Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. Rejenere veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Civciv embriyonik kornea yaraları tamamen ve hızlı bir şekilde yenilenmek için dikkate değer bir kapasite gösterirken, yetişkin yaralı kornealar fibrotik skarlaşma nedeniyle şeffaflık kaybı yaşarlar. Yaralı embriyonik korneaların doku bütünlüğü, saptanabilir bir skar oluşumu olmadan içsel olarak restore edilir. Erişilebilirliği ve manipülasyon kolaylığı göz önüne alındığında, civciv embriyosu, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir modeldir. Bu protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. İlk olarak, yumurtalar göze erişmek için erken embriyonik yaşlarda pencerelenir. İkincisi, korneanın üç hücresel tabakasının oluştuğu zamana karşılık gelen, gelişimin sonraki aşamalarında göze erişimin korunmasını sağlamak için ekstraembriyonik membranlara bir dizi in ovo fiziksel manipülasyonu gerçekleştirilir. Üçüncüsü, dış epitel tabakasına ve anterior stromaya nüfuz eden lineer kornea yaraları mikrocerrahi bıçak kullanılarak yapılır. Rejenerasyon süreci veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir. Bu modeli kullanarak bugüne kadar yapılan çalışmalar, yaralı embriyonik korneaların keratosit farklılaşmasının aktivasyonunu gösterdiğini, ECM proteinlerinin doğal üç boyutlu makroyapılarına koordineli bir şekilde yeniden şekillendiğini ve kornea duyu sinirleri tarafından yeterince yeniden innerve edildiğini ortaya koymuştur. Gelecekte, endojen veya eksojen faktörlerin rejeneratif süreç üzerindeki potansiyel etkisi, doku aşılama, elektroporasyon, retroviral enfeksiyon veya boncuk implantasyonu gibi gelişimsel biyoloji teknikleri kullanılarak iyileşen kornealarda analiz edilebilir. Mevcut strateji, embriyonik civcivleri, skarsız kornea yara iyileşmesini koordine eden moleküler ve hücresel faktörleri aydınlatmak için çok önemli bir deneysel paradigma olarak tanımlamaktadır.
Giriş
Kornea, görme keskinliğine elverişli ışığı ileten ve kıran gözün şeffaf, en dıştaki dokusudur. Yetişkin korneada, kornea stromasına verilen hasar veya enfeksiyon, keratosit proliferasyonu, fibroz, sitokin kaynaklı apoptozise yol açan inflamasyon artışı, onarım miyofibroblastlarının oluşumu ve hücre dışı matriksin (ECM) genel olarak yeniden şekillenmesi ile karakterize hızlı ve sağlam bir yara iyileşme yanıtına yol açar1,2 . Yaralanmayı takiben, bu tür kornea dokusu onarımı, kornea saydamlığını azaltan ve ışığın geçişini engelleyen, böylece görüşü bozan ve en ciddi vakalarda kornea körlüğüne yol açan opak skar ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolde kullanılan yumurta suşu Beyaz Leghorn idi ve tüm hayvan prosedürleri Illinois Wesleyan Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Civciv yumurtalarının kuluçkalanması
- Yumurtaları, gelişimi durdurmak için serildikten sonra 1 haftaya kadar ~ 10 ° C'de tutun. Civciv embriyosu gelişimini başlatmaya hazır olduğunuzda, kir ve kalıntıları temizlemek için tüm yumurta kabuğunu oda sıcaklığında suya doyurulmuş tüy bırakmayan mendillerle ( Malzeme Tablosuna bakınız) silin.
- Yumurta kabuğunun sterilize edildiğinden emin olun. Tüm yumurta yüz....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Gelişmekte olan embriyonun kraniyal bölgesini ortaya çıkarmak için E5.5'te ACM ve TAT'ın daha önce diseksiyonunu takiben, ovo'da E7 merkezi korneasını kapsayan bir dizi yırtılma yapıldı (Şekil 1). Kornea rejenerasyonunu incelemek için ideal bir yara, her biri korneanın aynı yerinde yapılan üç yırtılmayı takiben ortaya çıkar. İlk yırtılma kornea epitelini geçerken, ikinci ve üçüncü yırtıklar sırasıyla altta yatan bazal membrana ve anterior stromaya nüfuz eder. İdeal bir yara elde etm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Civciv, fetal, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir model sistemdir. Memelilerin aksine, civciv, ovo 8 veya ex ovo stratejileri24 kullanılarak gelişim boyunca kolayca erişilebilir. Embriyonik civciv korneası, kemirgen kornealarından çok daha büyüktür, kafatası hacminin yaklaşık% 50'si göze25'e adanmıştır ve bu da onu yaralama gibi fiziksel manipülasyonlara oldukça uygun hale getirir. Dahası, tavuk yumurtası yıl boy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların bu makalede sunulan bilgilerle ilgili olarak rakip finansal çıkarları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Illinois Wesleyan Üniversitesi aracılığıyla TS'ye verilen bir Sanatsal ve Bilimsel Gelişim hibesi ile desteklenmiş ve kısmen NIH-R01EY022158 (PL) tarafından finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 18 G hipodermik iğne | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 derece açılı mikrodiseksiyon bıçağı | Güzel Bilim Araçları | 10056-12 | |
| 4 & prime ;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Moleküler Problar | D1306 | |
| 5 mL şırınga | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor etiketli ikincil antikorlar | Moleküler Problar | ||
| Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2< / sub>-H 2< / sub>0) | Sigma | C8106 | |
| Tavuk yumurtası tepsileri | GQF | O246 | |
| Diseksiyon Forseps, İnce Uç, Tırtıklı | VWR | 82027-408 | |
| Diseksiyon makası, keskin uç | VWR | 82027-578 | |
| İris 1 x 2 Diş Dokusu Forseps, Tam Kavisli | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Mikrodiseksiyon Makası | VWR | 470315-228 | |
| Fare anti-fibronektin (IgG1) | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | B3/D6 | |
| Fare anti-laminin (IgG1) | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | 3H11 | |
| Fare antinöronuna özgü β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Fare anti-tenasin (IgG1) | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası | M1-B4 | |
| Paraformaldehit | Sigma | 158127 | |
| Penisilin / Streptomisin | Sigma | P4333 | |
| Potasyum klorür (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodyum klorür (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 yumurta kuluçka makinesi | GQF | 1502 | |
| Elle yırtma ambalajı (1,88 inç genişlik) | Scotch | n/a |
Kaynaklar
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
