Method Article

Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

DOI:

10.3791/63536

⸱

February 1st, 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir proteinin kromatin üzerindeki bağlanma yerlerinin belirlenmesi, işlevini ve potansiyel düzenleyici hedeflerini anlamak için gereklidir. Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), 30 yılı aşkın bir süredir protein lokalizasyonunu belirlemek için altın standart olmuştur ve ilgilenilen proteini sonikleştirilmiş veya enzimatik olarak sindirilmiş kromatinden çıkarmak için bir antikor kullanımı ile tanımlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, antikor bağlama teknikleri, artan duyarlılıkları nedeniyle kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu değerlendirmek için popüler hale gelmiştir. Nükleaz Altında Hedefler Altında Bölünme ve Salınım (CUT&RUN), Kromatin İmmünoklevajının (ChIC) genom çapında türevidir ve ilgilenilen bir proteini hedefleyen antikorun IgG sabit bölgesini tanımlamak için mikrokokal nükleaza (pA-MNase) bağlı rekombinant Protein A'yı kullanır, bu nedenle ilgilenilen proteini çevreleyen DNA'nın bölgeye özgü bölünmesini sağlar. CUT&RUN, histon modifikasyonlarını, transkripsiyon faktörlerini ve nükleozom yeniden şekillendirme faktörleri gibi diğer kromatin bağlayıcı proteinleri profillemek için kullanılabilir. Daha da önemlisi, CUT&RUN, ökromatik veya heterokromatik ilişkili proteinlerin ve histon modifikasyonlarının lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenlerden dolayı, CUT&RUN çok çeşitli proteinlerin bağlanma profillerini belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Son zamanlarda, CUT&RUN, düşük hücre popülasyonlarında ve tek hücrelerde transkripsiyon faktörü profillemesi için optimize edilmiştir ve optimize edilmiş protokol ultra düşük girişli CUT&RUN (uliCUT&RUN) olarak adlandırılmıştır. Burada, uliCUT & RUN kullanılarak manuel 96 kuyucuklu bir biçimde tek hücreli faktör profili oluşturma için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok nükleer protein, DNA şablonlu aktiviteleri teşvik etmek veya önlemek için kromatin ile etkileşime girerek işlev görür. Bu kromatin etkileşiminde bulunan proteinlerin işlevini belirlemek için, bu proteinlerin bağlandığı genomik yerleri tanımlamak önemlidir. 1985 yılında geliştirilmesinden bu yana, Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), bir proteinin kromatin 1,2'ye nerede bağlandığını belirlemek için altın standart olmuştur. Geleneksel ChIP tekniği aşağıdaki temel iş akışına sahiptir: hücreler toplanır ve çapraz bağlanır (genellikle formaldehit ile), kromatin kesilir (genellikle çapraz bağlama gerektiren sert sonikasyon yöntemleriyle), ilgilenilen protein, proteini (veya etiketli proteini) hedef alan bir antikor kullanılarak immünopreprepite edilir, ardından ikincil bir antikor (agaroz veya manyetik boncuklara bağlanmış), çapraz bağlama tersine çevrilir, DNA'yı saflaştırmak için protein ve RNA sindirilir ve bu ChIP ile zenginleştirilmiş DNA, analiz için şablon olarak kullanılır (radyoetiketli problar1,2, qPCR3, mikrodiziler 5,6 veya dizileme4 kullanılarak). Mikrodizilerin ortaya çıkması ve büyük ölçüde paralel derin dizilemeyle birlikte, ChIP-çip 5,6 ve ChIP-seq4 daha yakın zamanda geliştirilmiştir ve kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun genom çapında tanımlanmasına izin vermektedir. ChIP'yi çapraz bağlamak, ChIP-exo7 ve ChIP-nexus8 tarafından çözünürlükte büyük ilerlemelerle ortaya çıkmasından bu yana güçlü ve güvenilir bir teknik olmuştur. ChIP-seq'in geliştirilmesine paralel olarak, geleneksel çapraz bağlama ChIP tekniklerinde gerçekleştirilen sonikasyonun aksine, kromatini parçalamak için nükleaz sindirimini (genellikle mikrokokal nükleaz veya MNaz kullanarak) kullanan ChIP (N-ChIP) için doğal (çapraz bağlanmayan) protokoller kurulmuştur9. Bununla birlikte, hem çapraz bağlanma ChIP hem de N-ChIP teknolojilerinin en büyük dezavantajlarından biri, deneysel manipülasyonu takiben düşük DNA verimi nedeniyle yüksek hücre sayılarına duyulan gereksinim olmuştur. Bu nedenle, son yıllarda, ChIP teknolojilerini düşük hücre girişi için optimize etmeye yönelik birçok çaba sarf edilmiştir. Bu çabalar, uygulanabilirlikleri ve girdi gereksinimleri10,11,12,13,14,15,16,17,18 olarak değişen birçok güçlü ChIP tabanlı teknolojinin geliştirilmesine neden olmuştur. Bununla birlikte, tek hücreli ChIP-seq tabanlı teknolojiler, özellikle histon olmayan proteinler için eksiktir.

