Yöntem makalesi

Zebra Balığında Platin ve Rutenyum Bazlı Bileşik Maruziyetinin Daha Geniş Uygulamalarla Endüktif Olarak Eşleşmiş Plazma Kütle Spektrometrisi ile Doz Alımı

DOI:

10.3791/63587

⸱

21 Nisan 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Department of Biochemistry and Microbiology, Rutgers University, 3Centro de Química Estrutural and Departamento de Química e Bioquímica, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığındaki metallerin ve metal bazlı bileşiklerin farmakokinetik ve toksikokinetik analizlerinin artan oranı, çevresel ve klinik çeviri çalışmaları için avantajlı olabilir. Bilinmeyen su kaynaklı maruz kalma alımının sınırlaması, endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi kullanılarak sindirilmiş zebra balığı dokusu üzerinde eser metal analizi yapılarak aşılmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metaller ve metal bazlı bileşikler çok çeşitli farmakoaktif ve toksikolojik ksenobiyotiklerden oluşur. Ağır metal toksisitesinden kemoterapötiklere kadar, bu bileşiklerin toksikokinetik değerleri hem tarihsel hem de modern gün ile ilgilidir. Zebra balığı, çevresel maruziyet ve klinik çeviri çalışmalarında farmakokineziyi ve toksikokinetik aydınlatmada çekici bir model organizma haline gelmiştir. Zebra balığı çalışmaları, kemirgen modellerinden daha yüksek verim elde etme avantajına sahip olsa da, modelde birkaç önemli kısıtlama vardır.

Böyle bir sınırlama, su bazlı dozaj rejiminde doğaldır. Bu çalışmalardan elde edilen su konsantrasyonları, güvenilir iç dozajlar sağlamak için tahmin edilemez. Metal bazlı bileşiklerin doğrudan ölçümleri, bileşikle ilgili moleküler ve biyolojik tepkilerle daha iyi bir korelasyon sağlar. Metaller ve metal bazlı bileşikler için bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, zebra balığı larva dokusunu maruz kaldıktan sonra sindirmek ve doku örnekleri içindeki metal konsantrasyonlarını endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICPMS) ile ölçmek için bir teknik geliştirilmiştir.

ICPMS yöntemleri, zebra balığı dokusundaki birkaç yeni Ru bazlı kemoterapötikten sisplatinden platin (Pt) ve rutenyum (Ru) metal konsantrasyonlarını belirlemek için kullanıldı. Ek olarak, bu protokol, zebra balığı dokusuna kıyasla larvaların koryonunda tutulan Pt konsantrasyonlarını ayırt etti. Bu sonuçlar, bu yöntemin larva dokularında bulunan metal dozunu ölçmek için uygulanabileceğini göstermektedir. Ayrıca, bu yöntem, çok çeşitli maruz kalma ve dozajlama çalışmalarında spesifik metalleri veya metal bazlı bileşikleri tanımlamak için ayarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metaller ve metal bazlı bileşikler farmakolojik ve toksikolojik açıdan önemini korumaktadır. Ağır metal maruziyetinin yaygınlığı ve sağlık üzerindeki etkisi, 1960'lardan bu yana bilimsel araştırmaları katlanarak artırdı ve 2021'de tüm zamanların en yüksek seviyesine ulaştı. İçme suyu, hava kirliliği ve mesleki maruziyetteki ağır metal konsantrasyonları dünya çapında düzenleyici sınırları aşmakta ve arsenik, kadmiyum, cıva, krom, kurşun ve diğer metaller için bir sorun olmaya devam etmektedir. Çevresel maruziyeti ölçmek ve patolojik gelişimi analiz etmek için yeni yöntemler yüksek talep görmeye devam etmektedir 1,2,3.

