Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Post-translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler), hücre homeostazı için gerekli olan protein regülasyonu ile ilgili önemli bir mekanizmadır. Protein ubikitilasyonu, ökaryotik organizmalarda çeşitli hücresel sonuçlarla sonuçlanan farklı sinyallerin bir çeşitliliğini yaratan dinamik ve karmaşık bir modifikasyondur. Ubikitilasyon, 76 amino asit içeren bir ubikitin proteininin substrata bağlanmasından oluşan, üç farklı reaksiyondan oluşan enzimatik bir kaskadda meydana gelen geri dönüşümlü bir süreçtir¹. İlk adım, ubikitin C-terminus ile E1 enziminin aktif bölgesinde bulunan sistein kalıntısı arasında yüksek enerjili bir tiyoestere bağlı ubikitin oluşturmak için bir ATP hidrolizine bağlı ubikitin aktivasyonu ile karakterizedir. Daha sonra, ubikitin, ubikitin ile tiyoester benzeri bir kompleks oluşturan E2 enzimine aktarılır. Daha sonra, ubikitin, substrat ^2,3'ü tanıyan ve etkileşime giren E2 veya daha sık olarak, E3 enzimi tarafından kovalent olarak substrata^bağlanır. Bazen, multiubikitin zincir düzeneğini teşvik etmek için E4 enzimleri (Ubikitin zinciri uzama faktörleri)^{gereklidir 3}.

Ubikitin yedi lizin kalıntısına sahiptir (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ve K63), birkaç efektör protein tarafından tanınacak farklı üç boyutlu yapılar üretmek için farklı bağlantılar üreten poliubikitin zincirlerinin oluşumuna izin verir ^4,5. Bu nedenle, substratta tanıtılan poliubikitin zincirinin türü,^{hücre kaderine 6,7,8} karar vermek için gereklidir. Dahası, substrat, N-degrons adı verilen N-terminal kalıntıları yoluyla da ubikitine edilebilir. Spesifik E3 ubikitin-ligazları, N-degron tanımadan sorumludur ve yakındaki lizin kalıntısı^9'un poliubikitilasyonuna izin verir.

Günümüzde, karakterize edilen 40'tan fazla farklı SCF'ye özgü substrat vardır. Bunlar arasında, hücre farklılaşması ve gelişiminin yanı sıra hücre sağkalımı ve ölümü de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik yolakların anahtar düzenleyicileri^{bulunabilir 10,11,12,13}. Bu nedenle, her bir E3 ubikitin-ligazın spesifik substratlarının tanımlanması, çeşitli biyolojik olayların kapsamlı bir haritasını tasarlamak için gereklidir. Gerçek substratların tanımlanması biyokimyasal olarak zor olsa da, biyokimya tabanlı yöntemlerin kullanımı, zincir özgüllüğünü ve mono- ve poliubikitilasyon arasındaki ayrımı değerlendirmek için çok uygundur¹⁴. Bu çalışma, E3 ubikitin-ligaz kompleksi SCF (Fbxo7) ile substrat UXT-V2'yi (Her yerde eksprese edilen prefoldin benzeri şaperon izoform 2) aşırı eksprese eden memeli hücre hattı HEK293T kullanılarak ubikitilasyon testi için tam bir protokolü açıklamaktadır. UXT-V2, NF-κB sinyallemesi için önemli bir ko-faktördür ve bu protein hücrelerde parçalandıktan sonra, TNF-α indüklenen NF-κB aktivasyonunu inhibe eder¹¹. Bu nedenle, poliubikitillenmiş UXT-V2'yi tespit etmek için, proteazom inhibitörü MG132, proteazom kompleksi^15'in 26S alt biriminin proteolitik aktivitesini bloke etme yeteneğine sahip olduğu için kullanılır. Ayrıca, hücre ekstresi, substratı saflaştırmak için küçük ölçekli bir IP'ye gönderilir ve seçilen antikorlar kullanılarak WB tarafından daha sonra tespit edilmek üzere agaroz reçinesine hareketsiz hale getirilmiş spesifik bir antikor kullanılır. Bu protokol, hücresel ortamda substrat ubikitilasyonunu doğrulamak için çok yararlıdır ve ayrıca farklı memeli hücreleri ve diğer E3 ubikitin-ligaz kompleksleri için uyarlanabilir. Bununla birlikte, in vitro ubikitilasyon testi ile test edilen substratın doğrulanması da gereklidir, çünkü her iki protokol de gerçek substratların tanımlanması konusunda birbirini tamamlar.

