Bu protokol, Fudan Üniversitesi Zhongshan Hastanesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden etik onay almıştır ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun tavsiyelerini takip eder (No. 85-23, 2011'de revize edilmiştir; Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD, ABD).
NOT: Hayvan deneyleri, >10 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu protokoldeki cerrah, farede AR operasyonunu gerçekleştirmeden önce murin ekokardiyografisinin manipülasyonunda usta olmalıdır. Bununla birlikte, çoğu araştırma kurumunda, küçük kemirgen ekokardiyografisi çekirdek bir tesis tarafından çalıştırılır, bu nedenle cerrah, ekokardiyografide deneyimli bir cerrah olmasa da, çekirdek uzmanlarla yakın işbirliği yapabilir. Farede invaziv hemodinamik ölçüm deneyimi bir artıdır.
1. Ultrason görüntüleme (zorunlu) ve invaziv hemodinamik ölçüm (isteğe bağlı) için hazırlık
- 30 MHz'lik bir proba bağlı ultrason makinesini başlatın. Sıcaklık kontrollü ultrason hayvan platformunu, farenin sağ tarafının yukarı eğildiği aort kemeri görünümü konumuna ayarlayın.
NOT: Ultrason hayvan platformunun kafatası ucunun cerraha doğru yerleştirilmesi önerilir. Bununla birlikte, kraniyal ucun mu yoksa kaudal ucun mu cerraha doğru olduğu, cerrahın hangisiyle daha rahat hissettiğine bağlı olmalıdır.
- Veri toplama cihazına ve analog/dijital dönüştürücüye bir mikromanometre (basınç kateteri) bağlayın. Tuzlu su kalibrasyonu için mikromanometrenin kalibrasyon küvetini tuzlu suya daldırın.
NOT: Durum izin veriyorsa, basınç-hacim kateteri de kullanılabilir. Laboratuvardaki basınç veri toplama cihazı sadece basınçla ilgili verileri topladığı ve hacimle ilgili verileri toplama kapasitesine sahip olmadığı için bir basınç kateteri kullanıyoruz, ancak mevcut çalışmadaki ekokardiyografik sonuçlar LV hacimlerini de tanımlayabiliyor.
2. Farelerin anestezisi, cerrahi cihazların hazırlanması ve RCCA'nın izolasyonu
NOT: Cerrahi aletler kullanımdan önce sterilize edilmeli ve otoklavlanmalıdır. Tüm adımların aseptik koşullar altında gerçekleştirilmesi önerilir. Görüntüleme işlemi sırasında zaman kazanmak, farelerde olası istenmeyen stres tepkilerini en aza indirmek, göğüs ve ekstremiteleri temiz ve kuru tutmak için epilasyonun 1 gün önceden yapılması da önerilir.
- Fareyi, 0,8 L/dk oksijen ile karıştırılmış %4 izoflurana ayarlanmış bir buharlaştırıcıya bağlı olan indüksiyon odasında uyuşturun. Fare uykuya daldığındanda veya kuyruk sıkışma refleksi kaybolduğunda, hayvanı indüksiyon odasından çıkarın.
- Hayvanı, bir ısıtma yastığı ile ısıtılan bakır bir plaka üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Burnu, sabit bir anestezi seviyesini korumak için 0,8 L / dak oksijen ile karıştırılmış% 1,5 izofluranın verildiği bir burun konisine bağlayın.
NOT: Temizlenmesi uygun olduğu ve paslanmaya karşı dayanıklı olduğu için bakır bir plaka önerilir, ancak başka bir metal plaka türü ile değiştirilebilir.
- Anestezi altında kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün ve ekstremiteleri bakır plakaya bantlayın. Tüy dökücü krem kullanarak boyun ve göğüsteki tüyleri alın ve tüylerin alındığı bölgeyi %75 etanol ile temizleyin.
- Çeşitli forseps ve makaslar dahil olmak üzere gerekli cerrahi aletleri hazırlayın (Şekil 2A; bkz. Malzeme Tablosu).