Tersine, tıp alanı klinik tedavi için çeşitli metallerin fizyokimyasal özelliklerinden yararlanmıştır. Metal bazlı ilaçlar veya metalloilaçlar, zengin bir tıbbi amaç geçmişine sahiptir ve kemoterapötikler4 olarak en yüksek başarı ile bir dizi hastalığa karşı aktivite göstermiştir. Metaloilaçların en ünlüsü olan sisplatin, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından dünyanın temel ilaçlarından biri olarak kabul edilen Pt bazlı bir antikanser ilacıdır5. 2010 yılında, sisplatin ve Pt türevleri birçok kanserde% 90'a varan bir başarı oranına sahipti ve kemoterapi rejimlerinin yaklaşık% 50'sinde kullanıldı 6,7,8. Pt bazlı kemoterapötikler inkar edilemez başarılara sahip olsalar da, doz sınırlayıcı toksisite, rafine biyolojik dağıtım ve aktiviteye sahip alternatif metal bazlı ilaçların araştırılmasını harekete geçirmiştir. Bu alternatiflerden, Ru bazlı bileşikler en popüler 9,10,11,12 haline gelmiştir.

Metal farmakokratik ve toksikokinetik çalışmalara duyulan ihtiyaç oranına ayak uydurmak için yeni modeller ve metodoloji gereklidir. Zebra balığı modeli, karmaşıklık ve verimin kesiştiği noktada yer alır ve %70 korunmuş gen homolojisine sahip yüksek doğurganlığa sahip bir omurgalıdır13. Bu model, kurşun keşfi, hedef tanımlama ve mekanik aktivite için çeşitli bileşikler için kapsamlı taramalar ile farmakoloji ve toksikolojide bir varlık olmuştur14,15,16,17. Bununla birlikte, kimyasalların yüksek verimli taranması tipik olarak su kaynaklı maruziyetlere dayanır. Bu alımın, çözeltideki bileşiğin fizikokimyasal özelliklerine (yani, fotodegradasyon, çözünürlük) bağlı olarak değişken olabileceği göz önüne alındığında, bu, doz dağıtımı ve yanıtını ilişkilendirmenin önemli bir sınırlaması olabilir.

Dozun daha yüksek omurgalılarla karşılaştırılması için bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, zebra balığı larva dokusundaki eser metal konsantrasyonlarını analiz etmek için bir metodoloji tasarlanmıştır. Burada, öldürücü ve subölümcül sonlanım noktalarının doz-yanıt eğrileri, sisplatin ve yeni Ru bazlı antikanser bileşikleri için değerlendirildi. Öldürücülük ve gecikmiş kuluçka, 0, 3.75, 7.5, 15, 30 ve 60 mg / L sisplatin nominal konsantrasyonları için değerlendirildi. Organizma dokusunda Pt birikimi ICPMS analizi ile belirlendi ve ilgili dozların organizma alımı organizma başına 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 ve 461.9 ng (Pt) idi. Ek olarak, zebra balığı larvaları 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg / L PMC79'a maruz bırakıldı. Bu konsantrasyonların analitik olarak 0, 0.17, 0.44, 0.66 ve 0.76 mg / L Ru içerdiği belirlenmiştir. Bu protokol aynı zamanda larvaların koryonunda tutulan Pt konsantrasyonlarının zebra balığı dokusuna kıyasla ayırt edilmesine de izin verdi. Bu metodoloji, iyi kurulmuş bir kemoterapötik ve yeni bir bileşik arasındaki farmakokinetik ve toksikokinetik aktivitenin karşılaştırılması için güvenilir, sağlam veriler sağlayabilmiştir. Bu yöntem çok çeşitli metallere ve metal bazlı bileşiklere uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AB suşu zebra balığı (Danio rerio) tüm deneyler için kullanıldı ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve hayvancılık protokolü (#08-025) Rutgers Üniversitesi Hayvan Bakım ve Tesisleri Komitesi tarafından onaylandı.

1. Zebra balığı yetiştiriciliği

  1. Zebra balığını, 14 saatlik bir ışık: 10 saatlik karanlık döngüde devridaim yapan bir sucul habitat sisteminde yetiştirin ve koruyun.
    1. Balık sistemi suyu elde etmek için belediye musluk suyunu kum ve karbon filtrasyonu yoluyla arıtın. Su sistemi suyunu 28 °C, <0.05 ppm nitrit, <0.2 ppm amonyak ve pH 7.2 ila 7.7 arasında tutun.
    2. Zebra balığını yumurtadan çıkmış Artemia kistleri, tuzlu su karidesleri ve balık diyeti pul yiyeceklerinden oluşan bir diyetle besleyin.

