Yöntem makalesi

Raman Boyaları ile Yüksek Oranda Çoklanmış Doku Görüntüleme

DOI:

10.3791/63547

⸱

21 Nisan 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi, yüksek oranda çoklanmış epitop bazlı protein görüntüleme için yeni bir platformdur. Burada, antikor hazırlama, doku örneği boyama, SRS mikroskop montajı ve epr-SRS doku görüntülemeyi içeren pratik bir kılavuz sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokulardaki spesifik biyobelirteçlerin geniş bir kapsamını görselleştirmek, karmaşık biyolojik sistemlerin karmaşık organizasyonlarını keşfetmede hayati bir rol oynar. Bu nedenle, yüksek oranda çoklanmış görüntüleme teknolojileri giderek daha fazla takdir edilmektedir. Burada, gökkuşağı benzeri Raman boyalarının elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılması (epr-SRS) görüntülemesi yoluyla standart immünofloresansla karşılaştırılabilir duyarlılığa sahip spesifik proteinlerin yüksek oranda çoklanmış titreşimsel görüntülemesinin ortaya çıkan bir platformunu tanımlamaktayız. Bu yöntem, geleneksel immünofloresansta spektral olarak çözülebilir kanalların sınırını aşar ve hücre altı çözünürlüğe sahip dokulardaki çoklu belirteçleri sorgulamak için tek atışlık bir optik yaklaşım sağlar. Genellikle paraformaldehit ile sabitlenmiş dokular, dondurulmuş dokular ve formalin sabit parafin gömülü (FFPE) insan dokuları dahil olmak üzere standart doku preparatları ile uyumludur. Bu platformun, özellikle kalın bozulmamış dokular için biyolojik örneklerin protein etkileşimlerinin daha kapsamlı bir resmini sağlayacağını öngörüyoruz. Bu protokol, antikor hazırlamadan doku örneği boyamaya, SRS mikroskop montajına, epr-SRS doku görüntülemeye kadar iş akışını sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleks doku sistemleri, mekansal konumları ve etkileşim ağları işlevleri ve işlev bozuklukları ile derinden iç içe geçmiş farklı hücresel alt popülasyonlardan oluşur 1,2. Doku mimarisini ortaya çıkarmak ve karmaşıklığını sorgulamak için, proteinlerin tek hücre çözünürlüğündeki uzamsal konumlarının bilgisi esastır. Bu nedenle, yüksek oranda çoklanmış protein görüntüleme teknolojileri giderek daha fazla takdir edilmektedir ve doku biyolojisi 3,4,5'i incelemek için bir köşe taşı haline gelebilir. Günümüzde yaygın olarak kullanılan çoklanmış protein görüntüleme yöntemleri iki ana kategoriye ayrılabilir. Bunlardan biri, çoklu doku boyama ve görüntüleme turlarına dayanan seri immünofloresan görüntüleme, diğeri ise ağır metal etiketli antikorlar 6,7,8,9,10,11,12 ile birleştirilmiş görüntüleme kütle sitometrisidir.

Burada, multipleks antikor bazlı protein görüntüleme için alternatif bir strateji tanıtılmıştır. Geniş uyarma ve emisyon spektrumları (yarı maksimumda tam genişlik (FWHM) ~500 cm-1) nedeniyle aynı anda yalnızca 4-5 kanalı görselleştirebilen yaygın floresan görüntüleme yönteminin aksine, Raman mikroskobu çok daha dar spektral çizgi genişliği (FWHM ~ 10 cm-1) sergiler ve bu nedenle ölçeklenebilir çokluluk sağlar. Son zamanlarda, dar spektrumdan yararlanarak, elektronik pre-rezonans uyarılmış Raman saçılma (epr-SRS) mikroskobu adı verilen yeni bir Raman mikroskobu şeması geliştirilmiştir ve çoklanmış görüntüleme için güçlü bir strateji sağlanmıştır13. Raman boyalarının elektronik olarak bağlanmış titreşim modlarını araştırarak, epr-SRS, Raman kesitleri üzerinde 10 13 kat ciddi bir iyileştirme etkisi elde eder ve geleneksel Raman mikroskopisinin hassasiyet darboğazının üstesinden gelir (Şekil 1A)13,14,15. Sonuç olarak, epr-SRS'nin tespit sınırı,Raman'ın 13,16 hücrelerinin içindeki spesifik proteinler ve organeller gibi ilginç moleküler belirteçlerin tespit edilmesini sağlayan μM'nin altına itilmiştir. Özellikle, Raman boya konjuge antikorları kullanılarak, hücrelerdeki ve dokulardaki spesifik proteinlerin (immüno-eprSRS olarak adlandırılır) epr-SRS görüntülemesi, standart immünofloresansla karşılaştırılabilir duyarlılıkla gösterilmiştir (Şekil 1B)13,17. Pompa dalga boyunu sadece 2 nm ayarlayarak, epr-SRS sinyali tamamen kapalı olacaktır (Şekil 1B), bu da yüksek titreşim kontrastını gösterir.

