. Dizin adının geçerli örnekle eşleştiğinden emin olun.
      2. 1:1 adında yeni bir test parametresi kümesi oluşturun, X ekseni ve Y ekseni kontrol modlarını yer değiştirmeye ayarlayın ve kontrol işlevlerini rampaya ayarlayın. Esnetme büyüklüğünü, adım 1.6.1'de kaydedilen yapılandırma olarak tanımlayın. Ön yük büyüklüğünü yalnızca ilk tekrarlama için f tepe noktasının %_3'ü olarak tanımlayın ve hem esneme süresini hem de kurtarma süresini adım 1.6.1'de kaydedilen süre olarak tanımlayın. Tekrar sayısını 3 olarak tanımlayın.
      3. Ön yükleme büyüklüğünü uygulanmamış olarak tanımlamak dışında, kalan yükleme oranları için 1.6.3.2 adımını tekrarlayın (yani, T XX:T YY = 1:0,5 ve T _XX:T_YY = 0,5:1). Esneme büyüklüğünün, esneme süresinin ve iyileşme süresinin adım 1.6.2'de kaydedilenlerle eşleştiğinden emin olun.
         NOT: Gerilme ve gerinim analizleri için yalnızca son (üçüncü) döngüden veriler kullanılacaktır.
   4. Yer değiştirme kontrollü protokolleri uygulayın. İki eksenli testin tamamlanmasından sonra, dokuyu önceden koşullandırılmış boyutlarına geri döndürün.
      NOT: Doku yırtılmaya başlarsa test derhal iptal edilmelidir.
7. Diğer karakterizasyonlar
   1. Dokuyu DI suya batırılmış ve iki eksenli test sistemine monte edilmiş halde bırakın. pSFDI görüntülemeyi adım 2.1-2.3'te açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   2. Dokuyu çıkarın. Sağlam bir doku ise, adım 3.1-3.7'de açıklanan mikrodiseksiyona geçin. Değilse, adım 3.7'yi izleyerek histolojiyi toplayın.
      NOT: DI su banyosu aynı gün içinde sonraki karakterizasyonlar için kullanılabilir.
   3. 1.2-1.7 arasındaki adımları mikrodiseksiyondan sonra alınan A/S ve F/V katmanlarıyla tekrarlayın (adım 3.1-3.6).
      NOT: Katmanlar için test protokolünün tekrarı, bozulmamış dokunun kendi katmanlarıyla doğrudan karşılaştırılmasını sağlar.
8. Çift eksenli test verileri işleme sonrası prosedürler
   1. Zamana bağlı işaretleyici konumlarını belirlemek için elde edilen iki eksenli test görüntülerinin dijital görüntü korelasyonunu gerçekleştirin. Referans işaretleyici yer değiştirmelerini Eq (1) aracılığıyla hesaplayın. ⁵ adet
      (1)
      Burada, x i(t), X i ve d i(t) zamana bağlı konum, başlangıç (referans) konumu ve _i işaretleyicisinin yer değiştirmesidir.
   2. Eq (2)^5'te gösterildiği gibi, referans işaretleyicilerini dört düğümlü bilineer sonlu eleman olarak dikkate alarak deformasyon gradyanı F'yi hesaplayın
      (2)
      Burada B_Xi ve B_Yi, sırasıyla X ve Y yönlerindeki i düğümü için şekil fonksiyonlarının türevleridir ve u i (t) ve v i (t) d i (t) 'nin bileşenleridir: d i (t) = [u _i (t), v _i (t)]^T.
   3. Uygulanan ilk Piola-Kirchhoff gerilimi P'yi, Eq (3)^5'te olduğu gibi, kaydedilen kuvvetleri kullanarak hesaplayın
      (3)
      P _XX ve P _YY, P'nin X ve Y bileşenleridir; L ve t, doku kenarı uzunluğu ve kalınlığıdır; f X ve f Y, _X ve Y yönlerinde kaydedilen kuvvetlerdir.
   4. Gerektiğinde diğer gerinim ve gerilme önlemlerini ^{belirleyin,13} bunlar arasında sağ Cauchy-Green deformasyonu C = F ^T/F, Green-Lagrange suşu E = (C - I)/2, Cauchy gerilmesi σ = J-1 PF T ve ikinci Piola-Kirchhoff gerilmesi S = ^F-1P bulunur.
      NOT: Burada, ben ikinci dereceden bir kimlik tensörüyüm ve J = det(F), deformasyon gradyanı F'nin Jacobian'ıdır.