2004 yılında, Kromatin Endojen Bölünme (ChEC) ve Kromatin İmmün Kemebölünme (ChIC)19 olarak adlandırılan kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için alternatif bir teknoloji geliştirilmiştir. Bu tek lokus teknikleri, ilgilenilen proteine bitişik DNA'nın doğrudan kesilmesi için MNaz'ın ilgilenilen proteine (ChEC) veya protein A'ya (ChIC) füzyonunu kullanır. Daha yakın yıllarda, hem ChEC hem de ChIC, kromatin (sırasıyla ChEC-seq ve CUT&RUN) üzerinde genom çapında protein profillemesi için optimize edilmiştir 20,21. ChEC-seq, faktör lokalizasyonunu belirlemek için güçlü bir teknik olsa da, her hedef için MNaz-füzyon proteinlerinin geliştirilmesini gerektirirken, ChIC ve genom çapındaki varyasyonu CUT&RUN, ilgilenilen proteine (ChIP'de olduğu gibi) ve Protein A'nın antikorun IgG sabit bölgesini tanıyabildiği rekombinant Protein A-MNaz'a yönelik bir antikora güvenir. Alternatif olarak, daha geniş bir yelpazedeki antikor sabit bölgelerini tanıyabilen bir füzyon Protein A / Protein G-MNaz (pA / G-MNaz) geliştirilmiştir22. CUT&RUN, kromatin genomu genelinde protein lokalizasyonunu belirlemek için hızla ChIP-seq'e popüler bir alternatif haline gelmiştir.

Düşük ve tek hücreli girişlerin kullanılmasını sağlayan bir CUT&RUN varyasyonu olan ultra düşük girişli CUT&RUN (ULICUT&RUN), 201923 yılında açıklanmıştır. Burada, manuel 96 delikli formatta tek hücreli bir uygulamanın metodolojisi açıklanmaktadır. uliCUT&RUN'un geliştirilmesinden bu yana, histon profillemesi için iki alternatifin, CUT&Tag ve iACT-seq'in geliştirildiğini ve histon proteinlerinin sağlam ve oldukça paralel profillenmesini sağladığını belirtmek önemlidir24,25. Ayrıca, scCUT&Tag, tek bir hücrede (multiCUT&Tag) birden fazla faktörün profilini çıkarmak ve histon olmayan proteinlere uygulama için optimize edilmiştir26. Birlikte, CUT&RUN, uliCUT&RUN'un bir hücre ayıklayıcıya ve standart ekipmana erişimi olan herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında gerçekleştirilebildiği düşük girişli ChIP-seq'e çekici bir alternatif sunar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik beyanı: Tüm çalışmalar Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Araştırma Koruma Ofisi tarafından onaylanmıştır.

1. Manyetik boncuklar hazırlayın

NOT: Hücre sıralamadan önce gerçekleştirin ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.

  1. Pipet 30 μL ConA-konjuge paramanyetik mikrosferler boncuk bulamaç karışımı taze 1,5 mL mikrofuge tüpe reaksiyon başına ve karıştırmak için hafifçe pipetleme yaparak 850 μL Bağlayıcı Tampon ekleyin.
    NOT: KonA konjuge paramanyetik mikrosferler, lipit membranının bağlanmasına izin veren lektin kaplı manyetik boncuklardır.
  2. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların 1-2 dakika boyunca mıknatıslanmasına izin verin. Süpernatant temizlendikten sonra, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
  3. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve 1 mL Bağlayıcı Arabelleğe geri sarılarak boncukları yıkayın.
  4. 1.2 ve 1.3 numaralı adımları yineleyin.
  5. Boncukları 2 dakika boyunca manyetize edin ve atmak için süpernatantı çıkarın.
  6. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları reaksiyon başına 30 μL Bağlayıcı Tamponda yeniden askıya alın.
  7. Yıkanmış boncuk karışımını hücreler sıralanana kadar buz üzerinde tutun.