2. Zebra balığı doz-yanıt protokolü (Şekil 1)

  1. Zebra balığı yumurta suyu çözeltisi, E3 orta veya deiyonize suda çözünmüş 60 μg / mL konsantrasyonda stok deniz tuzundan yapılmış yumurta suyu18 hazırlayın. Metilen mavisi kullanımından kaçının.
    NOT: ICPMS aracılığıyla, bir rutenyum izotopu ile örtüşen stronsiyum oksitler için zebra balığı yumurta suyunun izobarik girişimi tanımlanmıştır. Aşağı akış analizinden önce larvaların dikkatli bir şekilde durulanması bu sorunu iyileştirdi. E3 ortamı, ticari deniz tuzlarının tescilli yapısı nedeniyle bazıları için daha kolay bir seçim olabilir.
  2. Metal veya metal bazlı bileşikleri E3 veya yumurta suyunda çözün. Herhangi bir agrega malzemesini parçalamak ve çözeltiyi homojenize etmek için vorteks.
    NOT: Aşağıda özetlenen deneyde, PMC79 ve sisplatin, çökelmeye direnmek için maksimum% 0.5 dimetil sülfoksit (DMSO) konsantrasyonu ile maksimum 12.4 mg / L ve 60 mg / L konsantrasyonlarında çözülmüştür.
    1. PMC79 ve sisplatin gibi ağır metal veya metal bazlı bileşikleri E3 veya yumurta suyuyla seyreltin, en az 5 konsantrasyon dozu hazırlayın.
      1. Saf araçta (yani DMSO) düşük konsantrasyonlarda stok çözeltileri ile başlayın, ardından E3 veya yumurta suyu ile seyreltin. Son araç konsantrasyonlarını dikkatlice düşünün.
        NOT: Cisplatin gibi bazı metal bazlı bileşikler hızla bozulur ve çözeltileri günlük olarak taze yapılmalıdır. DİKKAT: Ağır metalleri ve kemoterapötikleri dikkatli kullanın. İlgilendiğiniz metal için özel malzeme güvenlik bilgi formunu (MSDS) gözden geçirin. Cisplatin göz ve cilt tahrişine neden olabilir, yutulduğunda ölümcül olabilir ve böbreklerde, kanda, kan oluşturan organlarda ve fetal dokuda toksisiteye neden olabilir. Dumanları solumaktan ve gözlerle, ciltle ve giysilerle temasından kaçının. Geçirimsiz eldiven ve giysiler ve güvenlik gözlükleri veya gözlükler giyin19.
  3. Deneyden önceki öğleden sonra,20 cinsiyeti arasında bir bölücü ile 2 dişiye 1 erkeğin ideal oranında üreme tankları kurun.
    1. Sabah döngüsü için ışıklar yandığında bölücüyü çekin.
    2. Zebra balıklarının üremesine izin verin.
      NOT: Üreme süresinin uzunluğu, gerekli ilk maruz kalma aşamasına bağlıdır. 3 saat sonrası döllenme için, yaklaşık 2 saat üremeye izin verin. Yumurtalar temizlendikten ve ayrıldıktan sonra 3 hpf'ye ulaşacaktır.
    3. Damızlık balıkları temiz bir tanka taşıyın.
    4. Tank suyunu bir süzgeçten dökerek yumurtaları toplayın.
    5. Süzgeci bir Petri kabının üzerine ters çevirin ve yumurtaları yemeğe durulamak için E3 veya yumurta suyuyla dolu bir fışkırtma şişesi kullanın.
    6. Deneysel kullanımdan önce yiyecek ve atık tabağını temizleyin.
  4. Bir transfer pipeti ve az miktarda su kullanarak doz başına yaklaşık yirmi 3 hpf embriyoyu ayrı cam şişelere randomize edin.
  5. Tüm embriyolar şişelerde bulunduktan sonra, tüm yumurta suyunu çıkarın ve yumurtanın yüksekliğinin üzerinde yaklaşık 1 inç çözelti olacak şekilde yeterli dozlama çözeltisi ile değiştirin.
    NOT: Dekoryonasyonun gerekliliği dikkatle düşünülmelidir. Daha fazla ayrıntı için tartışma bölümüne bakın.
  6. Embriyoları lezyonlar veya ölümcüllük için günlük olarak gözlemleyin. Embriyonik zebra balıklarının hızlı gelişimi nedeniyle, günler arasında küçük lezyonları tanımlamak için herhangi bir parlak alan mikroskobu / kamera kurulumunu kullanarak günlük görüntüler elde edin.
  7. Doz yanıtının sona ermesinde (döllenmeden 4-5 gün sonra [dpf], Örgüt Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma [OECD] kılavuzu21'e göre), kompozit örnekleme için ötenaziden önce 3-5 larvayı birleştirin. Sıvı azotta çabuk dondurularak hızlı soğutularak ötenazi.
    NOT: MS-222 veya trikain metansülfonat doz aşımı yoluyla ötenazi, aşağı yönde ICPMS analizine potansiyel olarak müdahale edebilir. Bu protokol için girişim olasılığını azaltmak için hızlı soğuyan ötenazi yöntemleri teşvik edilir.
  8. Fazla bileşiği dokunun dışından çıkarmak için yüksek saflıkta suyla (ters ozmoz gibi) 3 doku yıkaması yapın.
  9. Numuneleri asit ve mikrodalga güvenli 15 mL polipropilen santrifüj tüplerine taşıyın. Kalan herhangi bir sıvı nitrik asidi ve dolayısıyla doku bozulması sırasında asidin oksitleyici potansiyelini seyreltebileceğinden, tüm fazla suyu gidermeye dikkat edin.
    NOT: Bu noktada, doku daha fazla analize kadar -20 ° C'de saklanabilir. Doğal olarak bol miktarda bulunan metaller için, tüplerin kullanımdan önce% 5'lik bir nitrik asit banyosunda temizlenmesi, ortam arka plan seviyelerini iyileştirecektir.