NOT: Memeli hücrelerinde ubikitilasyon tahlil protokolüne genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1. Ubiquitilasyon testi prosedürüne genel bakış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Hücre kültürü

1. HEK293T hücre hattını 100 mm TC ile muamele edilmiş bir kültür kabında büyüme ortamında% 80-90 oranında birleşime (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) yüksek glikozu,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin (100 ünite), streptomisin (100 μg) ve L-glutamin (0.292 mg / mL) ile desteklenmiştir) ile güçlendirin. Kültürü nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de% 5 CO_{2'de inkübe edin}.
2. Hücreleri geçmek için, serolojik bir pipet kullanarak medyayı kültür kabından aspire edin. Hücreleri bir kez 1 mL sterilize edilmiş 1x fosfat tamponlu salin (PBS 1x) ile yıkayın.
3. 1 mL tripsin / EDTA (etilendiamintetraasetik asit) çözeltisi ekleyerek hücreleri ayırın. Çanağı 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 2 mL büyüme ortamında serolojik bir pipet kullanarak hücreleri yeniden askıya alın.
4. Hücre süspansiyonunu taze ve temiz bir 15 mL tüpe aktarın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice dökerek çıkarın. Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre peletini yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini 3 mL büyüme ortamında nazikçe yeniden askıya alın.
5. Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini, 9 mL büyüme ortamı içeren 100 mm TC ile işlenmiş bir kültür kabına aktarın.
   NOT: Hücreler iyi durumdaysa, birleşmenin% 80 -% 90 olduğu HEK293T'nin her kültür kabı, geçişten 2 gün sonra% 80 birleşimli üç kültür kabı üretebilir.

2. Hücre transfeksiyonu

UXT (her yerde ifade edilen transkript), kalp, beyin, iskelet kası, plasenta, pankreas, böbrek ve karaciğer gibi fare ve insan dokularında her yerde eksprese edilen protein katlama komplekslerini oluşturan prefoldin benzeri bir proteindir18. UXT-V1 ve UXT-V2 olarak adlandırılan iki ekleme izoformu, farklı fonksiyonlar ve hücre altı konumlar gerçekleştirerek tanımlanmıştır. UXT-V1 ağırlıklı olarak sitoplazmada ve mitokondri içinde lokalize olur ve TNF-α indüklenen apoptoz ve antiviral sinyalozom oluşumu19,20 ile ilişkilidir. Çoğu araştırma, esas olarak çekirdekte lokalize olan ve hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde, farklılaşmasında ve enflamatuar yollarda yer alan çoklu transkripsiyonel faktörler için bir ko-faktör olarak işlev gören UXT-V2'ye odaklanmıştır. UXT-V2, NF-κB enhantozom21'de temel bir koaktivatör olarak çalışan NF-κB sinyal yolunda yer almaktadır. UXT-V2'nin E3 ubikitin-ligaz SCF'nin (Fbxo7) kanonik bir substratı olduğu, proteazom tarafından poliubikitilasyonuna ve bozulmasına aracılık ettiği ve sonuç olarak NF-κB sinyal yolu11'i inhibe ettiği gösterilmiştir.

Hücrelerde Fbxo7'nin aracılık ettiği UXT-V2-HA'nın spesifik poliubikitilasyonu, anti-HA IP'den elüatın substrata konjuge edilmiş myc-ub'u tespit eden bir anti-myc antikoru ile araştırılmasından sonra gözlendi (Şekil 2). Poliubikitile substrat için anti-myc'nin özgüllüğü, şerit 1 ve 2'de görselleştirildi (Şekil 2), burada UXT-V2-HA plazmidinin yokluğunda hücreler Fbxo7 ve myc-ub ile birlikte transfekte edildiğinde poliubikitillenmiş proteinlerin yayılması tespit edilmedi (Şekil 2, şerit 1). Ek olarak, myc-ub plazmidi olmadan Fbxo7 ve UXT-V2-HA kombinasyonunda protein poliubikitinasyonuna karşılık gelen hiçbir yayma görselleştirilmedi (Şekil 2, şerit 2). UXT-V2 poliubikitilasyonuna Fbxo7 aracılık ettiğini kanıtlamak için, SKP1 ile etkileşimden sorumlu olan F-box etki alanının yokluğu nedeniyle aktif SCF kompleksini bir araya getiremeyen boş bir vektör pcDNA3, vahşi tip Fbxo7 veya Fbxo7-ΔF-box mutant, UXT-V2-HA ve myc-ub ile kombinasyon halinde transfekte edildi. Poliubikitillenmiş UXT-V2'nin güçlü bir yayma sinyali sadece vahşi tip Fbxo7 varlığında gözlenmiştir (Şekil 2, şerit 4), bu da UXT-V2'nin kontrollere kıyasla hücrelerde SCF (Fbxo7) kompleksi tarafından poliubikitillendiğini düşündürmektedir (Şekil 2, şerit 3 ve 5). Bu negatif kontrollerin varlığında poliubikitillenmiş UXT-V2'nin hafif bir yayma sinyalinin varlığı, endojen Fbxo7 veya diğer E3 ubikitin-ligaz aktivitesinin etkisini gösterebilir.

Şekil 2. Hücrelerde ubikitilasyon testi: HEK293T hücrelerinin belirtilen plazmidlerle geçici transfeksiyonu. Hücre lizisinden sonra, hücre ekstraktları (girdiler) agaroz-anti-HA boncukları ile immünopreprestite edildi. Salınan ve giriş örnekleri SDS-PAGE ile çözüldü ve batı lekesi spesifik antikorlarla incelendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.