2. Hasat hücreleri

NOT: Bu adım yapıştırılmış hücreler için yazılmıştır ve murin E14 embriyonik kök hücreleri için optimize edilmiştir. Hücrelerin kültürlenmesi ve toplanması hücre tipine bağlıdır.

  1. Hücreleri 37 °C inkübatörden çıkarın ve kaliteyi sağlamak için mikroskop altında inceleyin.
  2. Ortamı hücre plakasından aspire edin ve 5 mL 1x PBS ile durulayın.
  3. PBS'yi plakadan aspire edin ve hücreleri toplayın (hücre tipine göre farklılık gösterecek geleneksel hücre toplama yöntemlerini kullanarak). Gerekirse, kültür kabına karşı serolojik bir pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek, tek hücreli süspansiyon elde edin.
  4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'de aşağı doğru döndürün.
  5. Hücre peletini atmak ve yıkamak için medyayı 5 mL PBS +% 1 FBS ile aspire edin.
  6. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'de döndürün, süpernatanı atın ve hücre peletini 5 mL PBS +% 1 FBS'de yeniden askıya alın.
  7. Hücreleri sayın ve 1 mL'lik 1 x 106 hücreyi taze bir 1,5 mL mikrofüj tüpüne aktarın.
  8. 5 μL 7-Amino-Aktinomisin D (7-AAD) ekleyin, karıştırmak için tüpü iyice ters çevirin ve ardından canlı tek hücreleri 96 delikli bir plakanın ayrı deliklerine ayırmak için numuneyi hücre sıralayıcısına uygulayın.
    NOT: 7-AAD boya canlı hücrelerden dışlanır ve bu nedenle canlı hücre sıralamada kullanılabilir.

3. Hücre sıralama ve lizis

  1. Hücre sıralamadan önce her bir kuyucukta 100 μL Nükleer Ekstraksiyon (NE) Tamponu bulunan hücre ayıklayıcı uyumlu 96 delikli bir plaka hazırlayın.
  2. Üreticinin talimatlarını izleyerek hücreleri 96 delikli plakalara ayırın.
  3. Hücrelerin kuyucuklar içindeki tamponda olduğundan emin olmak için plakayı (30 s için 600 x g) hızla döndürün.
    NOT: Kullanılan hücrelerin kuyucukların dibine güvenilir bir şekilde getirilip getirilmediğini bir ön deneyde test etmeye değer.
  4. Örnekleri 15 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
  5. Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'de döndürün ve süpernatantı çıkarmak için dikkatlice pipet çekin (5 μL'yi geride bırakarak).
  6. Her numuneyi 55 μL NE tamponunda yeniden askıya alın ve her reaksiyona önceden yıkanmış ConA konjuge paramanyetik mikrosferlerin 30 μL'sini (adım 1.7'den; Bağlanma Tamponunda) ekleyin.
  7. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.

4. MNase ile erken sindirimi önlemek için numuneleri önceden bloke edin

  1. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların en az 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
  2. Çekirdeğe bağlı boncuklara 100 μL Bloke Edici Tampon ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.

5. Primer antikor ilavesi

  1. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
  2. Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları nazik pipetleme ile reaksiyon başına 100 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
  3. Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin, süpernatantın temizlenmesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
  4. Boncukları, nazik pipetleme ile reaksiyon başına 25 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
  5. Birincil antikor ana karışımı yapın: reaksiyon başına 25 μL Yıkama Tamponu + 0.5 μL antikor.
  6. Çekirdeğe bağlı boncukları nazikçe vortekslerken, ilgilenilen proteini hedefleyen bir antikor ile muamele edilen her numuneye birincil antikor ana karışımının 25 μL'sini ekleyin (tipik olarak 1:100 son seyreltme). Kontrol yapıyorsanız, antikor içermeyen 25 μL Yıkama Tamponu ekleyin.
  7. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  8. Numuneleri 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
  9. Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları pipetleme ile yeniden yayınlayarak 100 μL Yıkama Tamponu ile yıkayın.

6. pA-MNase veya pA/G-MNase ilavesi

NOT: Protein A, tavşanlar gibi belirli türlerden IgG molekülleri için yüksek bir afiniteye sahiptir, ancak fareler veya sıçanlar gibi diğer türlerden IgG'ler için uygun değildir. Alternatif olarak, Protein A / G-MNaz kullanılabilir. Bu melez, tavşan, fare ve sıçan IgG'lerini bağlar ve fare veya sıçan birincil antikorları kullanıldığında ikincil antikorlara ihtiyaç duyulmasını önler.

