Method Article

Raman Boyaları ile Yüksek Oranda Çoklanmış Doku Görüntüleme

DOI:

10.3791/63547

⸱

April 21st, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi, yüksek oranda çoklanmış epitop bazlı protein görüntüleme için yeni bir platformdur. Burada, antikor hazırlama, doku örneği boyama, SRS mikroskop montajı ve epr-SRS doku görüntülemeyi içeren pratik bir kılavuz sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokulardaki spesifik biyobelirteçlerin geniş bir kapsamını görselleştirmek, karmaşık biyolojik sistemlerin karmaşık organizasyonlarını keşfetmede hayati bir rol oynar. Bu nedenle, yüksek oranda çoklanmış görüntüleme teknolojileri giderek daha fazla takdir edilmektedir. Burada, gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi yoluyla standart immünofloresansla karşılaştırılabilir duyarlılığa sahip spesifik proteinlerin yüksek oranda çoklanmış titreşimsel görüntülemesinin ortaya çıkan bir platformunu tanımlamaktayız. Bu yöntem, geleneksel immünofloresansta spektral olarak çözülebilir kanalların sınırını aşar ve hücre altı çözünürlüğe sahip dokulardaki çoklu belirteçleri sorgulamak için tek atışlık bir optik yaklaşım sağlar. Genellikle paraformaldehit ile sabitlenmiş dokular, dondurulmuş dokular ve formalin sabit parafin gömülü (FFPE) insan dokuları dahil olmak üzere standart doku preparatları ile uyumludur. Bu platformun, özellikle kalın bozulmamış dokular için biyolojik örneklerin protein etkileşimlerinin daha kapsamlı bir resmini sağlayacağını öngörüyoruz. Bu protokol, antikor hazırlamadan doku örneği boyamaya, SRS mikroskop montajına, epr-SRS doku görüntülemeye kadar iş akışını sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleks doku sistemleri, mekansal konumları ve etkileşim ağları işlevleri ve işlev bozuklukları ile derinden iç içe geçmiş farklı hücresel alt popülasyonlardan oluşur 1,2. Doku mimarisini ortaya çıkarmak ve karmaşıklığını sorgulamak için, proteinlerin tek hücre çözünürlüğündeki uzamsal konumlarının bilgisi esastır. Bu nedenle, yüksek oranda çoklanmış protein görüntüleme teknolojileri giderek daha fazla takdir edilmektedir ve doku biyolojisi 3,4,5'i incelemek için bir köşe taşı haline gelebilir. Günümüzde yaygın olar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan hayvan deney protokolüne (AC-AABD1552) uygun olarak yürütülmüştür.

1. Raman boyası konjuge antikorların hazırlanması

  1. Konjugasyon tamponunu PBS tamponunda ~0,1 M NaHCO 3 olarak hazırlayın, pH =8,3 , 4 °C'de saklayın.
  2. N-hidroksissüksinimidi (NHS) ester fonksiyonlu MARS probu (Ek Malzeme) çözeltisini susuz DMSO'da 3 mM olarak hazırlayın. MARS problarının sentezi önceki raporlara atıfta bulunabilir13,17,18