3. Doku sindirimi ve ICPMS değerlendirmesi (Şekil 2)

  1. 10 larvaya (~ 100 μg) kadar yüksek saflıkta nitrik asit (% 69) için 15 mL polipropilen santrifüj tüplerine yaklaşık 0.25 mL ekleyin. Aşağıdaki ayarları kullanarak örnekleri önceden sindirmek için 1 saat boyunca ultrasonikat: ultrasonik banyo çıkışı: 85 W; 42 kHz ± %6; sıcaklık aralığı: 19-27 °C.
    DİKKAT: Sonikasyon sırasında kulak koruması takın. Nitrik asit ciddi solunum yolu, göz ve cilt yanıklarına neden olur. Tam koruyucu ekipman giyin ve duman davlumbazında veya yeterli havalandırmaya sahip yerlerde çalışın. Diğer malzemelerle yanıcı olabilir. Nitrik asit, sindirim sırasında üretilen buharlara maruz kalmayı önlemek için sadece bir duman davlumbazında kullanılmalıdır. Nefes almayın veya yutmayın.
    1. Tüm dokular gözle görülür şekilde oksitlenene kadar (yani, üniforma, berrak sarı çözelti) asit güvenli bir mikrodalga çürütücüde kısa doku sindirim döngüleri (5 dakikalık aralıklarla) gerçekleştirin.
      NOT: Tablo 1'deki mikrodalga protokolünün üç kez yapılması önerilir ve her ısıtma adımı arasında 5 dakikalık bir bekleme aralığı içerir.
    2. Yırtılmayı önlemek için tüplerin bütünlüğünü dikkatlice izleyin ve asit yoğuşmasını tüpün dibine taşımak için döngüler arasında santrifüjde kısa dönüşler (1 dakika boyunca 313 × g) yapın.
      NOT: Dokunun sindirimi zorsa (özellikle koryonlar), asit sindiriminden sonra% 30 yüksek saflıkta hidrojen peroksit kullanılabilir. Asit konsantrasyonunu% 3.5'e seyreltmek için hidrojen peroksiti (6.75 mL) kullanın ve numunelerin bir duman davlumbazında gece boyunca oturmasına izin verin. Hidrojen peroksitH2O'ya ayrışır ve ICPMS analizi için uygundur. Ayrıca, alternatif metaller hidroklorik asit veya hidroklorik asit ve nitrik asit karışımında (yani, aqua regia) daha iyi çözünebilir. Hidrojen peroksit yutulduğunda zararlıdır ve ciddi göz hasarına neden olur. Cilt ve göz koruması kullanın22,23.
  2. Doku gözle görülür şekilde oksitlendikten sonra (yani, üniforma, berrak sarı çözelti), numuneleri bir duman davlumbazında, iyice karıştırmak için 6.75 mL yüksek saflıkta su ve vorteks kullanarak% 3.5 nitrik aside seyreltin.
    NOT: Bu noktada, numuneler oda sıcaklığında saklanabilir. Adım 3.1'de sindirime yardımcı olmak için hidrojen peroksit eklenmişse, bu adım gereksizdir.
  3. Herhangi bir potansiyel izobarik girişimi hesaba katmak için ilgili metal ve optimum izotop (lar) ile sertifikalı bir element standardı (yani, tahlil bağlı olarak Pt veya Ru) kullanarak matris eşleşmiş, 7 noktalı bir kalibrasyon eğrisi (konsantrasyon aralığı 0.001-10 ppb) yürütün.