  1. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa geri yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
  2. Plakayı manyetik raftan çıkarın ve her numuneyi 25 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
  3. Bir pA-MNase ana karışımı yapın (25 μL Yıkama Tamponu + reaksiyon başına optimize edilmiş pA-MNaz miktarı).
  4. Hafifçe girdap yaparken, kontrol numuneleri de dahil olmak üzere her numuneye 25 μL pA-MNase ana karışımı ekleyin.
    NOT: pA-MNaz konsantrasyonu, ev yapımı ise hazırlığa göre değişir ve her bağımsız saflaştırmada kullanımdan önce test edilmelidir. pA/G-MNaz için 20x stoğun 2,5 μL'si kullanılmalıdır.
  5. Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
  7. Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları 100 μL Yıkama Tamponu ile yıkayın, nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.

7. Yönlendirilmiş DNA sindirimi

  1. Plakayı 96 delikli bir manyetik rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
  2. Numuneleri manyetik raftan çıkarın ve boncukları nazik pipetleme ile 50 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
  3. Numuneleri 5 dakika boyunca bir buz/su karışımında 0 °C'ye dengeleyin.
  4. Numuneleri 0 °C buz/su banyosundan çıkarın ve çok kanallı pipet kullanarak 1 μL 100 mM CaCl2 ekleyin. Daha büyük hacimli çok kanallı pipet kullanarak nazik pipetleme ile iyice karıştırın (3-5 kez) ve ardından numuneleri 0 °C'ye geri döndürün.
    NOT: Burada iyice karıştırmak çok önemlidir. CaCl2 , ilgilenilen proteini çevreleyen DNA'nın MNaz sindirimini aktive etmek için eklenir.
  5. Plaka buz / su banyosuna geri döner dönmez 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın.
  6. CaCl 2 eklendiği sıraya göre her bir kuyucuğa 50 μL 2XRSTOP+ Buffer pipetleyerek reaksiyonu durdurun.
    NOT: Aşırı sindirimi önlemek için 10 dakikalık sindirim bitmeden önce 2XRSTOP+ Buffer yapın.

8. Numune fraksiyonasyonu

  1. Numuneleri 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Plakayı 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16.000 x g'de döndürün.
  3. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve süpernatantları taze bir 96 delikli plakaya aktarın. Boncukları atın.

9. DNA ekstraksiyonu

  1. Her numuneye 1 μL %10 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) ve 0.83 μL 20 mg/mL Proteinaz K ekleyin.
    DİKKAT: SDS tozu solunduğunda zararlıdır. Kullanıcılar iyi havalandırılan alanlarda gözlük, eldiven ve N95 sınıfı solunum cihazı takarak dikkatli bir şekilde kullanmalıdır.
  2. Numuneleri nazik pipetleme ile karıştırın.
  3. Numuneleri 70 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Plakayı oda sıcaklığına geri döndürün ve 46,6 μL 5 M NaCl ve 90 μL %50 PEG 4000 ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın.
  5. Her numuneye 33 μL polistiren-manyetit boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: Polistiren-manyetit boncukları oda sıcaklığına (~ 30 dakika) getirdiğinizden ve kullanmadan önce iyice karıştırdığınızdan emin olun.
  6. Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatantın ~ 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın.
  7. Boncukları rahatsız etmeden 150 μL %80 etanol ile 2x durulayın.
    DİKKAT: Etanol oldukça yanıcıdır ve cilt, göz ve akciğer tahrişine neden olur. Bu adımı uygun laboratuvar kıyafetleriyle ve havalandırmalı bir başlıkta gerçekleştirin.
  8. Plakayı 30 s için 1000 x g'de kısaca döndürün. Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden kalan tüm EtOH'leri çıkarın.
  9. Numuneleri ~ 2-5 dakika boyunca hava ile kurulayın.
    NOT: Boncukları 5 dakikadan daha uzun süre kurutmayın. EtOH'yi çıkarma konusunda gayretliyse, 2-3 dakika kurutma yeterlidir.
  10. Boncukları 37,5 μL 10 mM Tris-HCl (pH 8) ile yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  11. Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin.
  12. Süpernatantın 36,5 μL'sini taze bir termosikler uyumlu 96 delikli plakaya aktarın. Boncukları atın.
    NOT: Deney, numuneler -20 °C'de depolanarak burada durdurulabilir veya kütüphane oluşturma işlemine devam edebilir (10-15. adımlar).

10. Son onarım, fosforilasyon, adenilasyon

NOT: Reaktifler, Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi tedarik edilir. Aşağıdaki protokol, NEBNext Ultra DNA II kiti gibi ticari kitlere benzer bir yöntem izler.

