Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63602

⸱

21 Mart 2022

 ,  , 
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Bu makalede

Özet

Protokol, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı proteini kullanarak memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir yöntemi açıklar. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında hücrelerden saflaştırıldı.

Özet

Ubikitinasyon, bir substrat proteininin sadece stabilitesini değil, aynı zamanda lokalizasyonunu ve işlevini de düzenleyen bir tür posttranslasyonel modifikasyondur. Ubikitinasyon süreci ökaryotlarda hücre içi olarak gerçekleşir ve neredeyse tüm temel hücresel biyolojik süreçleri düzenler. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, substrat proteinlerinin işlevini kontrol etmede ubikitinasyonun rolünün araştırılmasına yardımcı olur. Burada, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir prosedür, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı protein ile tanımlanmıştır. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında saflaştırıldı. Total hücresel Bayrak etiketli p53 proteini, denatüre olmayan koşullar altında anti-Flag antikor konjuge agaroz ile saflaştırıldı. Alternatif olarak, toplam hücresel His etiketli ubikitinlenmiş protein, denatüre edici koşullar altında nikel yüklü reçine kullanılarak saflaştırıldı. Elatlardaki ubikitinlenmiş p53 proteinleri, spesifik antikorlarla başarılı bir şekilde tespit edildi. Bu prosedürü kullanarak, belirli bir proteinin ubikitinlenmiş formları, memeli hücrelerinden verimli bir şekilde saflaştırılabilir ve bu da protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun rolleri üzerine çalışmaları kolaylaştırır.

Giriş

Ubikitin, 76 amino asit 1,2,3'ün evrimsel olarak korunmuş bir proteinidir. Ubikitin, hedef proteinler üzerindeki lizin kalıntılarını, aktive edici (E1), konjuge edici (E2) ve ligaz (E3) enzimlerini içeren kaskadlar yoluyla kovalent olarak bağlar. Ubikitin ilk önce E1 enzimi tarafından aktive edilir ve daha sonra E2 konjuge edici enzimlere aktarılır. Daha sonra, E3 ubikitin ligazları hem ubikitin yüklü E2 enzimleri hem de substrat proteinleri ile etkileşime girer ve ubikitinin C-terminali ile substrat 1,2,3,4,5'teki bir lizin kalıntısı arasında bir izopeptit bağının oluşumuna aracılık eder. Ubikitinasyon, ubikitin moieties substrat proteinleri üzerindeki lizin kalıntılarına veya kendisine bağlanmasını içerir ve bu da protein monoubikitinasyonuna veya poliubikitinasyona yol açar. Bu ubikitinasyon süreci ökaryotlarda hücre içi olarak gerçekleşir ve çok çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Ubikitinasyon, substrat proteinlerinin ubikitin-proteazom sistemi 1,2,3,4,5 yoluyla parçalanmasıyla sonuçlanır. Ek olarak, ubikitinasyon protein hücre altı lokalizasyonunu, protein kompleks oluşumunu ve hücrelerdeki protein kaçakçılığını modüle eder 3,5. Substrat proteinlerine bağlı ubikitin moieties deubikitinating enzimler (DUB'ler) tarafından uzaklaştırılabilir6,7. Özellikle, ubikitin zincirlerinin bir araya getirildiği farklı yollar, çeşitli biyolojik süreçleri düzenlemek için sayısız araç sağlar 1,5. Substrat protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun kesin rolü şimdiye kadar tam olarak anlaşılamamıştır. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, protein ubikitinasyonunun çeşitli hücresel süreçler üzerindeki etkilerinin aydınlatılmasına katkıda bulunur.