    1. Sulu, sertifikalı element standardının (Ru, Pt = 1000 ppb) stok konsantrasyonunu kullanarak, 0,1 mL'lik bir aliquot alın ve pipet'i yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpüne alın. 10 ppb'lik standart bir çözelti üretmek için% 3,5 nitrik asit ile 10 mL'lik son hacme kadar seyreltin.
    2. 10 ppb stoğu kullanarak aşağıdaki seri seyreltmeleri yapın:% 3,5 nitrik asitte 0,1, 1,0 ve 5,0 ppb standart çözeltiler.
    3. 0,1 stoğunu kullanarak aşağıdaki seri seyreltmeleri yapın:% 3,5 nitrik asitte 0,001, 0,005 ve 0,01 ppb standart çözeltiler.
  4. ICPMS aygıtını hazırlama (bkz. Malzeme Tablosu) numune analizi için aşağıdaki gibidir:
    1. Cihazı çalıştırmadan önce, Argon gaz vanasının açık olduğundan, tüm boruların güvenli bir şekilde bağlandığından ve numune analizleri arasında boru ve cam eşyaların durulanması için temiz% 5 nitrik asidin açık olduğundan emin olun.
    2. Torç ve konilerin durumunu kontrol edin ve torç kutusunun güvenli bir şekilde kilitlendiğinden ve püskürtme odası drenaj borusunun çevre pompasına düzgün bir şekilde bağlandığından emin olun.
    3. Yazılımı açın ( bkz. Malzeme Tablosu).
    4. Vakum okumalarını kontrol edin ve tüm turbo pompaların %100 çalıştığından emin olun.
    5. Başlatma sırasını başlatmak , plazma pompasını, plazma soğutucusunu açmak, nebülizörü temizlemek ve plazmayı aydınlatmak için Plazma Kontrol Sistemi Durumu penceresinde BAŞLAT'a tıklayın. Durum penceresi başlatma sırasının tamamlandığını gösterdiğinde plazmanın yanmasını ve kararmasını bekleyin. Bu noktada, Sistem Durumu penceresinde tüm Güç Kaynaklarının açık olduğunu gösteren yeşil noktalara dikkat edin.
    6. Menü çubuğunda, açılır menüde Otomatik örnekleyiciyi Kontrol | 'e tıklayın. %5 nitrik asit içeren tüp için otomatik numune alma rafı konumunu girin. Asidin plazmaya girmesine izin verin.
    7. Menü çubuğunda, Taramalar | Açılır menüdeki mıknatıs. MagnetScan penceresinde, İşaretçi Kütlesi Konumu alanına 115 yazın ve enter'a tıklayın. Cihaz ısınırken mıknatısın kütlearalığında 115 In (114.6083 ila 115.3749) için 30 dakika boyunca tarama yapmasına izin verin.
    8. 30 dakika sonra, 1 ppb çok elemanlı ayar çözümünün konumuna geçmek için otomatik örnekleyici kontrolünü kullanın. Akort çözümünü aspire edin ve sinyal okumayı optimize etmek için cihazı ayarlayın. Torç konumunu (X, Y, Z) torç, Plazma kontrol penceresindeki konilerin merkezi ve nebülizör akış hızı (~ 30 psi) ile aynı hizada olacak şekilde ayarlayın. İyon Optik Ayarlama penceresinde Kaynak, Dedektör ve Analizör için gerekli ayarlamaları yapın.
    9. Sinyal okuması optimize edildikten sonra (~1,2 × 115 In'de 1 ppb için 106 sayım/s), Mıknatıs Taraması penceresinde Durdur'u tıklatın.