  1. 5 U/μL T4 DNA polimeraz 1:20'yi 1x T4 DNA ligaz tamponunda seyreltin.
  2. Bir son onarım/3'A ana karışım hazırlayın: 2 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu, 2,5 μL 10 mM dNTP, 1,25 μL 10 mM ATP, 3,13 μL %40 PEG 4000, 0,63 μL 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL seyreltilmiş T4 DNA polimeraz, 0,5 μL 5U/μL Taq DNA polimeraz, reaksiyon başına toplam hacmi 13,5 μL.
    NOT: Pipetlemeden önce oda sıcaklığına %40 PEG 4000 getirdiğinizden emin olun.
  3. 36,5 μL DNA'ya 13,5 μL son onarım/3'A ana karışım ekleyin.
  4. Reaksiyonu hızlı girdap ve ardından hızlı bir spin (10 s için 500 x g) ile karıştırın.
  5. >20 °C sıcaklıklar için ısıtılmış kapaklı önceden soğutulmuş bir termosikler'de aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanarak inkübe edin. Reaksiyon koşullarını kullanın: 15 dakika için 12 °C, 15 dakika için 37 °C, 20 dakika için 72 °C, 4 °C'de tutun.

11. Adaptör ligasyonu

NOT: Aşağıdaki reaksiyonu ayarlarken numuneleri buz üzerinde tutun. Pipetlemeden önce ligaz tamponunun oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Adaptörü (bkz. Malzeme Tablosu) 10 mM NaCl (pH 7,5) içeren 10 mM Tris-HCl'lik bir çözelti içinde seyreltin. Düşük verim nedeniyle, CUT & RUN ile zenginleştirilmiş DNA'yı önceden ölçmeyin. Bunun yerine, 0,6 μM'lik son çalışma adaptörü konsantrasyonunu kullanarak adaptörün 25 kat seyreltilmesini sağlayın.

  1. Bir ligasyon ana karışımı yapın: 55 μL ligaz tamponu (2x), 5 μL T4 DNA ligaz ve 5 μL seyreltilmiş Adaptör, reaksiyon başına toplam 65 μL hacim.
  2. Ana ligasyon karışımının 65 μL'sini, adım 10.5'ten itibaren 50 μL DNA'ya ekleyin.
  3. Hızlı vorteksleme ile karıştırın, ardından hızlı eğirme (10 s için 500 x g).
  4. 15 dakika boyunca bir termosiklerde (ısıtılmış kapak olmadan) 20 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Hemen aşağıdaki adıma geçin.

12. KULLANICI sindirimi

  1. Her numuneye, girdaba ve spine 3 μL USER enzimi ekleyin (10 s için 500 x g).
  2. Termal bisikletçide 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin (ısıtmalı kapak 50 °C'ye ayarlanmıştır).

13. Ligasyon reaksiyonunu takiben polistiren-manyetit boncuk temizliği

NOT: Polistiren-manyetit boncukların oda sıcaklığında (~30 dakika) dengelenmesine izin verin. Kullanmadan önce boncuk çözeltisini homojenize etmek için vorteks. Aşağıdaki adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin.

  1. Adaptör bağlı DNA içeren her bir kuyucuğa 39 μL (0.33x) polistiren-manyetit boncuk çözeltisi ekleyin.
  2. Pipetleme ile iyice karıştırın ve ardından DNA'nın boncuklara bağlanmasına izin vermek için numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Numuneleri 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant temizlenene kadar 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Plakayı manyetik rafta tutun ve boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
  5. Boncukları rahatsız etmeden 200 μL% 80 EtOH ile durulayın.
  6. Çözümün temizlenmesini sağlamak için 96 delikli manyetik rafta 30 s boyunca inkübe edin.
  7. Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
  8. Toplam iki yıkama için 13,5-13,7 arasındaki adımları yineleyin.
  9. Plakayı 10 s boyunca 500 x g'de kısaca döndürün, plakayı 96 delikli bir manyetik rafa geri yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden artık EtOH'yi çıkarın.
  10. Plakayı manyetik rafta tutun ve numuneleri 2 dakika boyunca hava ile kurulayın.
    NOT: Boncukları fazla kurutmayın.
  11. Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları 10 mM Tris-HCl'nin (pH 8) 28,5 μL'sinde yeniden askıya alın.
    DİKKAT: Hidroklorik asit çok aşındırıcıdır. Kullanıcılar gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyen kimyasal bir duman başlığında dikkatli bir şekilde kullanmalıdır.
  12. Boncukları pipetleyerek, kabarcık üretmemeye dikkat ederek iyice askıya alın.
  13. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  14. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin 5 dakika boyunca temizlenmesine izin verin.
  15. 27.5 μL süpernatantı yeni bir PCR plakasına aktarın ve boncukları atın.