P53 proteini en önemli tümör baskılayıcı proteinlerden biridir ve hemen hemen tüm insan kanserlerinde genetik mutasyonlar veya inaktivasyon sergiler 8,9,10,11. p53 stabilitesi ve aktivitesi, ubikitinasyon, fosforilasyon, asetilasyon ve metilasyon12,13 dahil olmak üzere posttranslasyonel modifikasyonlarla in vivo olarak hassas bir şekilde düzenlenir. P53 proteini, çeşitli hücrelerde 6 dakika ila 40 dakika arasında değişen kısa bir yarı ömre sahiptir, bu da esas olarak poliubikitinasyonu ve ardından proteazomal bozunması 10,12'den kaynaklanır. Fare çift dakika 2 (Mdm2), transkripsiyonel aktivitesini inhibe etmek için p53'ün N-terminusuna bağlanan bir E3 ubikitin ligazıdır12,14,15. Mdm2, stabilitesini kontrol etmek için p53'ün poliubikitinasyonunu ve proteazomal bozunmasını teşvik eder ve nükleer ihracatını kolaylaştırmak için p53'ün monoubikitinasyonunu indükler12,14,15,16. Burada, Mdm2 aracılı p53 ubikitinasyonu, memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması için ayrıntılı olarak bir yöntem tanıtmak için örnek olarak kullanılmıştır. Hedef proteinlerin ubikitinasyon durumunu etkileyen düzenleyiciler, memeli hücrelerinde aşırı eksprese edildiklerinde veya yıkıldıklarında / nakavt edildiklerinde bu in vivo ubikitinasyon testi kullanılarak tanımlanabilir. Ek olarak, ubikitinlenmiş proteinler in vitro deubikitinasyon testi için substrat olarak kullanılabilir. Her yerde bulunan substratları bireysel DUB'lerle inkübe ederek hedef proteinler için spesifik DUB'leri tanımlamak için yüksek verimli bir tarama yapılabilir. Ubikitinlenmiş proteinler, hücrelerde aşağı akış sinyal proteinlerini işe almak için bir iskele görevi görebilir. Her yerde bulunan bir hedef protein kompleksi, doğal saflaştırma koşulları altında sıralı immünopresipitasyon ile saflaştırılabilir ve kütle spektrometrisi ile tanımlanabilir. Mevcut protokol, ubikitinasyon tarafından düzenlenen hücresel proteinleri araştırmak için yaygın olarak kullanılabilir.

Ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için, afinite etiketli ubikitin, ubikitin antikorları, ubikitin bağlayıcı proteinler ve izole ubikitin bağlayıcı alanların (UBD'ler) kullanımını içeren çeşitli yöntemler oluşturulmuştur17. Burada, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için bir aracı olarak afinite etiketli ubikitini kullanan bir protokol sunuyoruz. Poli-His-etiketli ubikitin kullanımı diğer yöntemlere göre avantajlar sunar. Ubikitinlenmiş proteinler, hücresel proteinleri doğrusallaştırarak ve protein-protein etkileşimlerini bozarak nikel yüklü reçineye spesifik olmayan bağlanmayı azaltan güçlü denatürantların varlığında saflaştırılır. Buna karşılık, ubikitin antikorlarının, ubikitin bağlayıcı proteinlerin ve izole UBD'lerin aracılar olarak kullanılması, bağlanma ortaklarını hedef proteinden etkili bir şekilde dışlayamaz, çünkü saflaştırmanın daha az katı koşullar altında yapılması gerekir. Dahası, saflaştırma, bu aracıları kullanarak ilgisiz proteinlerin bağlanmasının artmasına da yol açabilir. Ek olarak, çeşitli ubikitin bağlantı tiplerinin yanı sıra ubikitin bağlayıcı proteinler veya izole UBD'ler tarafından mono- ve poli-ubikitinasyon için bağlanma eğilimi vardır17. Poli-His-etiketli ubikitin kullanımı, tüm hücresel ubikitinlenmiş proteinlerin aşağı çekilmesine katkıda bulunur. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen anti-Flag veya anti-HA antikor konjuge agarozun kullanılması, büyük ölçekli Bayrak veya HA etiketli hedef proteinlerin denatüre olmayan koşullar altında immünopreçökeltiyi kolaylaştırır. Örneğin, poli-His-etiketli ubikitini hedefleyen nikel yüklü reçine ile ikinci bir saflaştırma adımı, aşağı akış deneyleri için yüksek saflıkta ubikitinlenmiş hedef proteinleri elde etmek için kullanılabilir. Özellikle, bir epitop etiketleme saflaştırma stratejisi, hedef proteinleri etkili bir şekilde immünopreçökite etmek için spesifik bir antikor elde edilemediğinde uyarlanabilir. Son olarak, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, in vitro saflaştırma ile karşılaştırıldığında, hedef proteinlerin ubikitin bağlantı modunu daha fizyolojik koşullar altında korur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: H1299 hücreleri, Çin Bilimler Akademisi Kök Hücre Bankası tarafından nazikçe sağlanmıştır ve mikoplazma kontaminasyonu için negatif olduğu kanıtlanmıştır.