Prob tarafında, antikor konjugasyonu13,18,19,20 için Manhattan Raman saçılma (MARS) boyaları adı verilen bir dizi gökkuşağı benzeri Raman probu geliştirilmiştir. Bu eşsiz Raman paleti, her biri biyoortogonal Raman spektral aralığında tek ve dar bir epr-SRS zirvesi gösteren π konjuge üçlü bağları (Ek Malzeme) taşıyan yeni boyalardan oluşur (Şekil 1C). Çekirdek kromoforun yapısını değiştirerek ve üçlü bağın her iki atomunu izotopik olarak düzenleyerek (Ek Malzeme), spektral olarak ayrılmış Raman probları geliştirilmiştir. Ölçeklenebilir çokluluktan yararlanan epr-SRS mikroskopisi, MARS boya paleti ile birleştiğinde, hücrelerde ve dokularda tek atışlık multipleks protein görüntüleme için optik bir strateji sunar.

İmmüno-eprSRS, kendine özgü güçlü yönleri olan mevcut multipleks protein görüntüleme yöntemlerine alternatif bir strateji sunmaktadır. Döngüsel boyama, görüntüleme ve sinyal giderme ile floresan yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, bu Raman tabanlı platform tek yuvarlak boyama ve görüntüleme sağlar. Bu nedenle, döngüsel prosedürlerdeki pratik karmaşıklığı ortadan kaldırır ve protokolü büyük ölçüde basitleştirir, böylece çoklanmış protein görüntülemenin yeni bölgelerini açar. Örneğin, Raman boyasına özel bir doku temizleme protokolünden yararlanan immüno-eprSRS, kalın bozulmamış dokularda yüksek oranda çoklanmış protein haritalaması için üç boyuta genişletilmiştir17. 10'dan fazla protein hedefi, milimetre kalınlığındaki fare beyin dokuları boyunca görselleştirildi17. Daha yakın zamanlarda, immüno-eprSRS'nin optimize edilmiş bir biyomolekül retansiyon genleşme mikroskobu (ExM) protokolü21 ile bağlanması, çoklu hedeflerin tek atışlık nano ölçekli görüntülenmesi de gösterilmiştir22. Görüntüleme kütle spektroskopisi4,9 ile karşılaştırıldığında, epr-SRS tahribatsızdır ve kendinden optik kesitleme yeteneğine sahiptir. Ayrıca, epr-SRS doku taramasında daha zaman verimlidir. Tipik olarak, 0,5 μm piksel boyutuna sahip0,25 mm2'lik bir doku bölgesinin tek bir epr-SRS kanalı için görüntülenmesi yalnızca birkaç dakika sürer. Örneğin, Şekil 4'teki dört SRS kanalı artı dört floresan kanalının toplam görüntüleme süresi yaklaşık 10 dakikadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan hayvan deney protokolüne (AC-AABD1552) uygun olarak yürütülmüştür.