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 3, sabit hücreler (Şekil 3A), paraformaldehit (PFA)-sabit fare dokuları (Şekil 3B) ve formalin sabit parafin gömülü (FFPE) insan örnekleri (Şekil 3C) dahil olmak üzere farklı örneklerdeki epr-SRS'nin örnek görüntülerini göstermektedir. SRS mikroskobunun uzamsal çözünürlüğü kırınım sınırlıdır, tipik yanal çözünürlük ~ 300 nm'dir ve eksenel çözünürlük, uyarma için yakın kızılötesi ışık kullanılarak .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, taze korunmuş fare dokuları, FFPE insan dokuları ve dondurulmuş fare dokuları dahil olmak üzere yaygın doku tiplerine geniş çapta uygulanabilir olan immüno-eprSRS protokolünü sunuyoruz. İmmüno-eprSRS, Tablo 1'de listelendiği gibi, hücrelerdeki ve dokulardaki epitoplardan oluşan bir panel için doğrulanmıştır. Bu tek atışlık platform, döngüsel stratejilerin iyi çalışmadığı uygulamalar için özellikle uygundur. Örneğin, döngüsel floresan kalın dokular için talep ediyor, çünkü 3D immünoetiketlemenin ç.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruth A. Singer ve Richard K.P. Benninger'e fare pankreas dokuları sağladıkları için teşekkür ederiz. W.M., NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) ve ABD Ordusu'nun (W911NF-19-1-0214) desteğini kabul etmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 16 Paraformaldehit, EM DereceliElektron Mikroskobu Bilimleri15710
&alfa;-tubulinAbcamab18251Primer antikorlar
&alfa;-tubulinBioLegend625902Primer antikorlar
β-III-tubulinBioLegend657402Primer antikorlar
β-III-tubulinAbcamab41489Birincil antikorlar
β-tubulinAbcamab131205Birincil antikorlar
Agaroz, düşük jelleşme sıcaklığıSigma AldrichA9414Beyin gömme için
Tavşanda üretilen anti-a-tubulin antikoru (&alfa;-tubulin)Abcamab52866Birincil antikorlar
Farede üretilen anti-Calbindin antikoru (Calbindin)Abcamab82812Birincil antikorlar
Anti-GABA B reseptörü R2  kobayda üretilen antikor (GABA B reseptörü R2)Millipore SigmaAB2255Birincil antikorlar
Keçide üretilen anti-GFAP antikoru (GFAP)Thermo ScientificPA5-18598Birincil antikorlar
Farede üretilen anti-Glukagon  antikor (Glukagon)Santa Cruz Biyoteknolojisc-514592Birincil antikorlar
Gine domuzunda üretilen anti-insülin antikoru (insülin)DAKOIR00261-2Birincil antikorlar
Sıçanlarda üretilen anti-MBP antikoru (MBP)Abcamab7349Birincil antikorlar Tavşanlarda
üretilen anti-NeuN antikoru (NeuN)Thermo ScientificPA5-78639Birincil antikorlar
Keçide üretilen Anti-Pankreatik polipeptit (PP) antikoru- Pankreatik polipeptit (PP)Sigma AldrichSAB2500747Primer antikorlar Tavşanda
üretilen anti-Pdx1 antikoru (Pdx1)Milipore06-1379Primer antikorlar
Sıçanlarda üretilen anti-Somatostatin antikoru (Somatostatin)Abcamab30788Primer antikorlar
Tavukta üretilen anti-Vimentin antikoru ( Vimentin)Abcamab24525Birincil antikorlar
Bant geçiren filtreKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm SonlandırıcıMini DevrelerSTRM-50
BNC kablosuThorlabs2249-CKoaksiyel Kablo, BNC Erkek / Erkek
Geniş bant dielektrik aynaThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
C57BL/6J farelerJackson Laboratuvarı000664
Santrifüj
KondansatörüOlympusyağa daldırma, 1.4 N.A.
Sitokeratin 18Abcamab7797Birincil antikorlar
Sitokeratin 18Abcamab24561Birincil antikorlar
DC güç kaynağıTopWard6302DÖnyargı voltajı 64 V
Dikroik montajThorlabsKM100CL1.3" (33 mm) Boyuna kadar Kinematik Montaj Uzun Dikdörtgen Optikler, Solak
Eşek Anti-Tavuk IgY (H + L)Jackson ImmunoResearch703-005-155MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Keçi IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch705-005-147MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Kobay IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch706-005-148MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Fare IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch715-005-151MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Tavşan IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch711-005-152MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Sıçan IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch712-005-153MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Koyun IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch713-005-147İkincil MARS konjugasyonu için antikorlar