14. Kütüphane zenginleştirme

NOT: Astarlar, adaptörle aynı çözelti ile seyreltilir. Bu kütüphane yapısı için, 0,6 μM'lik son bir çalışma astarı konsantrasyonu kullanın.

  1. Her numuneye 5 μL seyreltilmiş indeksli astar ekleyin (bkz.
    NOT: Her numunenin sıralamadan sonra tanımlanması için farklı bir indekse ihtiyacı vardır.
  2. Bir PCR ana karışımı hazırlayın: 10 μL 5x yüksek doğrulukta PCR tamponu, 1,5 μL 10 mM dNTP, 5 μL seyreltilmiş Universal astar, 1 μL 1 U sıcak başlatma yüksek doğrulukta polimeraz, numune başına toplam ana karışım hacmi 17,5 μL.
  3. 32.5 μL saflaştırılmış adaptör bağlı DNA'ya 17.5 μL pf PCR karışımı ekleyin (bu hacme 5 μL indekslenmiş primer dahil edilmiştir).
  4. Pipetleme ile çözeltiyi karıştırın.
  5. Maksimum rampa hızı 3 °C / s olan aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanarak bir termosikkerde inkübe edin: 45 s için 98 °C, 45 s için 98 °C, 10 s için 60 °C, ikinci ve üçüncü adımları 21 kez, 72 °C'yi 1 dakika boyunca tekrarlayın, 4 °C'de tutun.
    NOT: Numuneler kısa süreli depolama için 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -20 °C'de tutulabilir.