1. Hücre kültürü

  1. İlk kültür için, insan akciğer adenokarsinom hücre hattının 1 x 106 hücresini, H1299'u% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 10 glutamin katkı maddesi,% 1 sodyum piruvat ve antibiyotikler (100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin) ile desteklenmiş 10-12 mL RPMI 1640 orta ile 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Hücreleri% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de tutun. Hücreleri% 80 -% 90 akıcılığa ne zaman ulaştıklarına bağlı olarak her 2-3 günde bir bölün.
  2. Transfeksiyondan bir gün önce, transfeksiyon sırasında% 70-90'lık bir birleşme elde etmek için üç Petri kabı için6-9 x 10 6 hücre ve 10-12 mL ortam içeren tek bir 10 cm Petri kabında 2-3 x 106 hücre hazırlayın.
    NOT: HEK293T hücreleri, yüksek transfeksiyon verimliliği ve protein ekspresyon seviyesi nedeniyle ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için de kullanılabilir.

2. Plazmid transfeksiyonu

  1. Üç adet 15 mL'lik santrifüj tüpüne 1,5 mL azaltılmış serum ortamı ekleyin.
  2. Aşağıdaki gibi seyreltmeler yapmak için her tüpe transfeksiyona hazır plazmid DNA'sı ekleyin. Tüp 1: 1 μg Flag-p53 plazmid, 12 μg boş vektör; Tüp 2: 1 μg Flag-p53 plazmid, 3 μg His-HA-Ub (HH-Ub) plazmidi ve 9 μg boş vektör; Tüp 3: 1 μg Flag-p53 plazmid, 3 μg HH-Ub plazmid ve 9 μg Mdm2 plazmid. Transfeksiyon verimliliğini izlemek için her tüpe toplam 0,2 μg yeşil floresan protein (GFP) plazmidi ekleyin.
    NOT: Hücrelerde etkili hedef protein ekspresyonunu elde etmek için gereken en uygun plazmid miktarlarını belirlemek için bir pilot deney yapılmalıdır.
  3. Lipozomları seyreltmek için başka bir santrifüj tüpünde 4.5 mL azaltılmış serum ortamına 78 μL lipozom transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü hafifçe vurarak iyice karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin.
  4. Seyreltilmiş DNA çözeltisinin 1.5 mL'sini içeren adım 2.2'den itibaren her tüpe 1.5 mL seyreltilmiş lipozom çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve plazmidleri RT'de en az 20 dakika boyunca lipozomlarla çapraz bağlayın. Plazmid DNA'sı kullanın: her transfeksiyon için 1: 2 (μg: μL) lipozom oranı.
  5. Orijinal ortamı Petri kaplarından atın ve her bir kaba 9 mL azaltılmış serum ortamı ekleyin. Her bir kaba 3 mL lipozom-DNA karışımı ekleyin ve plakayı 3x ileri geri hafifçe sallayarak çözeltiyi karıştırın ve daha sonra karışımın plakada eşit dağılımı için 3x sola ve sağa doğru karıştırın.
  6. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO 2 ile 37 ° C'dekültürleyin. Ortamı 4-6 saat sonra değiştirin ve hücreleri 24-36 saat boyunca kültürlemeye devam edin.

