Bu yazıda, subkonjonktival enjeksiyon, mikroenjeksiyon iğneleri ile birlikte infüzyon/geri çekilme şırınga pompası ve gaz geçirmez çıkarılabilir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak farelerde oküler dokular için geçerli bir vektör dağıtım yöntemi olarak gösterilmiştir. Bu enjeksiyon sistemi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Küçük Hayvan Modellerinde Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Subkonjonktival Uygulaması
Bu makalede
Özet
Özet
Oküler hastalıklar, çoklu uygulama yolları üzerinden göreceli olarak erişilebilirliklerinin kolaylığı nedeniyle lokal ilaç dağıtımı için cazip hedefler olan çok çeşitli kalıtsal genetik ve edinsel bozuklukları içerir. Subkonjonktival (SCJ) enjeksiyonlar, basit, güvenli ve genellikle ayakta tedavi ortamında gerçekleştirildikleri için diğer göz içi uygulama yollarına göre avantajlar sunar. Küçük hayvanlarda SCJ enjeksiyonları genellikle gözün büyüklüğü nedeniyle ameliyat mikroskobunun yardımını gerektirir. Önceki çalışmalar, spesifik adeno ilişkili virüs (AAV) serotiplerinin SCJ enjeksiyonunun, oküler yüzeyin, göz kasının ve optik sinirin hedeflenen transdüksiyonu için geçerli bir gen dağıtım stratejisi olduğunu ve birçok oküler hastalığın tedavisi için potansiyel bir yaklaşım sağladığını göstermiştir.
Burada, programlanabilir bir infüzyon / geri çekilme şırınga pompasından (tutarlı ve hassas enjeksiyon hızı ve basıncına izin veren) ve mikroenjeksiyon iğneleriyle birleştirilmiş gaz geçirmez çıkarılabilir bir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak bir fare modelinde SCJ enjeksiyonları için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Enjeksiyon sistemi, küçük hayvanlarda intrastromal, intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir. Oküler gen terapisi çalışmaları için adeno ilişkili viral vektörlerin verilmesi tarif edilmesine rağmen, buradaki protokol küçük hayvan modellerinde çeşitli oftalmik çözeltiler için de uyarlanabilir. Uygulama yolundaki temel pratik adımlar, enjeksiyon platformu için kurulum, enjeksiyonun hazırlanması ve doğrudan deneyimden elde edilen ipuçları ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Ek olarak, istenen dokulara AAV doğum onayı için yaygın doğrulama teknikleri de kısaca tartışılacaktır.
Giriş
Oküler hastalıklar hem genetik hem de edinsel bozuklukların geniş bir yelpazesini kapsar. 2015 yılında, dünya çapında tahmini 36 milyon insan yasal olarak kördü ve 1 milyardan fazla insan en azından bir miktar görme bozukluğundan muzdaripti ve bu da hafifletme çabalarını her seviyede ölçeklendirme ihtiyacını vurguladı1. Oküler ilaçların verilmesi için ana yöntemler, göz damlası veya subkonjonktival (SCJ), intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi hem topikal hem de lokal uygulamayı içerir. Noninvaziv topikal tedavi oftalmik ilaçlar için en yaygın dağıtım yöntemi olmasına ve birçok ön segment bozukluğunda yaygın olarak kullanıl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirildi. AAV vektörlerinin kullanımı Biyogüvenlik Seviye 1 biyolojik tehlike riskidir. AAV'yi kullanırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Burada açıklanan deney için, serotip 8 kapsid ile paketlenmiş ve yeşil floresan proteininin (GFP) ekspresyonunu kontrol eden jenerik bir ubiquitous sitomegalovirüs (CMV) promotörünü kodlayan bir rekombinant AAV vektörü kullanılmıştır.
1. AAV vektör işleme ve depolama
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Subkonjonktival boşluğa enjekte edilen çözelti, enjeksiyon hacmine bağlı olarak bir bleb olarak ortaya çıkar.
Bu deneyde,% 0.1'lik son konsantrasyonda floresein ile karıştırılmış 7 μL AAV (7 × 109 viral genom (vg) / göz), stereomikroskop altında 36 G'lik bir iğne ile enjekte edildi ve enjeksiyon hızı / basıncı, 1 μL / s'de programlanabilir bir şırınga pompası kullanılarak sabit tutuldu. Enjeksiyon sırasında bir bleb görünebilir (ok). Murin SCJ bölmesine AAV vektör uygulamasının mikroskobik .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
AAV aracılı gen tedavisi, oküler hastalıkların tedavisinde büyük potansiyele sahiptir. Günümüzde oküler gen tedavisi intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar olmak üzere iki ana lokal uygulama yoluna dayanmaktadır. Ne yazık ki, her iki yol da invazivdir ve retina dekolmanı, katarakt oluşumu ve endoftalmi gibi ciddi komplikasyonlara neden olabilir. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonu gibi nispeten daha az invaziv yolların araştırılması büyük ilgi çekicidir.
Bu teknik nispeten basit ve önemli ölçüde dah.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, bu çalışmada kullanılan scAAV8-GFP vektörlerini, CGIBD Histoloji Çekirdeğini ve Dr. Brian C. Gilger'in laboratuvarını bu çalışmanın klinik değerlendirme yönleriyle ilgili yardımları için sağladıkları için Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Vector Core'a teşekkür eder. Bu çalışma, Pfizer-NC Biotech Seçkin Doktora Sonrası Bursu ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği ve Kistik Fibroz Vakfı'ndan Kariyer Geliştirme Ödülü ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği veya Kistik Fibroz Vakfı'nın resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 36 G NanoFil İğneleri | Dünya Hassas Aletler | NF36BV-2 | |
| AAV vektör | Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi | / | |
| Asepromazin | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antikoru | AVES labs Inc. | ||
| Dijital kamera | Cannon Cannon | EOS T5i | |
| DNA / RNA ekstraksiyon kiti | Qiagen | 80204 | |
| & nbsp; Forseps | Güzel Bilim Araçları | F6521 | |
| Hamilton şırınga | Hamilton | 7654-01 | |
| Hindistan mürekkebi | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamin hidroklorür enjeksiyon çözeltisi | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Neme dayanıklı film | Parafilm | 807-6 | |
| Polietilen boru | Becton Dickinson ve Şirket | 427401 | |
| Proparakain %0.1 | Bausch Sağlık ABD | NDC 24208-730-06 | |
| Ribaund tonometresi | Tonovet | / | |
| Sodyum floresein çözeltisi | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standart İnfüzyon / Çekme Pompası 11 Pico Plus Elite Programlanabilir Şırınga Pompası | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo mikroskopi | Leica | Mz6 | |
| Tetrakain Hidroklorür Oftalmik Çözelti% 0.5 | Bausch ve Lomb | Rx sadece | |
| Topikal merhem | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Ksilazin | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Fenol Kırmızı İplik Kutusu 100 Diş | ZONE-QUICK | PO6448 |
Kaynaklar
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
