Memeli hücrelerinde belirli bir substratın ubikitilasyon testi ve bir E3 ubikitin-ligazının ubikitilasyon testi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. HEK293T hücre hatları protein aşırı ekspresyonu için kullanıldı, poliubikitillenmiş substrat immünopresipitasyon ile hücre lizatlarından arındırıldı ve SDS-PAGE'de çözüldü. Bu post-translasyonel modifikasyonu görselleştirmek için immünoblotlama kullanıldı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Ubikitilasyon, ökaryotik hücrelerde meydana gelen ve hücre sağkalımı, proliferasyonu ve farklılaşması dahil olmak üzere çeşitli biyolojik yolakların düzenlenmesi için kritik olan translasyonel bir modifikasyondur. E1 (Ubikitin aktivasyon enzimi), E2 (Ubikitin-konjuge enzim) ve E3'ten (Ubikitin-ligaz enzimi) oluşan en az üç farklı enzimin kaskad reaksiyonu yoluyla ubikitinin substrata kovalent bir şekilde bağlanmasından oluşan geri dönüşümlü bir işlemdir. E3 kompleksi substrat tanıma ve ubikitilasyonda önemli bir rol oynar. Burada, seçilen substratı, bir E3 ubikitin ligazını ve etiketli bir ubikitini kodlayan bir plazmidin geçici ko-transfeksiyonunu kullanarak memeli hücrelerinde substrat ubikitilasyonunu değerlendirmek için bir protokol tanımlanmıştır. Lizisten önce, transfekte hücreler, substrat proteazomal bozulmasını önlemek için proteazom inhibitörü MG132 (karbobenzoksi-lö-lö-lösinal) ile muamele edilir. Ayrıca, hücre ekstresi, ubikitin etiketi için spesifik antikorlar kullanılarak batı lekelenmesi (WB) ile daha sonra tespit edilmek üzere poliubikitillenmiş substratı saflaştırmak için küçük ölçekli immünopresipitasyona (IP) gönderilir. Bu nedenle, memeli hücrelerinde ubikitilasyon testi için tutarlı ve karmaşık olmayan bir protokol, bilim adamlarına spesifik substratların ve E3 ubikitin ligazlarının ubikitilasyonunu ele almada yardımcı olmak için tanımlanmıştır.
Giriş
Post-translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler), hücre homeostazı için gerekli olan protein regülasyonu ile ilgili önemli bir mekanizmadır. Protein ubikitilasyonu, ökaryotik organizmalarda çeşitli hücresel sonuçlarla sonuçlanan farklı sinyallerin bir çeşitliliğini yaratan dinamik ve karmaşık bir modifikasyondur. Ubikitilasyon, 76 amino asit içeren bir ubikitin proteininin substrata bağlanmasından oluşan, üç farklı reaksiyondan oluşan enzimatik bir kaskadda meydana gelen geri dönüşümlü bir süreçtir1. İlk adım, ubikitin C-terminus ile E1 enziminin aktif bölgesinde bulunan sistein kalıntısı arasında yüksek enerjili bir tiyoestere bağlı ubikitin oluşt....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Memeli hücrelerinde ubikitilasyon tahlil protokolüne genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1. Ubiquitilasyon testi prosedürüne genel bakış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. Hücre kültürü
- HEK293T....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
UXT (her yerde ifade edilen transkript), kalp, beyin, iskelet kası, plasenta, pankreas, böbrek ve karaciğer gibi fare ve insan dokularında her yerde eksprese edilen protein katlama komplekslerini oluşturan prefoldin benzeri bir proteindir18. UXT-V1 ve UXT-V2 olarak adlandırılan iki ekleme izoformu, farklı fonksiyonlar ve hücre altı konumlar gerçekleştirerek tanımlanmıştır. UXT-V1 ağırlıklı olarak sitoplazmada ve mitokondri içinde lokalize olur ve TNF-α indüklenen apoptoz ve antiviral sinyalozom ol.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Ubikitilasyon, birkaç proteinin seviyelerini düzenleyen ve birçok sinyal yolunda ve biyolojik süreçte önemli bir rol oynayan ve sağlıklı bir hücre içi ortam sağlayan önemli bir post-translasyonel modifikasyondur. Ubikitin-proteazom sistemi (UPS), tümör baskılayıcılarını stabilize etme veya onkojenik ürünlerin bozulmasını indükleme imkanı sağlayan son farmasötik araştırmaların ana odaklarından biridir22. Örneğin, multipl miyelomda (MM) monoklonal immünoglobulin sekresyonundan sorumlu plazma hücre n.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