3. Hücre toplama

  1. 24-36 saat sonra, hücreleri MG132 ile 4-6 saat boyunca 10 μM'lik son konsantrasyonda tedavi edin.
    NOT: MG132, 26S proteazom kompleksinin proteolitik aktivitesini etkili bir şekilde bloke eden bir peptid aldehittir. Lisin-48 (K48) bağlantılı poliubikitin zincirleri ile ubikitinlenen proteinlerin miktarları, hücreler MG132 veya diğer proteazom inhibitörleri ile tedavi edildikten sonra arttırılabilir.
  2. Ortamı atın, hücreleri 2 kat yıkayın (hücreleri temizlememeye dikkat ederek) buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücreleri serolojik pipetlerle aspire edin.
  3. Kaba 1 mL PBS ekleyin, temiz bir kazıyıcı ile kazıyarak hücreleri çıkarın ve hücre süspansiyonunu mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücre peletlerini toplamak için 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj yapın.

4. Ubikitinlenmiş proteinlerin denatüre olmayan koşullar altında saflaştırılması

  1. Kullanmadan önce proteaz inhibitörü kokteyli ile taze olarak takviye edilmiş Bayrak lizis tamponu (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM etilen diamin tetraasetik asit (EDTA),% 1 Triton X-100,% 0.2 sarkosil ve% 10 gliserol hazırlayın.
  2. Her tüpteki hücrelere 800 μL buz gibi soğuk Bayrak lizis tamponu ekleyin, hücreleri bir vorteks osilatör veya pipet tabancası kullanarak karıştırın ve ardından karışımı 30 dakika boyunca 4 ° C'de bir rotatörde inkübe edin.
  3. Karışımı ultrasonikasyonun 5-10 kısa darbesine maruz bırakın. 20 kHZ sonikasyon frekansında ve% 80 genlikte, 1 s süren her nabız ile buz üzerinde ultrasonikasyon gerçekleştirin. Karışımı bir rotatörde 4 °C'de dakikada 40 devirde (rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Ultrasonize edilmiş örnekleri 8,000 x g'de 20-30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Aliquot 80 μL (1/10) hücre ekstraktı ve 20 μL 5x sodyum dodesil sülfat (SDS) yükleme tamponu ile karıştırılır. Numuneleri 98 ° C'de 5 dakika kaynatın, 2 dakika buz üzerinde soğutun ve kullanana kadar -20 ° C'de saklayın. Bu örnekleri, protein ekspresyonunu izlemek için giriş grubu olarak kullanın.
  6. Kalan hücre ekstraktlarına 30 μL anti-Bayrak M2 antikor konjuge (Bayrak / M2) boncuk ekleyin ve en az 4 saat veya gece boyunca 4 ° C'de bir rotatör üzerinde inkübe edin.
  7. Boncukları toplamak için 1.500 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüj. Boncuklara 1 mL buz gibi soğuk Bayrak lizis tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
  8. Boncukları toplamak için 1.500 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüj. Adım 4.7'yi 4-6 kez tekrarlayın.
  9. Boncuklara 200 ng / μL'lik son konsantrasyonda 40 μL Bayrak peptitleri ekleyin ve bağlı proteinleri etkisiz hale getirmek için 2 saat boyunca 4 ° C'de bir rotatör üzerinde inkübe edin.
  10. 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  11. 10 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, karışımı 5 dakika boyunca 98 ° C'de kaynatın, 2 dakika boyunca buz üzerinde soğutun ve Batı lekelenmesi için -20 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, diğer aşağı akış deneyleri için 4.10 adımındaki elüatı doğrudan -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Saflaştırılmış ubikitinlenmiş proteinlerin miktarı, hücre sayısını ve transfekte edilen plazmid miktarlarını artırarak ölçeklendirilebilir. Bir epitop etiketleme stratejisi, doğal saflaştırma koşulları altında özellikle ubikitinlenmiş p53'e bağlanan hücresel kompleksleri saflaştırmak için uyarlanabilir. Flag-p53, mdm2 ve HA-ubiquitin'i birlikte eksprese ederek, ubikitinlenmiş p53 protein kompleksi, memeli hücrelerinden sıralı Flag ve HA antikoru konjuge agaroz tarafından immünopreçökeltilebilir. Her yerde bulunan p53 proteinlerinin bağlanma ortaklarını tutmak için, saflaştırma işlemi sırasında daha az sıkı BC100 lizis tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl,% 10 gliserol, 0.2 mM EDTA,% 0.2 Triton X-100 ve 1x proteaz inhibitörü) kullanılmalıdır. HA peptidinden elde edilen elüat, özellikle ubikitinlenmiş p53'e bağlanan tüm ortakları tanımlamak için kütle spektrometrisine tabi tutulur.