      1. Mıknatısı Kalibre Et'e tıklayın ve açılır pencerede Düşük Çözünürlük'ü seçin.
      2. Tamam'a tıklayın ve Mıknatısı kalibre etmek için "Kütle Kalibrasyonu (Düşük Çözünürlük).smc" dosyasını açın.
        NOT: Mıknatıs kalibrasyonu sayımları/sayıları ölçecek ve aşağıdaki kütle aralığında bir eğriye uyacaktır: 7Li ila 238U.
      3. Save | ( Kaydet) seçeneğine tıklayın Mevcut mıknatıs kalibrasyonunu analizlere uygulamak için kullanın. Bilinmeyen numuneleri çok çeşitli konsantrasyonlarla ölçüyorsanız, düşük konsantrasyonlardaki iyon darbe sayım sinyallerini daha yüksek konsantrasyonlarda üretilen zayıflatılmış iyon sinyalleriyle karşılaştırmak için bir Dedektör Kalibrasyonu gerçekleştirin. Ayar ve kalibrasyon tamamlandıktan sonra numuneleri analiz edin.
    10. Menü çubuğunda, Veri Toplama'ya tıklayın.
      1. Açılır menüden Yöntem Kurulumu'na tıklayın. Üretici tarafından sağlanan varolan bir yöntemi kullanın veya ilgilenilen öğeleri temel alan bir yöntem oluşturun. Gerekirse, deflektör ayarları için analiz modunu, bekleme süresini, anahtar gecikmesini, süpürme / döngü sayısını, çözünürlüğü, algılama modunu ve park kütlesini ayarlayın.
      2. Yöntem ayarlarını kaydetmek için Kaydet'i tıklatın. Her metal ve izotop için parametreleri optimize edin. Bu çalışmada kullanılan spesifik operasyon parametreleri için Tablo 2'ye bakınız.
    11. Menü çubuğunda, Veri Toplama'ya tıklayın.
      1. Açılır menüden Toplu Çalıştırma'ya tıklayın. Alternatif olarak, menü çubuğunun altındaki BATCH Simgesine tıklayın. Toplu iş parametrelerini bir elektronik tablodan içe aktarın veya Toplu Çalıştırma penceresinde bir sıra oluşturun. Örnek türünü, otomatik örnekleyici raf konumunu, aktarım süresini, yıkama süresini, çoğaltmaları, numune kimliğini ve metot dosyasını girin.
    12. Toplu iş çalışmasını aşağıdaki sırayla düzenleyin: kalibrasyon eğrisi için standart çözümler (0,001-10 ppb Pt veya Ru), ardından bir kalite kontrol standardı, ardından bilinmeyen numuneler.
      NOT: Standart çözümler ICPMS'de sayım/sn olarak ölçülür ve doğrusal bir regresyon, 0,999 > göreceli standart sapma (RSD) ile standartlara uyar. Bilinmeyenler ayrıca sayım / s olarak ölçülür ve kalibrasyon eğrisinin doğrusal regresyonu kullanılarak ppb'deki konsantrasyon için çözülür, y = mx + b. Veri işleme, referans verilen yazılım kullanılarak da tamamlanabilir.
    13. Her 5-10 numuneye 0,5 ppb kalite kontrol standardı ekleyerek cihaz sapmalarını ve numune tekrarlanabilirliğini izleyin.
      NOT: Uygun kalite kontrol standartları, kalibrasyon eğrisinde kullanılan standarttan farklı, sertifikalı bir standart referans malzeme olmalıdır.
WattGüçTutanak
30050%5
30075%5
3000%5
30075%5