1. Raman boyası konjuge antikorların hazırlanması

  1. Konjugasyon tamponunu PBS tamponunda ~0,1 M NaHCO 3 olarak hazırlayın, pH =8,3 , 4 °C'de saklayın.
  2. N-hidroksissüksinimidi (NHS) ester fonksiyonlu MARS probu (Ek Malzeme) çözeltisini susuz DMSO'da 3 mM olarak hazırlayın. MARS problarının sentezi önceki raporlara atıfta bulunabilir13,17,18.
    NOT: Depolama amacıyla, boya NHS ester çözeltisi ışıktan korunmalı ve -20 ° C'de tutulmalıdır.
  3. Antikor katıları konjugasyon tamponunda 2 mg/mL'lik bir konsantrasyonda çözün. Diğer tamponlarda çözünen antikorlar için, bunları santrifüj filtrelerle 1-2 mg / mL'lik bir konsantrasyona konjugasyon tamponuna değiştirin.
    NOT: Yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş sekonder antikorlar, türler arası reaktiviteyi en aza indirmek için multipleks boyama için tercih edilir. Kullanılan ikincil antikorlar Tablo 1 ve Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
  4. Konjugasyon reaksiyonunu gerçekleştirin.
    1. İkincil antikorlar için, karıştırarak yavaşça bir cam şişedeki antikor çözeltisine 15 kat molar boya çözeltisi fazlalığı ekleyin. Örneğin, 0.5 mL 2 mg / mL antikor çözeltisine, 35 μL 3 mM boya çözeltisi ekleyin.
    2. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında (RT) 1 saat karıştırarak inkübe edin. Reaksiyonu ışıktan koruyun.
  5. Arıtma.
    1. PBS tamponunda jel filtrasyon reçinesinin (Malzeme Tablosu) bulamacını, 1.5.2-1.5.4 adımlarını izleyerek hazırlayın.
    2. 50 mL'lik bir tüp içindeki 40 mL PBS tamponuna 10 mL jel filtrasyon reçine tozu ekleyin.
    3. Çözeltiyi 90 °C su banyosunda 1 saat bekletin.
    4. Süpernatantı boşaltın ve PBS'yi 40 mL'ye yeniden ekleyin. Bulamacı 4 °C'de saklayın.
    5. Boyut hariç tutma kolonunu (1 cm çap, yerçekimi akış sütunları) bulamaç çözeltisi ile 10-15 cm yüksekliğe kadar paketleyin.
    6. Reçineyi daha fazla paketlemek için kolonu ~ 10 mL PBS tamponu ile durulayın ve yıkayın.
    7. Pipet konjugasyon reaksiyonu karışımını (~ 0.5 mL) kolona dönüştürür. Tüm reaksiyon karışımı yüklendiğinde hemen elüsyon tamponu olarak 1 mL PBS tamponu ekleyin. Elüsyon arabelleğini (PBS) sütuna sürekli olarak yeniden doldurun.
    8. Kolondaki renge bakarak (MARS boyaları açık yeşilden maviye kadar renklere sahiptir) veya absorbansı 280 nm'de (A280) ölçerek eşlenik çözeltinin elüatını toplayın.
  6. Toplanan çözeltiyi santrifüj filtre ile 1-2 mg/mL'ye konsantre edin.
  7. Bir Nano plaka okuyucu ile konjugat çözeltinin ultraviyole görünür (UV-Vis) spektrumunu ölçerek konsantrasyonu ve ortalama etiketleme derecesini (DOL, boya-protein oranı) belirleyin.
    NOT: Ek Malzeme , hesaplama için MARS-boya NHS-esterlerinin özelliklerini sağlar. Sekonder antikor için normal DOL yaklaşık 3'tür.