DPBSFisher Scientific14-190-250
EpCAMAbcamab71916Birincil antikorlar
EtanolSigma Aldrich443611
Hızlı hızlı bak-in amplifikatörZürih AletleriHF2LIDC - 50 MHz
FFPE Böbrek ÖrneğiUSBiomaxHuFPT072
FibrillarinAbcamab5821Birincil antikorlar
GiantinAbcamab24586Birincil antikorlar
GlukagonSanta Cruz Biyoteknolojisc-514592Birincil antikorlar
H2BAbcamab1790Birincil antikorlar
HeLaATCCATCC CCL-2
Yüksek OD bant geçiren filtreChroma TeknolojiET890/220mStokes ışınını filtreleyin ve pompa ışınını iletin
Hidrofobik kalemFisher ScientificNC1384846
İnsülinThermoFisher701265Birincil antikorlar
Entegre SRS lazer sistemiUygulamalı Fizik & Elektronik A.Ş.picoEMERALDpicoEMERALD, Stokes ışını olarak görev yapan 6 ps darbe genişliği ve 80 MHz tekrarlama oranı ile 1.064 nm'de bir çıkış darbe treni sağlar. 532 nm'de frekans ikiye katlanmış ışın, beş ~ 6 ps darbe genişliğine sahip mod kilitli bir darbe dizisi üretmek için bir pikosaniye optik parametrik osilatörü (OPO) eşzamanlı olarak tohumlamak için kullanılır (OPO'nun avara ışını bir interferometrik filtre ile bloke edilir). OPO'nun çıkış dalga boyu 720&ndash arasında ayarlanabilir; Pompa ışını olarak görev yapan 950 nm. 1.064 nm Stokes ışınının yoğunluğu, %90'dan fazla modülasyon derinliği ile 8 MHz'de yerleşik bir EOM tarafından sinüzoidal olarak modüle edilir. Pompa ışını, picoEMERALD içinde dikroik bir ayna kullanılarak Stokes ışını ile uzamsal olarak üst üste bindirilir. Pompa ve Stokes darbe trenleri arasındaki zamansal örtüşme, yerleşik bir gecikme aşaması ile elde edilir ve mikroskopta saf D2O'nun SRS sinyali ile optimize edilir.
Ters lazer tarama mikroskobuOlympusFV1200MPE
Kinematik ayna montajıThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Düşük Profilli Altıgen Ayarlayıcı
Triticum vulgaris'ten (buğday) lektinSigma AldrichL0636-5 mg
Uzun geçişli dikroik ışın ayırıcıSemrockDi02-R980-25x36980 nm lazer BrightLine  tek kenarlı lazer düz dikroik ışın ayırıcı
MAP2BioLegend801810Birincil antikorlar
Mikroskopi görüntüleme yazılımıOlympusFluoView
NanoQuant PlakaTecanBir plaka okuyucuda absorbans tabanlı, küçük hacimli analizler için.
Normal eşek serumuJackson ImmunoResearch017-000-121
NucBlue Sabit Hücreli ReadyProbes Reaktif (DAPI)Thermo ScientificR37606
Nunc 4 Kuyulu YemeklerFisher Scientific12-566-300
Objektif lensOlympusXLPlan Nx25, 1.05-NA, MP, çalışma mesafesi =  2&incelt; mm
Boya fırçası
Periskop düzeneğiThorlabsRS99, üst ve alt üniteleri içerir, & Oslash; 1 "direk ve sıkıştırma çatalı.
pH metre
Plaka okuyucuTecanInfinite 200 PROKullanımı kolay, çok modlu bir plaka okuyucu. 230 ° C'lik bir spektral aralıkta absorbans ölçüm yetenekleri; 1000 deniz mili.
ProLong Gold antifade reaktifiThermo ScientificP36930
PSD95Invitrogen51-6900Birincil antikorlar
Sephadex G-25 OrtaGE Yaşam Bilimleri17-0033-01jel filtrasyon reçinesi tuzdan arındırma ve tampon değişimi için
BNC konektörlü korumalı kutuPomona Electronics2902kapaklı alüminyum kutu, BNC dişi/dişi
Si fotodiyotThorlabsFDS1010350– 1100 nm, 10 mm x 10 mm Aktif Alan
Synapsin 2ThermoFisherOSS00073GPrimer antikorlar
Doku Yolu Superfrost Plus Altın SlaytlarFisher Scientific22-035813Taze veya formalinle sabitlenmiş doku bölümlerini slayt yüzeyine sıkıca çekmek ve kimyasal olarak bağlamak için yapışkan slayt (tiisue bağlayıcı cam slaytlar)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
VibratomLeicaVT1000
VimentinAbcamab8069Birincil antikorlar
KsilenlerSigma Aldrich214736

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  2. Taube, J. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Tissue ImagingRaman DyesStimulated Raman ScatteringProtein Marker ImagingImmunofluorescence AlternativeTissue ClearingSubcellular ResolutionAntibody ConjugationSize Exclusion ChromatographyBrain Tissue Imaging

Related Articles