2. Polarize uzamsal frekans alanı görüntüleme

1. Sistem hazırlığı
   NOT: İstenirse, aşağıdaki adımlardan önce referans belirteçleri dokudan çıkarılabilir.
   1. pSFDI aygıtını numunenin üzerine ortalayın (Şekil 2). Projektörü açın ve numuneyi 490 nm (camgöbeği) ışıkla aydınlatın.
   2. Kamera yazılımını açın ve kameranın görüş alanını inceleyin. Numunenin çerçevede ortalandığından ve tamamen görüş alanı içinde bulunduğundan emin olun.
   3. Takılan örnek sağlam bir broşürse, doku yüzeyinde parlama olmadan dokunun tamamen aydınlatıldığından emin olmak için dijital ışık işleme (DLP) projektör parlaklığını ayarlayın. Örnek bileşik katmanlardan biriyse parlaklığı ayarlamayın.
   4. Polarizör lensindeki olası parıltıları veya kirleri algılamak için polarizörü tüm hareket aralığı boyunca döndürün. Polarize edici lensi gerektiğinde mikrofiber bir bezle dikkatlice temizleyin.
2. Veri toplama
   NOT: Aşağıdaki veri toplama, LabVIEW veya Python gibi yazılımlar kullanılarak otomatikleştirilebilir.
   1. Polarizörü ana konumuna taşıyın - ideal olarak iki eksenli test eksenlerinden biriyle hizalanır. Bir gri tonlamalı görüntü yakalayın ve polarizer konumuyla (yani, 0 °) bilgisayara kaydedin.
   2. Polarizörü 5° döndürün ve başka bir gri tonlamalı görüntü yakalayın. 5°'lik bir artışla 0° ile 180° arasında değişen 37 görüntü elde etmek için bu işlemi tekrarlayın.
      NOT: İlk pSFDI görüntüleme dizisinden alınan görüntüler, dokudan istenen optik yanıtı sağlamak için önceden analiz edilebilir. Talimatlar için adım 2.3'e bakın.
   3. İstenen diğer doku konfigürasyonları için pSFDI görüntüleme dizisini tekrarlayın, örneğin, iki eksenli mekanik test için dikkate alınan yükleme protokollerinin tepe konfigürasyonları.
3. pSFDI veri işleme sonrası prosedürleri
   Not: Aşağıdaki yöntem, MATLAB program dili için adımlar içerir. Ancak, bunun yerine tercih edilen herhangi bir dil (örneğin, Python, C ++) kullanılabilir.
   1. Alınan 37 görüntünün piksel cinsinden yoğunluklarını içeren diziler oluşturmak için MATLAB imread() işlevini kullanın. Kolaylık sağlamak için, bunları n × m × 37 üç boyutlu dizi olarak düzenleyin, burada n ve m iki eksen boyunca piksel sayılarıdır.
   2. Kullanıcı tanımlı grabit () işlevini kullanarak ilgilenilen doku bölgesini (ROI) tanımlayın.
   3. Eq (4)'te olduğu gibi 3 dönemlik bir Fourier serisi kullanarak her ROI pikseli için yoğunluk ve polarizör açısı verilerini sığdırın:
      (4)
      Burada, I(θ), polarizör açısının bir fonksiyonu olarak piksel cinsinden yoğunluktur ve b_i , Fourier sabitleridir. B_i'yi belirlemek için standart doğrusal en küçük kareler regresyonunu kullanın.
   4. Piksel bazında fiber yönünü, maksimum I(θ) değeri ile ilişkili polarizör açısı olarak belirleyin. Eq (5) aracılığıyla optik anizotropi derecesini (DOA) hesaplayın.
      (5)
   5. Elde edilen fiber oryantasyonunu ve DOA değerlerini görselleştirmek için plot () ve histogram() kullanın. İşlenen sonuçları daha sonra kullanmak üzere kaydedin.

3. Triküspid valf broşürü kompozit tabakalarının mikrodiseksiyonu

1. Balmumu tahtasına doku bağlantısı
   1. Gerekli malzemeleri toplayın: balmumu tahtası, DI suyu, pipet, neşter, mikro makas, ince forseps, kavisli forseps, kalın forseps ve pimler.
      NOT: Sadece dişleri veya çeneleri olmayan cımbız kullanın, çünkü bu tip forsepsler diseksiyonu gerçekleştirirken A / S tabakasının ince dokusunu çok kolay bir şekilde yırtabilir.
   2. Dokuyu iki eksenli test cihazından çıkarın ve adım 1.2'de açıklanan lazer yer değiştirme sensörünü kullanarak kalınlığını ölçün. Dokuyu balmumu tahtasına yerleştirin.