2. Doku numunesi hazırlama

  1. Paraformaldehit fare beyin dokularını sabitledi.
    1. Fareleri (C57BL / 6J, Dişi, 25 d doğum sonrası) izofluran ile uyuşturun. Bir ayak parmağı sıkışma testi ile uygun anesteziyi değerlendirin.
    2. Servikal yer değiştirme ile fareleri öldürün. Fareleri transkardiyal olarak PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) ile hemen perfüze edin.
    3. 2.1.4-2.1.5 adımlarını izleyerek fare beynini toplayın
    4. Sagital sütür boyunca beyin sapından yukarı doğru kesin. Kafatasının iki yarısını yana doğru soyun ve beyni bir cımbızla çıkarın.
    5. Toplanan beyni PBS'de% 4 PFA'da 4 ° C'de 24 saat boyunca sabitleyin. Daha sonra, fazla PFA'yı gidermek için beyni PBS tamponunda 4 ° C'de 24 saat boyunca yıkayın.
    6. Katı agarozu, gevşek bir kapakla bir beherde% 7'lik (w / v) son konsantrasyona kadar suya yerleştirin. Çözeltiyi bir cam karıştırma çubuğu ile karıştırın. Bulamacı çözelti temizlenene kadar mikrodalgada ısıtın.
    7. Agarozun 45-55 ° C'ye soğumasını bekleyin.
    8. Sıvı agarozu küçük bir odaya dökün, ardından beyni PBS'den sıvı agaroza aktarın ve beyni gömmek için bir spatula ile yönlendirin. Doku-agaroz bloğunun sertleşmesini bekleyin.
    9. Doku agrosunu bir vibratom kullanarak 40-μm kalınlığında koronal dilimlere bölün.
    10. Aşağıdaki boyama için dokuyu 4 delikli bir plakaya aktarın. Agarozu bir cımbızla çıkarın. Dokuyu üç kez 1 mL PBS ile yıkayın.
  2. Dondurulmuş fare pankreas dokuları düzeltildi.
    1. Fare pankreasını PBS'de% 4 PFA'da 4 ° C'de 16-20 saat sallayarak sabitleyin.
    2. PFA'yı çıkarmak için numuneyi 1 mL PBS (4 °C) içinde üç kez yıkayın.
    3. Numuneyi (~0,3-0,5 cm boyutlarında) optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşik bloklarına gömün. Plastik bir kriyomold içine 2 damla OCT koyun. Dokuyu doğru yönde yerleştirin ve dokuların hiçbiri açıkta kalmayana kadar OCT'yi dokuların üzerine dökün.
    4. Pankreatayı 8-μm kalınlığında dilimlere ayırın ve bunları doku bağlayıcı bir cam slayt üzerine hareketsiz hale getirin, -80 ° C'de saklayın.
    5. Boyama işleminden önce, numuneyi RT'ye dengeleyin. OCT bloklarını çıkarmak için dokuyu PBS ile yıkayın.
  3. FFPE örnekleri.
    1. FFPE doku kaydırağını 60 °C'de 10 dakika pişirin.
    2. Deparafinizasyon ve rehidrasyon: Numuneleri RT'de 50 mL'lik bir tüpte, her seferinde hafif sallama ile 3 dakika boyunca aşağıdaki çözeltilere sırayla yerleştirin:
      iki kez ksilen,
      iki kez etanol,
      Deiyonize suda iki kez% 95 (hacim / hacim) etanol,
      Deiyonize suda iki kez %70 (hacim/hacim) etanol,
      Deiyonize suda bir defaya mahsus %50 (hacim/hacim) etanol,
      bir kez deiyonize su.
    3. Numuneyi bir cam kavanozda 100 °C'de 20 mM sodyum sitrata (pH 8.0) aktarın. Dokuların çözeltiye batırıldığından emin olun.
    4. Kavanozu 45 dakika boyunca 60 °C'lik bir su banyosuna koyun.
    5. Numuneyi RT'de 5 dakika boyunca deiyonize suyla yıkayın.

3. Doku immüno-eprSRS boyama

  1. Slayttaki doku bölümlerinin etrafına bir sınır çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın.
    NOT: Slayt boyama kavanozu, slayttaki dokunun inkübasyon adımlarını takip etmek için kullanılır. Yüzen dokular (40-μm kalınlığında fare beyin bölümleri) kuyu plakalarında boyanır.
  2. Dokuları 10 dakika boyunca% 0.3-0.5 PBST (PBS'de Triton X-100) ile inkübe edin.
  3. Dokuları bloke edici tamponla (PBS'de %5 eşek serumu, %0,5 Triton X-100) 30 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Birincil boyama solüsyonunu hazırlayın: Tüm birincil antikorları istenen konsantrasyonlarda 200-500 μL boyama tamponuna (PBS'de %2 eşek serumu, %0,5 Triton X-100) ekleyin. Birincil boyama solüsyonunu 5 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı sadece çökeltili formda kullanın.
  5. Birincil antikor çözeltisindeki dokuyu 1-2 gün boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Slayttaki doku kesitlerini boyamak için, nemi korumak için numuneyi ıslak mendille bir boyama kutusuna koyun.
  6. Slaytları RT'de her biri 5 dakika boyunca %0,3-0,5 PBST ile üç kez yıkayın. Yüzen dokular için 1 mL PBST kullanın. Slayttaki dokular için, slaytları bir slayt boyama kavanozunda yıkayın ve dokuların hepsinin çözeltiye daldırıldığından emin olun.
  7. Dokuyu 30 dakika boyunca 200-500 μL bloke edici tamponda inkübe edin.
  8. İkincil boyama çözeltisini hazırlayın: İstenilen konsantrasyonlarda (normalde 10 μg / mL) 200-500 μL boyama tamponuna tüm ikincil antikorları (ve gerekirse lektinleri) ekleyin. İkincil boyama solüsyonunu 5 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı sadece çökeltili formda kullanın.
  9. Dokuları 1-2 gün boyunca 4 ° C'de 200-500 μL sekonder antikor çözeltisinde inkübe edin.
  10. Slaytları RT'de her biri 5 dakika boyunca %0,3-0,5 PBST ile iki kez yıkayın.
  11. 30 dakika boyunca 200-500 μL DAPI çözeltisi ile inkübe edin.
  12. Slaytları RT'de PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  13. Yüzen doku bölümleri için, cam damlayan pipetle cam slaytlara aktarın. Dokuyu bir doku fırçası ile yayın ve gerekirse etrafı mendillerle temizleyin.
  14. Dokuyu bir cam kapak kayması ile bir damla antifade reaktifine monte edin ve oje ile sabitleyin.