5. Her yerde bulunan proteinlerin denatüre koşullar altında saflaştırılması

  1. Adım 3.3'te elde edilen hücre peletlerine 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve eşit şekilde karıştırın. Aliquot 100 μL (1/10 hacim) hücre süspansiyonu, giriş numunesi olarak bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir.
  2. Hücre peletlerini toplamak için 4 °C'de 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj yapın. Giriş numunesine 80 μL Bayrak lizis tamponu ekleyin, hücreleri bir vorteks osilatör veya pipet tabancası kullanarak karıştırın ve hücreleri 1 saat boyunca buz üzerinde lize edin.
  3. 4 °C'de 20-30 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj. Aliquot 80 μL süpernatantın yeni bir mikrosantrifüj tüpüne dönüştürülmesi.
  4. Süper natanta 20 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, 5-10 dakika boyunca 98 ° C'de kaynatın, 2 dakika buz üzerinde soğutun ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
  5. Hücre peletini toplamak için hücre süspansiyonunun kalan 900 μL'sini 700 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletlerine 1 mL ubikitin tamponu 1 (UB tamponu 1; 6 M guanidin-HCI, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) ve%0.2Triton X-100, taze olarak 10 mM β-merkaptoetanol ve 5 mM imidazol ile desteklenmiş) ekleyin ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek birkaç kez karıştırın.
    NOT: İmidazol konsantrasyonu, nikel yüklü reçine üzerindeki spesifik olmayan protein bağlanmasını azaltmak için 5 mM ila 20 mM arasında değişebilir. Ubikitin tamponu, hem ligazları hem de DUB'leri inaktive eden guanidin hidroklorür içerir. β-merkaptoetanol, çürük yumurtalara benzer güçlü, hoş olmayan bir kokuya sahip berrak, renksiz bir sıvıdır. Yüksek konsantrasyonlu bir çözelti mukoza zarında, üst solunum yollarında, cilde ve gözlerde ciddi hasara neden olur. Eldiven ve gözlük takın ve duman başlığında çalışın.
  6. Hücre, çözelti artık viskoz olmayana kadar ultrasonikasyonun 10-20 turuna lizatlar. 20 kHZ sonikasyon frekansında ve% 80 genlikte, 1 s süren her nabız ile buz üzerinde ultrasonikasyon gerçekleştirin. RT'de 20-30 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. Süpernatanta 30 μL nikel yüklü reçine ekleyin ve 4 saat boyunca 15 rpm'de ayarlanmış bir rotatörde veya RT'de bir gecede inkübe edin.
  8. 1 mL UB tampon 1 ekleyin, RT'de 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve boncukları toplamak için RT'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın.
  9. Boncuklara 1 mL ubikitin tamponu 2 (UB tamponu 2; 8 M üre, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) ve% 0.2 Triton X-100) ekleyin, RT'de 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve boncukları toplamak için 2dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın. Bunu bir kez daha tekrarlayın.
  10. Boncuklara 1 mL PBS ekleyin, RT'de 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda rotasyonla inkübe edin ve boncukları toplamak için RT'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın. Bunu bir kez daha tekrarlayın.
  11. Boncukları RT'de 1 saat boyunca 0.5 M'lik son konsantrasyonda 40 μL imidazol ile inkübe ederek bağlı proteinler.
  12. Süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, 10 μL 5x SDS yükleme tamponu ekleyin, 5 dakika boyunca 98 ° C'de kaynatın, 2 dakika boyunca buz üzerinde soğutun ve Batı lekelenmesi için -20 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, işlenmemiş elüatı diğer aşağı akış deneyleri için -80 ° C'de saklayın.