   3. Dokunun ventrikülis tarafını büyük kordae yerleştirmeleri açısından inceleyin. Diseksiyon sırasında bunları önlemek için bu eklemelerin konumuna dikkat edin (Ek Şekil S1). Referans için bir fotoğraf çekin.
   4. Dokuyu balmumu tahtasına düz bir şekilde atriyalis yukarı bakacak şekilde yayın. Pimleri kullanarak dokuyu tahtaya yapıştırın:
      1. Dokunun her köşesine, dokudan uzağa açılı (daha iyi görüntüleme için) ve dokuyu hafifçe gerginleştiren bir pim yerleştirin (Şekil 3A). Bunu saat yönünde veya saat yönünün tersine yapın. Dokuyu monte ederken pimlerin, çatallar tarafından oluşturulan deliklerin dışında olduğundan emin olun.
      2. Dokunun gergin ve kare konfigürasyonda olduğundan emin olmak için pim yerleşimini hafifçe ayarlayın (Şekil 3B), böylece doku düz durur ve tabaka mikro diseksiyonu sırasında kaymaz.
      3. Gerekirse, dokuyu daha fazla germek için diseksiyon sırasında dokunun yan tarafına pimler yerleştirin. Ek pimleri yerleştirirken ve açılandırırken, diseksiyon sırasında etrafta dolaşmaları gerektiğini unutmayın.
      4. Cam boncuk referans işaretleyicilerini çıkarın.
         NOT: Aşağıdaki adım isteğe bağlıdır. Eklenen DI suyu, doku hidrasyonunun korunmasına yardımcı olur ve dokunun mikrodiseksiyon boyunca kendine yapışmasını önler.
      5. Bir pipet kullanarak, DI suyunu dokunun yüzeyine yerleştirin, böylece dokuyu kabarcık benzeri bir şekilde tamamen kaplar. DI suyunu diseksiyon boyunca gerektiği gibi doldurun.
2. İlk köşeyi yapın.
   1. Diseksiyona başlamak için sabitlenmiş numunenin bir köşesini seçin. Büyük chordae yerleştirmelerinden ve aşırı ince alanlardan kaçının.
   2. Neşteri mekanik testlerden montaj delikleri boyunca doku yüzeyi üzerinde hafifçe sürükleyerek A/S tabakasında bir kesim yapın (Şekil 3C). Kesimin en az 5 mm uzunluğunda olduğundan ve kesimin kenarlarının birbirinden ayrılmaya başladığından ve altındaki F / V katmanını ortaya çıkardığından emin olun.
   3. İnce forsepsleri (keskin bir uç olmadan) kullanarak kesim boyunca sıkıca ovalayın ve kesimin kenarlarını ayırın (Ek Şekil S2).
      1. A/S tabakasındaki kesik ayrılmaya başlamazsa, bunu yapmaya başlayana kadar neşterle aynı kesim üzerinde tekrar hafifçe izleyin. Dokuyu çok derin kesmemeye dikkat edin (A / S kompozit tabakasını geçerek), katmanları temiz bir şekilde ayırmayı zorlaştırır.
   4. İkinci bir kesimi ilk kesime dik yapmak için 3.2 ve 3.2.3 adımlarını tekrarlayın (Şekil 3D). İki kesimin birbirine bağlandığından ve bir köşe oluşturduğundan emin olun.
      1. İki kesim birbirine bağlı değilse, ince cımbızı iki kesimi ayıran küçük doku alanının altında çalıştırın (Ek Şekil S3). Ardından, dokuyu kesmek için makası dikkatlice kullanın.
3. Dokuyu köşeden soyun.
   1. Doku F / V tabakasından ayrılmaya başlayana kadar ince forseps kullanarak kesikler boyunca ovalayın. Küçük bir doku parçası ayrılır ayrılmaz, cımbızla tutun ve kompozit katmanları daha da ayırmak için yavaşça çekin.
      NOT: İnce cımbızın ucunu kavrarken daima dokunun kenarından geçirin. Aksi takdirde, yanlışlıkla A / S kompozit katmanına bir delik açabilirler.
   2. Dokuyu soymaya devam edin ve köşe için yapılan iki kesimin sonuna gelene kadar dikişi ovalayın. Bu işlem boyunca, A / S kompozit tabakasının istenmeyen yırtılmasını ve yırtılmasını önlemek için soyma işleminin dokusunu kavramak için daha büyük cımbızlara geçin.