F.R.T, FAPESP hibe numarası 2020/15771-6 ve CNPq Universal 405836/2018-0 tarafından desteklenmektedir. P.M.S.P ve V.S, CAPES tarafından desteklenmektedir. C.R.S.T.B.C, 2019/23466-1 sayılı FAPESP burs numarası ile desteklenmiştir. Sandra R. C. Maruyama'ya (FAPESP 2016/20258-0) maddi destek için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL mikrotüp | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC ile muamele edilmiş kültür kabı | Corning | 430167 | |
| 15 mL tüp | Corning | 430766 | |
| 96 oyuklu plaka | Cralplast | 655111 | |
| Agaroz-anti-HA boncukları | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Fare antikoru | Seracare | 5220-0341 | Keçi anti-Fare IgG |
| Anti Tavşan antikoru | Seracare | 5220-0337 | Keçi anti-Tavşan IgG |
| Anti-Aktin antikoru | Sigma-Aldrich | A3853 | Kullanılan seyreltme: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antikoru | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Kullanılan seyreltme: 1:1000 |
| Anti-HA antikoru | Sigma-Aldrich | H3663 | Kullanılan seyreltme: 1:1000 |
| Anti-Myc antikor | Hücre Sinyali | 2272 | Kullanılan seyreltme: 1:1000 |
| Bradford reaktifi | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Sığır Serumu Albümin |
| Hücre inkübatörü | Nuaire | NU-4850 | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5804R | 500 x g 5 dakika |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Dijital pH metre | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta Corning | 10-017-CRV | Yüksek glikozlu | |
| Fetal sığır serumu | Gibco | F4135 | Filtrat önceki kullanım |
| HA peptid | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T hücreleri | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Yaşam Bilimleri | 0365-500G | |
| Kline döndürücü | Küresel Ticaret Teknolojisi | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Mikrosantrifüj | Eppendorf | 5418R | |
| Na3< / sub>VO 4< / sub> (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitroselüloz lekeleme membranı | GE Sağlık | ||
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optik mikroskop | OPTIKA mikroskopları | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | Memeli ekspresyonu için |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Dr. Marcelo Damá tarafından bağışlanmıştır; | Tag 2xFlag (N-terminali). Restriksiyon enzimleri: EcoRI ve XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-Δ F kutusu | Dr. Marcelo Damá tarafından bağışlanmıştır; | Tag 2xFlag (N-terminali). Restriksiyon enzimleri: EcoRI ve XhoI. Δ 335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Dr. Marcelo Damá tarafından bağışlanmıştır; | Tag HA (C-terminali). Restriksiyon enzimleri: EcoRI ve XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Dr. Marcelo Damá tarafından bağışlanmıştır; | Tag 6x-His-Myc (N-terminali). Restriksiyon enzimleri: EcoRI ve KpnI | |
| Pen Strep Glutamin 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Fosfat tamponlu salin 10x | AccuGENE | 51226 | 1x PBS elde etmek için 10x PBS'yi ultra saf suya seyreltin |
| Polietilamin (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Proteaz inhibitörü kokteyli SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Sallanan Çalkalayıcı | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE sistemi | BioRad | 165-8004 | |
| Çözelti Homojenizatör | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma tabanı | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Tripsinüs (Triple Ekspres) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reaktifi | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-2048 |
Kaynaklar
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).
- Koegl, M., et al. <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