6. Batı lekelenmesi ile saflaştırılmış ubikitinlenmiş proteinlerin tespiti

  1. 4.11 ve 5.12. basamaklardaki numuneleri sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile çözün ve daha sonra tarif edildiği gibi karşılık gelen antikorları kullanarak hedef proteinleri tespit etmek için Western blotting ile bir nitroselüloz membrana aktarın18.
  2. Kısacası, TBST tamponunda (15 mM Tris-HCI; pH = 7.6, 4.6 mM Tris-baz, 150 mM NaCI, kullanımdan önce% 0.1 Tween-20 ile taze olarak desteklenmiş) %5 defat süt tozu içeren 20 mL bloke edici çözeltiye 1 saat daldırarak membranı inkübe edin. Daha sonra, membranı RT'de birincil antikorlarla 2 saat veya 4 ° C'de bir gecede inkübe edin. Her set için aşağıdaki antikorları kullanın. Tüm primer antikorlar 1:1000 seyreltmede kullanıldı.
    1. Flag/M2 agaroz boncukları ile immünopresipitasyondan sonra bir anti-p53 monoklonal antikor ile ubikitinlenmiş p53 dahil olmak üzere toplam p53 proteinini tespit edin.
    2. Flag/M2 agaroz boncukları ile immünopresipitasyondan sonra anti-HA antikoru veya anti-ubikitin antikoru ile ubikitinlenmiş p53 proteinlerini tespit edin.
    3. Nikel yüklü reçine pulldown'dan sonra bir anti-p53 monoklonal antikoru ile ubikitinlenmiş p53 proteinlerini tespit edin.
    4. Nikel yüklü reçine pulldown'dan sonra bir anti-HA antikoru veya anti-ubikitin antikoru ile toplam ubikitinlenmiş proteini tespit edin.
  3. Her biri 5 dakika boyunca TBST tamponu ile 3x yıkadıktan sonra membranı RT'de yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonjuge sekonder antikorlarla 1 saat boyunca inkübe edin. Tüm sekonder antikorlar 1:3000 seyreltmede kullanıldı. Ardından, membranı TBST tamponu 3x ile her biri 5 dakika boyunca nazik bir ajitasyonla yıkayın.
  4. Batı lekelenmesinden gelen sinyalleri tespit etmek için kemilüminesans görüntüleme sistemini başlatın. A ve B çözeltilerini 1:1 oranında karıştırarak HRP için substrat çözeltisini hazırlayın.
  5. Nitroselüloz membranı kamera obscura'ya yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve bir pipetleme tabancası kullanarak substrat çözeltisini membran üzerine eşit şekilde kaplayın. Kemilüminesan sinyalleri yakalamak için otomatik pozlama prosedürünü seçin ve ideal bir sinyal elde edilene kadar pozlama süresini manuel olarak ayarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şematik diyagram Bayrak etiketli p53 (Bayrak-p53) ve Onun / HA çift etiketli ubikitin (HH-Ub) proteinlerini göstermektedir (Şekil 1A). Ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için kullanılan prosedürler Şekil 1B'de özetlenmiştir. Poli-His-etiketli ubikitin, memeli hücrelerindeki hedef proteinlere bağlanabilir. Ubikitinlenmiş proteinler, denatüre olmayan koşullar altında Flag/M2 boncukları ile veya denatüre koşullar altında immobilize metal iyonu afinite kromatog...