- Alt çene ile sternum arasında, kavisli başparmak forseps ve düz makasla boyunda yaklaşık 1 cm uzunluğunda uzunlamasına medyan bir kesi yapın.
- İki çift forseps kullanarak tiroid bezinin sol ve sağ kısmını künt bir şekilde inceleyin. Kavisli ince başparmak forsepsleri ile, RCCA'yı mümkün olduğu kadar uzun süre açığa çıkarmak için sağ paratrakeal bölgedeki stemohyoideus kasını ve yağ dokusunu ayırın. Vagal sinirin yaralanmasından her zaman kaçının, çünkü bu hipotansiyon, bradikardi ve ölüme neden olabilir (Şekil 2B).
3. Ultrason rehberliğinde RCCA ve asendan aort yoluyla kateterizasyon
- Kabın altından her biri yaklaşık 5 cm olan iki adet 6-0 ipek iplik geçirin. Distal RCCA'yı bir iplik kullanarak sıkı bir düğümle bağlayın ve RCCA üzerindeki hafif gerilimi korumak için sıkı düğümün iki ucunu hayvanın başının yanına sabitleyin. Bu eylem, sonraki adımlarda kateterizasyonu kolaylaştıracaktır.
- İkinci ipliği kullanarak proksimal RCCA'ya gevşek bir düğüm yerleştirin. Bu, RCCA'nın sızdırmaz bölgesini kanla doldurur ve kesilmesini kolaylaştırır.
- RCCA'yı açmak için sıkı düğümün 1-2 mm proksimalinde kama şeklinde bir açıklık kesmek için küçük bir tutam makas kullanın. Kesi boyutunun ne bir kateter yerleştirmek için çok küçük ne de yerleştirme sırasında kopması için çok büyük olduğundan emin olun.
NOT: Mikroskop altında kesi yapılması şiddetle tavsiye edilir. 26 G iğne ile damarda küçük bir delik açmak alternatif bir yöntemdir.
- Metal bir tel içeren plastik bir kateter hazırlayın (Şekil 2C). Kesiği uzun elle kavisli bağlama forsepsleriyle gerin, metal teli içeren plastik kateteri RCCA'ya yerleştirin ve gevşek düğüme doğru ilerleyin.
- Kateteri ilerletmek için gevşek düğümü gevşetin ve yaklaşık 2 cm tel çekin. Hayvanı içeren bakır plakayı ultrason hayvan platformuna aktarın, fare boynuna ve göğsüne ultrason jeli uygulayın ve ardından kateteri ve teli ultrason rehberliğinde RCCA ve yükselen aorttan dikkatlice iletin.
4. Ultrason rehberliğinde aort kapaklarının delinmesi
- Plastik kateter ve metal tel aort deliğine ulaşmadan önce renkli Doppler modunda ve nabız dalgası Doppler modunda bazal ultrason verilerini toplayın.
- Ultrasonografi ile çıkan aort, LV çıkış yolu, kateter ve tel aynı anda ve net bir şekilde gösterildiğinde, kateter ve tel aort deliğine ulaştığında, telin ucunu kateterden dışarı çıkarır ve aort kapaklarını delinir (Şekil 1).
NOT: Aort kapağı delindiğinde, cerrah bu kırılmayı hissedebilmelidir.
- Kateteri ve teli aort deliğinden hafifçe geri çekin ve aort kapaklarının delinmesinden sonra renkli Doppler modunda ve nabız dalgası Doppler modunda perforasyon sonrası ultrason verilerini toplayın. Regürjitan akış, renkli Doppler modunda kardiyastol sırasında kırmızı renktedir ve nabız dalgası Doppler modunda kantitatif olarak doğrulanabilir.
- Aort akışının tepe diyastolik hızını (PSVa) 300-500 mm/s arasında tatmin edici olarak düşünün. Kan akışının yetersizlik derecesi tatmin edici değilse, adım 4.2'yi tekrarlayın.