4. SRS mikroskop montajı

NOT: Ticari bir konfokal floresan sistemi, tandem SRS-floresan görüntülemede kullanılır. Daha fazla açıklama önceki bir rapor17'de bulunabilir. Bu protokol, dar bant uyarımı kullanarak SRS görüntüleme tarafına odaklanacaktır.

  1. Sıcaklık kontrollü bir odada titreşimden yalıtılmış bir optik masa hazırlayın.
  2. Optik tablaya (Şekil 2A) senkronize bir çift lazer sistemi (pompa ve Stokes) bir chiller bağlı olarak yerleştirin.
    NOT: Çift lazer sistemindeki temel lazer, 6 ps darbe genişliği ve 80 MHz tekrarlama hızı ile 1064 nm'de bir çıkış darbe mekanizması sağlar. Stokes ışını temel lazerdendir. Stokes ışınının yoğunluğu, 8 MHz'de% 90'dan fazla modülasyon derinliğine sahip dahili bir elektro-optik genlik modülatörü (EOM) tarafından sinüzoidal olarak modüle edildi. Temel lazerin diğer kısmı, 5-6 ps darbe genişliğine sahip mod kilitli bir darbe treni üretmek için bir pikosaniye optik parametrik osilatörün (OPO) senkronize olarak tohumlanması için kullanılan 532 nm'ye frekans iki katına çıkarılır (OP'nin avara ışını interferometrik bir filtre ile bloke edilir). OPO'nun çıkış dalga boyu, pompa ışını olarak görev yapan 720-950 nm arasında ayarlanabilir.
  3. Aynaları (dalga boyu aralığı: 750-1100 nm), dikroik ışın ayırıcıları (DBS, 980 nm uzun geçirgen filtre, dikdörtgen) ve lensi (akromatik, 650-1050 nm için AR kaplama) kendi montajlarına monte edin. Aynalar ve dikroik kiriş ayırıcılar için çok stabilkinematik ayna bağlantıları kullanın.
  4. Lazer çıkışının yüksekliğini ve pompanın ve Stokes ışınlarının ışın boyutlarını ölçün. Işığın tüm optik elemanların merkezine çarpmasını sağlamak için aynaların ve lenslerin yüksekliğini ayarlayın.
  5. M1 aynasını optik masaya yerleştirin ve lazer çıkışına ~ 45 ° yapın (Şekil 2B). Uç ve eğim ayarlamaları yapmak için kinematik montaj aparatı üzerindeki düğmeleri kullanın. Işığın masanın uzunluğu boyunca aynı yükseklikte ve masaya göre düz bir çizgide hareket ettiğinden emin olun.
  6. Pompayı ve Stokes kirişlerini bölmek için dikroik ışın ayırıcıları (980 nm uzun geçirgen filtreleri) ve aynaları yerleştirin ve hizalayın (Şekil 2A-B).
  7. Mercek çiftlerini (L1, L2 ve L3, L4) ışınları bir araya getirmek ve ışın çaplarını hedefin arka göz bebeğiyle eşleşecek şekilde genişletmek için ışın yollarının her birine yerleştirin ve hizalayın (Şekil 2A-B).
  8. Kombine lazer ışınlarını mikroskopa hizalamak için M7 ve M8 aynalarını kullanın (Şekil 2C). Önce bir ışını mikroskopa hizalayın ve iki ışının uzamsal örtüşmesini sağlamak için diğer ışındaki ayna çiftlerini kullanın.
  9. Algılama bölümünü ayarlayın.
    1. Numunelerden geçtikten sonra ileri giden pompayı ve Stokes kirişlerini toplamak için kızılötesi kaplı bir yağ kondenserine (1.4-NA) takın (Şekil 2C).
    2. BNC konektörlü korumalı bir kutuya geniş alanlı bir Si fotodiyot takın (Şekil 2E). Doygunluk eşiğini ve tepki bant genişliğini artırmak için monte edilen fotodiyota 64 V DC güç kaynağı ekleyin.
    3. İleriye dönük ışığı 2 inçlik bir aynayla yansıtın. Modüle edici Stokes ışınını engellemek için optik filtreden sonra ışığı fotodiyot üzerine yeniden odaklayın (Şekil 2D).
    4. Fotodiyotun çıkış akımını, sinyal demodülasyonu için 50 ile sonlandırılan hızlı bir kilitleme amplifikatörüne gönderin. Kilitlenebilir amplifikatöre referans sinyali olarak 8 MHz'lik bir tetikleyici gönderin.
    5. Kilitli amplifikatörün faz içi X bileşenini mikroskopun analog arayüz kutusuna gönderin.
  10. Mikroskopta safD2O sıvısının SRS sinyalini ölçerek dahili motorlu gecikme aşaması ile zamansal örtüşmeyi optimize edin.