      1. İlk viraj denemesinde ayırmayla ilgili önemli sorunlar varsa, başlangıç noktası olarak farklı bir köşe deneyin (adım 3.2'ye geri dönün).
4. Kesikleri uzatın, dokuyu soyun ve ikinci bir köşe yapın.
   1. Neşter ucunu her kesimin altına yerleştirerek ve doku yüzeyi boyunca hafifçe sürükleyerek ilk köşe için yapılan iki kesimi uzatın (Şekil 4A). Tüm uzatma kesimlerinin en az 5 mm olduğundan ve kesim uzantılarının orijinal kesimlere bağlandığından ve çatal veya dikiş deliklerini takip etmeye devam ettiğinden emin olun.
      NOT: Uzatma kesimi çok derinse, fibroza bölümlerinin A / S kompozit tabakası ile ayrılmadığından emin olmak için yaklaşan soyma yakından izlenmelidir (Şekil 5A).
   2. Kesimleri uzatmaya devam edin ve bir taraf bitene kadar dikişi ovalarken üst kompozit A / S tabakasını geri soyun. Dokunun bir kesim boyunca tamamen ayrılacağını gözlemleyin; A/S ve F/V kompozit katmanları arasındaki dikişin düz olmasını sağlayın (Şekil 4B).
   3. Tamamen soyulmuş tarafın sonuna dik ikinci bir köşe oluşturmak için adım 3.2 ve adım 3.3'teki talimatları tekrarlayın (Şekil 4C).
5. A/S katmanını tamamen ayırın.
   1. Büyük akor yerleştirmelerinden kaçınırken kalan kesimleri uzatın. İlk köşe için kullanılan sürtünme ve çekme tekniklerini kullanarak A/S ve F/V katmanlarını ayırmaya devam edin. Bu işlem sırasında ortaya çıkabilecek birkaç hususu veya sorunu not edin:
      1. A/S ayırma alanından korda eklemelerini hariç tutun (Şekil 5B), yalnızca bu dışlama deneysel karakterizasyonlar için yeterince büyük bir A/S örneğine (>3,3 mm) izin verdiğinde.
      2. Doku yırtılırsa veya bir delik oluşursa, dokuyu hemen ayırmayı bırakın. Cımbızların yakalanmasını önlemek için, makası oluşan herhangi bir deliğe yerleştirin ve dokuyu merkezden uzağa kesin. Kusur ayrılma dikişi boyunca oluşursa, daha fazla yırtılmayı önlemek için dokuyu başka bir kenar boyunca ayırmaya başlayın (Şekil 5C).
      3. Dokuyu ayırırken ortaya çıkabilecek ara katman bağlantılarını arayın ve yüksek yırtılma riski olmadan dokunun daha fazla ayrılmasını önleyin (Şekil 5D). Bunların makas kullanılarak dikkatlice kesilmesi gereken ince ama güçlü iplikçikler olduğunu gözlemleyin. A/S katmanında bir delik oluşturmaktan veya F/V katmanına doğru aşağı doğru kesmekten kaçının, çünkü bu eşit olmayan bir ayrıma neden olur.
      4. A/S katmanının mümkün olan en büyük örneği ayrılana kadar bu işleme devam edin. Cerrahi kalemi kullanarak numunenin yönünü işaretleyin (Şekil 6A).
6. Diseksiyonu bitirin.
   1. Makası kullanarak kalan doku kenarı için ayırma dikişi boyunca kesim yapın (Şekil 6B). Bu kesimin ayırma dikişine mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olun.
   2. Ayrılmış A/S kompozit tabakasını kesme paspası üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Gerekirse, dokunun kenarlarını düzeltmek ve iki eksenli mekanik test için uygun kare bir doku şekli oluşturmak için neşteri kullanın. A/S tabakasını test edilmeye hazır olana kadar DI suyuna yerleştirin.
   3. Balmumu tahtasında kalan F/V tabakasının yönünü işaretleyin. A / S tabakasının çıkarıldığı alandan mümkün olan en büyük kareyi kesin (Şekil 6C), ardından DI suyuna yerleştirin.
7. Histoloji
   1. Histolojide kullanılmak üzere çevresel ve radyal yönlerle hizalanmış iki doku şeridini tüketin. Bozulmamış ve kompozit katmanlar için farklı protokoller kullanın (örneğin, A / S ve F / V).
      1. Bozulmamış tabaka için, örnekleri balmumu tahtasına sabitlenmiş kalan dokudan alın. Dokuyu çatal/dikiş deliklerinin dışında kullanın, çünkü dokunun bu kısmı diseke edilmemiştir ve bozulmamış broşürü temsil edecektir.