- İsteğe bağlı: Regürjitan akışın varlığını daha fazla doğrulamak için aort kapaklarının delinmesinden önce ve hemen sonra bir mikromanometre uygulayın. Kontrol etmek için, hem aort diyastol sonu basıncı (AEDP) bastırılır hem de aort nabız basıncı yaklaşık 20 mmHg arttırılır.
NOT: İnvaziv LV hemodinamik ölçümü gerçekleştirmek için bir mikromanometre kateterinin nasıl kullanılacağına dair ayrıntılı bir açıklama, başka bir yerde zarif bir şekilde sunulmuştur10,11.
5. Plastik kateter ve metal telin geri çekilmesi ve perioperatif bakım
- Ultrason jelini çıkarın ve aort kapaklarının başarılı bir şekilde delindiği onaylandıktan sonra fareyi steril gazlı bez veya doku ile kurulayın, ardından RCCA'nın ligasyonundan önce plastik kateteri merkezi metal tel ile dikkatlice çekin.
- Cildi sürekli dikiş şeklinde 5-0 ipek sütür kullanarak kapatın ve dikiş bölgesine povidon-iyot solüsyonu uygulayın. Fareyi analjezi için deri altından meloksikam (0.13 mg) ile uygulayın ve fareyi, iyileşme için tamamen uyanana kadar ısınma ışığı altında önceden ısıtılmış bir kafese yerleştirin.
6. Sahte cerrahi
- Bölüm 1-3'ü açıklandığı gibi gerçekleştirin. Sahte fare için, aort kapakçıklarını bozmadan bölüm 4'teki gibi benzer prosedürleri gerçekleştirin.
- Bölüm 5'i açıklandığı gibi gerçekleştirin, ancak AR, sahte olarak çalıştırılan farelerin hiçbirinde bulunmamalıdır.
7. Ekokardiyografi ve invaziv hemodinamik ölçüm kullanılarak aort kapak perforasyonu, kardiyak morfoloji ve fonksiyonun değerlendirilmesi
- 4 haftalık AR'den sonra, aortik ark görünümünde aort arkının kan akışını değerlendirmek için ekokardiyografik B modu, renkli Doppler modu ve nabız dalgası Doppler modunu kullanın ve adım 4.1'e ve başka bir yerde 1,12'ye göre PDVa'yı ölçün.
- LV diyastol sonu (LVEDD) ve sistolik uç (LVESD) boyutları, LV arka duvar diyastol sonu (LVPWTd) ve sistolik sonu (LVPWT'ler) kalınlığı, LV ejeksiyon fraksiyonu (LVEF) ve fraksiyonel kısalma (LVFS) türetilmiş ile parasternal uzun eksen görünümünde LV boyutunu ve kontraktilitesini değerlendirmek için ekokardiyografik B modu ve M modunu kullanın.
NOT: Ultrason makinesinin nasıl kullanılacağı ve ultrason görünümlerinin nasıl manipüle edileceği hakkında ayrıntılı bir açıklama daha önce zarif bir şekilde açıklanmıştır12.
- Ekokardiyografik görüntülemeden sonra, adım 4.3 ve başka bir yerde10'a benzer bir şekilde invaziv hemodinamik ölçüm yapın. Maksimum kasılma ve gevşeme hızını kaydedin (+dp/dt ve -dp/dt). AR ameliyatı sırasında RCCA kalıcı olarak bağlandığı için mikromanometreyi sol ortak karotis artere (LCCA, RCCA değil) yerleştirin.
- İnvaziv hemodinamik ölçümden sonra, fareyi servikal çıkık yoluyla ötenazi yapın. Göğsü açın, kalbi% 10 formalin, ardından% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ile yıkayın, aortu keserek kalbi çıkarın ve sol kulak kepçesinin alt kenarı seviyesinde enine kesit alın. Işık mikroskobu kullanarak görüntüler elde edin.