15. Polistiren-manyetit boncuk temizliği

  1. Her numuneye 60 μL (1,2x) polistiren-manyetit boncuk ekleyin.
  2. Boncukları pipetleyerek, yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. Plakayı, çözelti temizlenene kadar 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin.
  4. Süpernatantı atın ve boncukları rahatsız etmeden 200 μL% 80 EtOH ile durulayın.
  5. Toplam iki adet %80 EtOH yıkama için yıkama adımını tekrarlayın.
  6. Plakayı 10 s boyunca 500 x g'de döndürün, plakayı 96 delikli bir manyetik rafa yerleştirin ve boncukların 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin.
  7. Boncukları rahatsız etmeden fazla EtOH'yi çıkarmak ve boncukların 2 dakika boyunca hava ile kurumasını sağlamak için pipet.
    NOT: Boncukları fazla kurutmayın.
  8. Boncukları 21 μL nükleaz içermeyen suda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  9. Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin 5 dakika boyunca temizlenmesine izin verin.
  10. Süpernatantın 20 μL'sini yeni bir plakaya aktarın.
    NOT: Deney, numune -20 °C'de saklanarak burada durdurulabilir.
  11. 1x HS reaktifi kullanarak kütüphane konsantrasyonlarını bir florometre ile ölçün (bkz.
  12. Konsantrasyon izin veriyorsa, görselleştirmek için düşük moleküler ağırlıklı bir merdivenle% 1.5 agaroz jeli üzerinde 30 ng numune çalıştırın. Alternatif olarak, bir Parça Analizörü veya ilgili cihaz üzerinde görselleştirin.
  13. ~ 50.000-100.000 benzersiz şekilde eşlenmiş okuma elde etmek için bir Illumina platformunda kütüphaneleri sıralayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, 96 kuyucuklu manuel bir format uliCUT & RUN kullanılarak kromatin üzerinde tek hücreli protein profillemesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Sonuçlar, profillenen proteine (protein bolluğu ve antikor kalitesi nedeniyle), hücre tipine ve diğer katkıda bulunan faktörlere bağlı olarak değişmekle birlikte, bu teknik için beklenen sonuçlar burada tartışılmaktadır. Hücre kalitesi (hücre görünümü ve canlı hücrelerin yüzdesi) ve tek hücreli sıralama, NE tamponuna canlı hücre ayıklamasından önce veya bu sıra...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN, kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu belirlemek için etkili bir protokoldür. Diğer protokollere göre birçok avantajı vardır: 1) yüksek sinyal-gürültü oranı, 2) hızlı protokol ve 3) düşük sıralama okuma kapsamı gerekli ve böylece maliyet tasarrufuna yol açar. Protein A- veya Protein A/G-MNaz kullanımı, CUT&RUN'un mevcut herhangi bir antikor ile uygulanmasını sağlar; bu nedenle, birçok proteinin profilini hızlı ve kolay bir şekilde çıkarma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, kromatin üzerindeki herhan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu projeyle ilgili hiçbir rakip çıkar beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hainer Lab üyelerine bu makalenin önceki bir versiyonunu okudukları ve yorumladıkları için teşekkür ederiz. Bu proje, Pittsburgh Üniversitesi Sağlık Bilimleri Sıralama Çekirdeği'nde bulunan NextSeq500'ü, Pittsburgh Çocuk Hastanesi'ndeki UPMC Çocuk Hastanesi'nde, direktörü William MacDonald'a özel teşekkürlerle sıralamak için kullandı. Bu araştırma kısmen Pittsburgh Üniversitesi Araştırma Hesaplama Merkezi tarafından sağlanan bilgisayar kaynakları aracılığıyla desteklenmiştir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe Numarası R35GM133732 (S.J.H.'ye) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL şeffaf mikrofüj tüpleriThermoFisher Scientific90410
1,5 mL tüp manyetik rafThermoFisher Scientific12321D
1,5 mL tüp uyumlu soğuk santrifüjEppendorf5404000537
10 cm steril doku kültürü plakalarıThermoFisher Scientific150464
10X T4 DNA Ligaz tamponuYeni İngiltere BiolabsB0202S
15 mL konik tüplerVWR89039-656
1X TE tamponuThermoFisher Scientific12090015
200 & mikro; L PCR tüpleriEppendorf951010022
2X hızlı ligaz tamponuNew England BiolabsM2200Ligaz Tamponu
5X KAPA HiFi tamponuRoche79588890015X yüksek kaliteli PCR tamponu
7-Amino-Aktinomisin D (7-AAD)Fisher ScientificBDB559925
96 kuyulu manyetik rafThermoFisher Scientific12027 veya 12331D
96 oyuklu plakaVWR82006-636
AMPure XP boncuklarıBeckman CoulterA63881polistiren-manyetit boncuklar; AMPure XP boncuk lotları arasındaki potansiyel değişkenlik nedeniyle, AMPure boncuk çözeltinizin kalibre edilmesi önerilir. Üreticiye bakın' s talimatları
İlgilenilen proteine karşı antikordeğişir
ATPThermoFisher ScientificR0441
BioMag Plus, Concanavalin A boncukPolysciences,86057-10ConA-konjuge paramanyetik mikroküreler,
BSA
Kalsiyum Klorür (CaCl2),Fisher ScientificAAJ62905AP
Hücre sıralayıcıBD FACSAria II hücre sıralayıcıEğitim gerektirir
Hücre kültürü için hücreye özgü ortamDeğişir
KloroformThermoFisher ScientificC298-500Kloroform cildi tahriş eder ve yutulduğunda zararlıdır; eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük kullanarak kimyasal bir davlumbaz takın
64 bit işlemcili bilgisayar ve süper bilgi işlem kümesineElde edilen sıralama veri kümelerinin hesaplamalı analizleri için
DNA döndürme sütunlarıEpoch Yaşam Bilimleri1920-250
dNTP setiNew England BiolabsN0446S
EGTASigma AldrichE3889
Elektroforez ekipmanıdeğişir
EthanolFisher Scientific22032601%100 hacim/hacim etanol son derece yanıcıdır; eldiven, laboratuvar önlüğü kullanarak kimyasal bir davlumbazda tutun, ve gözlük
Etilendiamintetraasetik asit  (EDTA)Fisher ScientificBP2482100
FBSSigma AldrichF2442
GliserolFisher ScientificBP229-1
GlikojenVWR97063-256
HEPESFisher ScientificBP310-500