5. Görüntü toplama ve analizi

  1. Sıralı pompa dalga boyu ayarı ile çok kanallı epr-SRS görüntüleme gerçekleştirin.
    1. Lazer kontrol panelinde lazer gücünü Ppompası = 10-40 mW ve PStokes = 40-80 mW olarak ayarlayın.
    2. Piksel bekleme süresini 2-4 μs olarak ayarlayın ve mikroskopi yazılımında ortalama 10-20 kare olan birden fazla kare kullanın.
      NOT: Yüksek lazer gücünün (P pompası> 40 mW, P Stokes> 80 mW) ve küçük piksel boyutunun (<0,2 μm) kombinatoryal kullanımından kaçının, bu da muhtemelen çoklu foton uyarımı nedeniyle Raman boyalarının 'ağartma etkisine' neden olur.
    3. Kilitlenme amplifikatörünün zaman sabitlerini piksel bekleme süresinin yarısına ayarlayın.
  2. Doğrusal spektral karıştırma.
    NOT: epr-SRS, tüm konsantrasyon aralığı boyunca sıkı bir doğrusal sinyal-konsantrasyon bağımlılığı izler; Bu nedenle, doğrusal spektral karıştırma, kanallar arasındaki olası çapraz konuşmaları ortadan kaldırmak için etkilidir. N MARS probları ile N-kanallı epr-SRS ölçümü için, ölçülen sinyaller (S) S = MC olarak ifade edilebilir, burada C, MARS prob konsantrasyonlarıdır ve M, MARS problarının Raman kesitleri tarafından belirlenen bir N x N matrisidir.
    1. Farklı MARS probları ile etiketlenmiş tek renkli immüno-eprSRS numuneleri üzerinde matris M'yi ölçün.
    2. C = M−1· denklemini kullanın S, çok katlı numune sinyal ölçümü S ile MARS probunun konsantrasyon matrisini belirlemek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 3, sabit hücreler (Şekil 3A), paraformaldehit (PFA)-sabit fare dokuları (Şekil 3B) ve formalin sabit parafin gömülü (FFPE) insan örnekleri (Şekil 3C) dahil olmak üzere farklı örneklerdeki epr-SRS'nin örnek görüntülerini göstermektedir. SRS mikroskobunun uzamsal çözünürlüğü kırınım sınırlıdır, tipik yanal çözünürlük ~ 300 nm'dir ve eksenel çözünürlük, uyarma için yakın kızılötesi ışık kullanılarak ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, taze korunmuş fare dokuları, FFPE insan dokuları ve dondurulmuş fare dokuları dahil olmak üzere yaygın doku tiplerine geniş çapta uygulanabilir olan immüno-eprSRS protokolünü sunuyoruz. İmmüno-eprSRS, Tablo 1'de listelendiği gibi, hücrelerdeki ve dokulardaki epitoplardan oluşan bir panel için doğrulanmıştır. Bu tek atışlık platform, döngüsel stratejilerin iyi çalışmadığı uygulamalar için özellikle uygundur. Örneğin, döngüsel floresan kalın dokular için talep ediyor, çünkü 3D immünoetiketlemenin ç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruth A. Singer ve Richard K.P. Benninger'e fare pankreas dokuları sağladıkları için teşekkür ederiz. W.M., NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) ve ABD Ordusu'nun (W911NF-19-1-0214) desteğini kabul etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 16 Paraformaldehit, EM DereceliElektron Mikroskobu Bilimleri15710
&alfa;-tubulinAbcamab18251Primer antikorlar
&alfa;-tubulinBioLegend625902Primer antikorlar
β-III-tubulinBioLegend657402Primer antikorlar
β-III-tubulinAbcamab41489Birincil antikorlar
β-tubulinAbcamab131205Birincil antikorlar
Agaroz, düşük jelleşme sıcaklığıSigma AldrichA9414Beyin gömme için
Tavşanda üretilen anti-a-tubulin antikoru (&alfa;-tubulin)Abcamab52866Birincil antikorlar
Farede üretilen anti-Calbindin antikoru (Calbindin)Abcamab82812Birincil antikorlar
Anti-GABA B reseptörü R2  kobayda üretilen antikor (GABA B reseptörü R2)Millipore SigmaAB2255Birincil antikorlar
Keçide üretilen anti-GFAP antikoru (GFAP)Thermo ScientificPA5-18598Birincil antikorlar
Farede üretilen anti-Glukagon  antikor (Glukagon)Santa Cruz Biyoteknolojisc-514592Birincil antikorlar