Tablo 1: Larva doku kütlesi için mikrodalga sindirim protokolü. Zebra balığı larva örnekleri 0.25 mL nitrik asit içinde sindirildi. Bu tablo 24'ten değiştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu sonuçlar daha önceyayınlanmıştı 24. Doku alım çalışmaları, sisplatinin su kaynaklı maruziyetleri ve yeni bir Ru bazlı antikanser bileşiği olan PMC79 ile gerçekleştirildi. Öldürücülük ve gecikmiş kuluçka, sisplatin 0, 3.75, 7.5, 15, 30 ve 60 mg / L sisplatinin nominal konsantrasyonları için değerlendirildi. Organizma dokusunda Pt birikimi ICPMS analizi ile belirlendi ve organizma dokusu organizma başına 0.05, 8.7, 23.5, 59.9, 193.2 ve 461.9 ng (Pt) dozlarını içeriyordu (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, Pt veya Ru içeren metal bazlı antikanser ilaçların verilmesini ve alımını belirlemek için uygulanmıştır. Bu yöntemler daha önce yayınlanmış olmasına rağmen, bu protokol, bu metodolojiyi bir dizi bileşiğe uyarlamak için önemli hususları ve ayrıntıları tartışmaktadır. OECD protokolü, doku sindirimi ve ICPMS analizi ile birleştiğinde, PMC79'un sisplatinden daha güçlü olduğunu ve farklı mekanizmalar öneren farklı doku birikimine neden olduğunu belirlememize izin verdi. Ayrıca, verilen sisplatin doz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların hiçbiri tarafından açıklanacak çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansman: NJAES-Rutgers NJ01201, NIEHS Eğitim Hibe T32-ES 007148, NIH-NIEHS P30 ES005022. Ek olarak, Brittany Karas, NINDS, NIH'den T32NS115700 eğitim hibesi ile desteklenmektedir. Yazarlar Andreia Valente ve Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı'nı (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) PMC79 tedariki için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AB Suşu Zebra Balığı (Danio reri)Zebra Balığı Uluslararası Kaynak MerkeziVahşi Tip ABYabani Tip AB Zebra Balığı
ACS Sınıfı Nitrik AsitVWR BDH KimyasallarıBDH3130-2.5LPNitrik Asit (%68-70); Santrifüj tüplerini ıslatma / ön celaning için %10 HNO < alt > 3< / alt> asit banyosu çözeltisi yapmak için kullanılır
Aquatox Balık Diyeti (Pul)Zeigler Bros, Inc.Aquatox Balık Diyetinin 1:4 oranında TetraMin Tropikal Pullara karıştırılacak ve yem olarak kullanılacak pul yem
, Artemia kistleri, salamura karidesPentairAESBS90Salamura karides yumurtaları 15 ozz, vakumlu teneke kutularda satılıyor, kuluçkadan çıkacak ve yem olarak kullanılacak
ASX-510 ICPMSTeledyne CETACiçin Otomatik Numune Alma CihazıYapışabilir XYZ hareketi, akıcı durulama istasyonu ve 0,3 mm iç boyut probu ile otomatik numune alma cihazı. Programlanabilir parti bazlı analizler için Nu AttoLab yazılımı ile uyumludur.  
SantrifüjThermo ScientificCL 2Thermo Scientific CL 2 5200 rpm'ye kadar değişken hız aralığına sahip kompakt tezgah üstü santrifüj; on mikrodalga sindirim aralıkları arasında numune ve asit kondensatını santrifüj tüpünün dibine getirmek için kullanılır; numune tutmaya yardımcı olur
Santrifüj tüpleriVWR21008-105Düz kapaklı ultra yüksek performanslı polipropilen santrifüj tüpleri; 15 mL hacim; konik tabanlı
A Sınıfı Şeffaf Cam Dişli ŞişelerFisherbrand03-339-25BMaruz kalma muhafazası için ayrı cam şişeler
Dimetil SülfoksitMillipore SigmaD8418Hidrofobik bileşikler için çözücü veya araç
Sabit Hızlı Vorteks KarıştırıcıVWR10153-834Vorteks karıştırıcı; asit sindirimi ve seyreltmesinden sonra numuneyi homojenize etmek için kullanılır
Yüksek Saflıkta Hidrojen PeroksitMerk KGaA, EDM Millipore1.07298.0250Suprapur Hidrojen peroksit (% 30); numune sindirimi için kullanılır
Yüksek Saflıkta Nitrik AsitEDM MilliporeNX0408-2Omni Trace Ultra Nitrik Asit (%69); numune sindirimi için kullanılır
Anında Okyanus Deniz TuzuSpektrum Markaları, Inc.Anında Okyanus® Deniz TuzuYumurta suyu çözeltisi, nihai konsantrasyonu 60 & mikro olan okyanus deniz tuzu içerir; g/ml