      2. A / S ve F / V kompozit katmanları için, histoloji örneklerini yalnızca test ve görüntülemelerini tamamladıktan sonra toplayın. Numuneyi iki eksenli test sisteminden ayırın, dokuyu bir kesme paspası üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve bir tıraş bıçağı kullanarak çevresel ve radyal şeritleri tüketin.
   2. Eksize edilen şeritleri doku kasetlerine yerleştirin ve kasetleri% 10 formaline batırın.
   3. Kalan dokuyu atın. Diseksiyon aletlerini temizleme bileşiği kullanarak temizleyin ( bkz.
   4. 24-48 saatlik fiksasyondan sonra, kasetleri histoloji işleme ve boyama işlemine kadar süresiz olarak saklanabilecekleri etanol'e aktarın.
      NOT: Bu histolojik analiz, mikrodiseksiyonun başarılı olduğunu doğrulayabilir. DİKKAT: formalin cilt tahrişine ve ciddi göz hasarına neden olur. Ayrıca inhalasyon yoluyla alerjik reaksiyona veya kansere neden olabilir. Kullanırken eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü gibi uygun kişisel koruma ekipmanlarını giyin ve yalnızca davlumbaz gibi iyi havalandırılan alanlarda kullanın. Kullanılmadığında, saklama kabının sıkıca kapatıldığından emin olun.

Sonuçlar

Mikrodiseksiyon, (ticari) bir çift eksenli test cihazına monte edilebilen nispeten eşit kalınlıklara sahip A / S ve F / V numuneleri verecektir. Bozulmamış broşürün ve iki disseke edilmiş tabakanın histoloji analizi, dokunun spongiosa ve fibroza arasındaki sınır boyunca doğru bir şekilde ayrılıp ayrılmadığını doğrulayacaktır (Şekil 7). Ek olarak, histoloji mikrografları, ImageJ yazılımı kullanılarak doku tabakası kalınlıklarını ve kurucu kütle fraksiyonlarını belirlemek için kullanılabilir. ...

Tartışma

Protokol için kritik adımlar şunları içerir: (i) katman mikrodiseksiyonu, (ii) doku montajı, (iii) referans belirteci yerleşimi ve (iv) pSFDI kurulumu. Uygun tabaka mikrodiseksiyonu, burada açıklanan yöntemin en önemli ve zor yönüdür. Bu tekniği kullanan bir soruşturma başlatmadan önce, dissektör (ler) mikrodiseksiyon tekniği ve üç TV broşürü ile uzun vadeli bir uygulamaya sahip olmalıdır. Dissektör, kompozit tabaka numunelerinin yeterince büyük (>3,3 mm) olmasını ve eşit bir kalınlığa sahip olmasını sağlamalıdır. Diseks...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 10 Formalin Çözeltisi, Nötr Tamponlu	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Alconox Deterjan	Alconox		temizleme bileşiği
BioTester - Çift Eksenli Test Cihazı	CellScale Biyomalzeme Testi		1.5 N Yük Hücresi Kapasitesi
Kesme Matı	Dahle	B0027RS8DU
Deiyonize Su	N/A
İnce Uçlu Alet	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
Forseps - Kavisli	Bilimsel Laboratuvar Gereçleri	16122
Forseps - Kalın	Bilimsel Laboratuvar Gereçleri	161001078
Forseps - İnce	Bilimsel Laboratuvar Gereçleri	16127
LabJoy	CellScale Biyomalzeme Testi	Sürüm 10.66
Lazer Yer Değiştirme Sensör	Keyence	IL-030
Sıvı Siyanoakrilat Tutkal	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	Sürüm 2020a
Mikro Makas	HTI Aletleri	CAS55C
Pipet	Belmaks	360758081051Y4
Polarize Uzamsal Frekans Alanı Görüntüleme Cihazı	N/A		Dijital ışık projektörü, doğrusal polarizör, döner polarizör yuvası ve şarj bağlantılı cihaz kamerası kullanılarak şirket içinde üretilmiştir. Daha fazla ayrıntı için doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) bölümüne bakın.
Neşter	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Tek Kenarlı Endüstriyel Tıraş Bıçakları (Cerrahi Karbon Çelik)	VWR International	H3515541105024
Cerrahi Kalem	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	İş Kaynağı	BSN32351
Mum Tahtası	N/A		Modelleme balmumu ve fırın tepsisi kullanılarak evde üretilmiştir
Tartı Teknesi	Pure Ponta	mdo-azoc-1030