Gine domuzunda üretilen anti-insülin antikoru (insülin)DAKOIR00261-2Birincil antikorlar
Sıçanlarda üretilen anti-MBP antikoru (MBP)Abcamab7349Birincil antikorlar Tavşanlarda
üretilen anti-NeuN antikoru (NeuN)Thermo ScientificPA5-78639Birincil antikorlar
Keçide üretilen Anti-Pankreatik polipeptit (PP) antikoru- Pankreatik polipeptit (PP)Sigma AldrichSAB2500747Primer antikorlar Tavşanda
üretilen anti-Pdx1 antikoru (Pdx1)Milipore06-1379Primer antikorlar
Sıçanlarda üretilen anti-Somatostatin antikoru (Somatostatin)Abcamab30788Primer antikorlar
Tavukta üretilen anti-Vimentin antikoru ( Vimentin)Abcamab24525Birincil antikorlar
Bant geçiren filtreKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm SonlandırıcıMini DevrelerSTRM-50
BNC kablosuThorlabs2249-CKoaksiyel Kablo, BNC Erkek / Erkek
Geniş bant dielektrik aynaThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
C57BL/6J farelerJackson Laboratuvarı000664
Santrifüj
KondansatörüOlympusyağa daldırma, 1.4 N.A.
Sitokeratin 18Abcamab7797Birincil antikorlar
Sitokeratin 18Abcamab24561Birincil antikorlar
DC güç kaynağıTopWard6302DÖnyargı voltajı 64 V
Dikroik montajThorlabsKM100CL1.3" (33 mm) Boyuna kadar Kinematik Montaj Uzun Dikdörtgen Optikler, Solak
Eşek Anti-Tavuk IgY (H + L)Jackson ImmunoResearch703-005-155MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Keçi IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch705-005-147MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Kobay IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch706-005-148MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Fare IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch715-005-151MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Tavşan IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch711-005-152MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Sıçan IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch712-005-153MARS konjugasyonu için ikincil antikorlar
Eşek anti-Koyun IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch713-005-147İkincil MARS konjugasyonu için antikorlar
DPBSFisher Scientific14-190-250
EpCAMAbcamab71916Birincil antikorlar
EtanolSigma Aldrich443611
Hızlı hızlı bak-in amplifikatörZürih AletleriHF2LIDC - 50 MHz
FFPE Böbrek ÖrneğiUSBiomaxHuFPT072
FibrillarinAbcamab5821Birincil antikorlar
GiantinAbcamab24586Birincil antikorlar
GlukagonSanta Cruz Biyoteknolojisc-514592Birincil antikorlar
H2BAbcamab1790Birincil antikorlar
HeLaATCCATCC CCL-2
Yüksek OD bant geçiren filtreChroma TeknolojiET890/220mStokes ışınını filtreleyin ve pompa ışınını iletin
Hidrofobik kalemFisher ScientificNC1384846
İnsülinThermoFisher701265Birincil antikorlar
Entegre SRS lazer sistemiUygulamalı Fizik & Elektronik A.Ş.picoEMERALDpicoEMERALD, Stokes ışını olarak görev yapan 6 ps darbe genişliği ve 80 MHz tekrarlama oranı ile 1.064 nm'de bir çıkış darbe treni sağlar. 532 nm'de frekans ikiye katlanmış ışın, beş ~ 6 ps darbe genişliğine sahip mod kilitli bir darbe dizisi üretmek için bir pikosaniye optik parametrik osilatörü (OPO) eşzamanlı olarak tohumlamak için kullanılır (OPO'nun avara ışını bir interferometrik filtre ile bloke edilir). OPO'nun çıkış dalga boyu 720&ndash arasında ayarlanabilir; Pompa ışını olarak görev yapan 950 nm. 1.064 nm Stokes ışınının yoğunluğu, %90'dan fazla modülasyon derinliği ile 8 MHz'de yerleşik bir EOM tarafından sinüzoidal olarak modüle edilir. Pompa ışını, picoEMERALD içinde dikroik bir ayna kullanılarak Stokes ışını ile uzamsal olarak üst üste bindirilir. Pompa ve Stokes darbe trenleri arasındaki zamansal örtüşme, yerleşik bir gecikme aşaması ile elde edilir ve mikroskopta saf D2O'nun SRS sinyali ile optimize edilir.