Mars X Mikrodalga Sindirim SistemiCEM, Matthews, NCNumuneleri tek tip koşullar altında sindirmek ve homojenize etmek için kullanılan mikrodalga asit sindirim sistemi. Bu metodoloji için açık kap parçalama yöntemi, düşük güçte (300 W) tek kullanımlık polipropilen santrifüj tüpleri kullanılarak tamamlanmıştır.
Çok Elemanlı Çözüm 3SPEX CertiPREPCLMS-3, %10 HCl/%1 HNO3 içinde 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn içerir; Pt ve Ru analizleri için kalite kontrol standardı olarak kullanılır
Nu Instruments AttoM Yüksek Çözünürlüklü Endüktif Eşleşmiş Plazma Kütle Spektrometresi (HR-ICP-MS)Nu Instruments/AmatekEsnek düşük ila yüksek çözünürlüklü yarık sistemi ve dinamik aralık dedektör sistemi ile çift odaklamalı manyetik sektör endüktif olarak birleştirilmiş plazma kütle spektrometresi. Veri işleme ve niceleme, NuQuant yardımcı yazılımı kullanılarak yapılır. 
Platin (Pt) standart çözelti, NIST 3140Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü3140% 10 HCl içinde 9.996 mg / g Pt içeren ampulden hazırlanır; Pt analizleri için kalite kontrol standardı olarak kullanılır Platin
(Pt) standart çözelti, tek elemanlıYüksek Saflık Standartları100040-2%5 HCl Rutenyum (Ru) standart çözeltisinde 1000 mg/L Pt içerir
, tek elemanlıYüksek Saflık Standartları100046-2%2 HCl içinde 1000 mg/L Ru içerir
TetraMin Tropikal PullarTetra77101Aquatox Balık Diyetinin 1:4 oranında TetraMin Tropikal Pullara karıştırılacak ve yem olarak kullanılacak pul mama
Metal Sınıfı Nitrik AsitVWR BDH Kimyasalları87003-261Aristar Plus Nitrik Asit (%67-70); ASX-510'da durulama çözeltisi için kullanılır Otomatik örnekleyici
Ultrasonik su banyosuVWRB2500A-DTHMikrodalga sindiriminden önce asit sindirimine yardımcı olmak için kullanılan ultrasonik su banyosu
sızdırmaz İz

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
  2. Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65(2018).
  3. Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821(2021).
  4. Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
  5. Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
  6. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  7. Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin-based chemotherapy of human cancers. Journal of Cancer Science & Therapy. 11 (4), 97(2019).
  8. Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925(2019).
  9. Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
  10. Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995(2019).
  11. Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G. Ruthenium antimetastatic agents. Current Topics in Medicinal Chemistry. 4 (15), 1525-1535 (2004).
  12. Lin, K., Zhao, Z. -Z., Bo, H. -B., Hao, X. -J., Wang, J. -Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323(2018).
  13. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  14. Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
  15. Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
  16. Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
  17. Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  19. Pfizer. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer. , Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011).
  20. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  21. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013).
  22. EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
  23. Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0,MDA_CHEM-107298 (2014).
  24. Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
  25. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
  26. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  27. Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebrafish Toksikokineti iMetal Doz KantifikasyonuPlatin Al mRutenyum Al mSu Yoluyla Maruz B rakmaDoku SindirimiICPMS AnaliziLarval Doku Al mKemoterap tik Metaller

İlgili makaleler