Heterolog S. cerevisiae DNA spike-inev yapımıÇapraz bağlı, MNaz ile sindirilmiş ve agaroz jel ekstrakte edilmiş genomik DNA'dan hazırlanır, protein / RNA'dan saflaştırılır ve 10 ng / mL'ye seyreltilir. Maya genomik DNA'sını öneriyoruz, ancak gerekirse diğer organizmalar da kullanılabilir.
Hidroklorik Asit  (HCl)Fisher ScientificA144-212Hidroklorik Asit çok aşındırıcıdır; eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük kullanarak kimyasal bir davlumbaz içinde tutun
Buz Kovasıdeğişir
Illumina Sıralama platformu (örneğin, NextSeq500)Illumina
İnkübatörüThermoFisher Bilimsel51030284
5X KAPA HiFi tamponlu KAPA HotStart HiFi DNA PolimerazRoche7958889001Hotstart Yüksek Kaliteli Polimeraz
Laminer akış davlumbazıFırın ŞirketiSG404
Manganez Klorür (MnCl2)Sigma Aldrich244589
Mikropipet setiRainin30386597
MinifugeBenchmark ScientificC1012
NEB AdaptörüNew England BiolabsE6612AVIALAdaptörü
NEB Evrensel astarNew England BiolabsE6611AVIALÜniversal Astar
NEBNext Illumina kiti için Multipleks OligolarNew England BiolabsE7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/Lİndeksli Primerler
Negatif kontrol antikoruAntikorlar-ÇevrimiçiABIN101961
Nükleaz içermeyen suNew England BiolabsB1500S
PCR termodöngüleyiciEppendorf2231000666
Faz kilit tüpleriQiagen129046
Fenol/Kloroform/İzoamil Alkol (PCI)ThermoFisher Scientific15593049Fenol yutulduğunda veya ciltle temas ettiğinde zararlıdır; eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük
kullanarak kimyasal bir davlumbaz takınFosfat tamponlu tuzlu su (PBS)ThermoFisher Scientific10814010
Pipet yardımıDrummond Scientific# 4-000-100
Polietilen glikol (PEG) 4000VWRA16151
Potasyum Klorür (KCl)Sigma AldrichP3911
Potasyum Hidroksit (KOH)Fisher ScientificP250-1DİKKAT: KOH, çözelti içinde katı ve aşındırıcı olarak gözü/cildi tahriş edicidir. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük kullanarak kimyasal çeker ocakta tutun
Proteaz İnhibitörleriThermoFisher Scientific78430
ProteinA/G-MNaseEpicypher15-1016pA/G-MNaz
ProteinA-MNase, pK19pA-MNAddgene86973'ten
Proteinaz KNew England BiolabsP8107S
Qubit 1X dsDNA HS Test KitiThermoFisher ScientificQ33230
Qubit Test tüpleriThermoFisher ScientificQ32856
Qubit FlorometreThermoFisher ScientificQ33238
2X Hızlı Ligaz tamponlu Hızlı LigazNew England BiolabsM2200S
RNase ANew England BiolabsT3010
Sodyum Asetat  (NaOAc)ThermoFisher ScientificBP333-500
Sodyum Klorür (NaCl)Sigma AldrichS5150-1L
Sodyum dodesil sülfat (SDS)ThermoFisher ScientificBP166-500SDS solunduğunda zehirlidir; Sodyum Hidroksit (NaOH) ile çalışırken eldiven, göz koruması ve N95 sınıfı solunum cihazı kullanarak iyi havalandırılan alanlarda dikkatli
kullanınFisher ScientificS318-1NaOH, çözelti içinde katı ve aşındırıcı olarak gözü/cildi tahriş edicidir. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük kullanarak kimyasal bir çeker ocakta tutun
SpermidinSigma AldrichS2626
Standart Ters Işık MikroskobuLeica11526213
Standart laboratuvar agaroz jel malzemeleriDeğişir
T4 DNA LigazYeni İngiltere BiolabsM0202S
T4 DNA PolimerazNew England BiolabsM0203S
T4 PNKNew England BiolabsM0201S
Masaüstü girdapFisher Scientific2215414
Taq DNA PolimerazNew England BiolabsM0273S
ThermomixerEppendorf5384000020Alternatif olarak, bir su banyosu kullanabilir
Tris tabanıFisher ScientificBP152-5
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1Triton X-100 tehlikelidir;
TrypsinFisher ScientificMT25052
Tüp döndürücüVWR10136084
New England BiolabsM5505S
: : , , erişim Sıcaklık ve atmosfer kontrollü saflaştırılmış Serolojik pipetler ve pipet uçları gibi standart laboratuvar malzemeleri Değişir KULLANICI enzimini kullanırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük kullanın

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  2. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  3. Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
  4. Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
  5. Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
  6. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  7. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  8. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
  9. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  10. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  11. Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
  12. Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
  13. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  14. Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
  15. Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
  16. Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232(2013).
  17. Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083(2015).
  18. Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033(2015).
  19. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  20. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733(2015).
  21. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856(2017).
  22. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314(2019).
  23. Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
  24. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  25. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  26. Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
  27. Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
  28. Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
  29. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  30. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell CUT RUNChromatin Protein LocalizationUltra Low InputTranscription Factor ProfilingChromatin ImmunoprecipitationAntibody TetheringProtein A MNase96 Well FormatDNA ExtractionEmbryonic Stem Cells

Related Articles