Ters lazer tarama mikroskobuOlympusFV1200MPE
Kinematik ayna montajıThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Düşük Profilli Altıgen Ayarlayıcı
Triticum vulgaris'ten (buğday) lektinSigma AldrichL0636-5 mg
Uzun geçişli dikroik ışın ayırıcıSemrockDi02-R980-25x36980 nm lazer BrightLine  tek kenarlı lazer düz dikroik ışın ayırıcı
MAP2BioLegend801810Birincil antikorlar
Mikroskopi görüntüleme yazılımıOlympusFluoView
NanoQuant PlakaTecanBir plaka okuyucuda absorbans tabanlı, küçük hacimli analizler için.
Normal eşek serumuJackson ImmunoResearch017-000-121
NucBlue Sabit Hücreli ReadyProbes Reaktif (DAPI)Thermo ScientificR37606
Nunc 4 Kuyulu YemeklerFisher Scientific12-566-300
Objektif lensOlympusXLPlan Nx25, 1.05-NA, MP, çalışma mesafesi =  2&incelt; mm
Boya fırçası
Periskop düzeneğiThorlabsRS99, üst ve alt üniteleri içerir, & Oslash; 1 "direk ve sıkıştırma çatalı.
pH metre
Plaka okuyucuTecanInfinite 200 PROKullanımı kolay, çok modlu bir plaka okuyucu. 230 ° C'lik bir spektral aralıkta absorbans ölçüm yetenekleri; 1000 deniz mili.
ProLong Gold antifade reaktifiThermo ScientificP36930
PSD95Invitrogen51-6900Birincil antikorlar
Sephadex G-25 OrtaGE Yaşam Bilimleri17-0033-01jel filtrasyon reçinesi tuzdan arındırma ve tampon değişimi için
BNC konektörlü korumalı kutuPomona Electronics2902kapaklı alüminyum kutu, BNC dişi/dişi
Si fotodiyotThorlabsFDS1010350– 1100 nm, 10 mm x 10 mm Aktif Alan
Synapsin 2ThermoFisherOSS00073GPrimer antikorlar
Doku Yolu Superfrost Plus Altın SlaytlarFisher Scientific22-035813Taze veya formalinle sabitlenmiş doku bölümlerini slayt yüzeyine sıkıca çekmek ve kimyasal olarak bağlamak için yapışkan slayt (tiisue bağlayıcı cam slaytlar)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
VibratomLeicaVT1000
VimentinAbcamab8069Birincil antikorlar
KsilenlerSigma Aldrich214736

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  2. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155(2020).
  3. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  4. Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
  5. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
  6. Lin, J. -R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657(2018).
  7. Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
  8. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  9. Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851(2019).
  10. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982(2013).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455(2020).
  13. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544, 465(2017).
  14. Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
  15. Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
  16. Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
  17. Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
  18. Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518(2021).
  19. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003(2019).
  20. Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115(2022).
  21. Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
  22. Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
  23. Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537(2018).
  24. Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
  25. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  26. Coherent Raman Scattering Microscope. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Stimulated Raman ScatteringProtein Marker ImagingImmunofluorescence AlternativeTissue ClearingSubcellular ResolutionAntibody ConjugationSize Exclusion ChromatographyBrain Tissue Imaging

İlgili makaleler