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ubikitinasyon hemen hemen tüm fizyolojik ve patolojik hücresel süreçlerde kritik bir rol oynar2. Son yıllarda, ubikitinin sinyal yolaklarındaki moleküler rolünü ve ubikitin sistemindeki değişikliklerin farklı insan hastalıklarına nasıl yol açtığını anlamada büyük ilerleme kaydedilmiştir2. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, bu süreçlerde ubikitinasyonun kesin rolleri hakkında fikir vermeye katkıda bulunur. Ubikitin konjuge proteinlerin karışımları, denatüre olmayan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (81972624) D.L.'ye verilen bir hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
β-merkaptoetanolSangon BiotechM6250
Amersham ECL Fare IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (koyundan)GE healthcareNA931İkincil antibdoy
Amersham ECL Sıçan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (eşekten elde edilen)GE healthcareNA935İkincil antibdoy
Anti-Flag M2 Afinite JeliSigma-AldrichA2220BAYRAK/M2 boncuklar
Anti-GFP monokolonal antikorSanta cruzsc-9996Birincil antikor
Anti-HA Yüksek AfiniteliRoche11867423001Birincil antikor
Anti-Mdm2 monokolonal antikor (SMP14)Santa cruzsc-965Birincil antikor
Anti-p53 monokolonal antikor (DO-1)Santa cruzsc-126Birincil antikor
EDTASigma-AlddichE5134çözücü
Fetal Sığır SerumuVivaCellC04001-500FBS
BAYRAK PeptitSigma-AlddichF3290Elüsyon tamponu hazırlayın
GlutaMAXGibco35050-061takviyesi
Guanidin-HCISangon BiotechA100287-0500çözücü
H1299Kök Hücre Bankası, Çin Akademisi Sciences
Image LabBio-radyazılımı
ImmidazoleSangon BiotechA500529-0100çözücü
Immobilon Western Kemilüminesan HRP SubstratMilliporeWBKLS0500
Lipofektamin 2000 reaktifleriInvitrogen11668019Transfeksiyon reaktifi
MG132MedChemExpressHY-13259Proteazom inhibitörü
Na2HPO4Sangon BiotechA501727-0500çözücü
NaClSangon BiotechA610476-0005çözücü
NaFSigma-Alddich201154çözücü
NaH2PO4Sangon BiotechA501726-0500çözücü
Ni-NTA AgarozQIAGEN30230nikel yüklü reçine
Nitroselüloz Kurutma membranıGE healthcare106000020.45 & m gözenek boyutu
Opti-MEM azaltılmış serum ortamıGibco31985-070Transfeksiyon ortamı
PBSCorning21-040-cv
Penisilin-Streptomisin ÇözeltisiSangon BiotechE607011-0100antibiyotik
Proteaz inhibitörü kokteyliSigma-AldrichP8340
RPMI 1640Biyolojik Endüstriler01-100-1ACSorta
SarkosylSigma-AlddichL5777çözücü
SDS Yükleme TamponuBeyotimeP0015L
Sodyum PiruvatGibco11360-070takviyesi
Tris-baseSangon BiotechA501492-0005çözücü
Tris-HCISangon BiotechA610103-0250çözücü
Triton X-100Sangon BiotechA110694-0500reaktif
Tween-20Sangon BiotechA100777-0500takviyesi
Ultra Yüksek Hassasiyetli Kemilüminesans Görüntüleme SistemiBio-radChemiDoc XRS +
ÜreSangon BiotechA510907-0500çözücü

Kaynaklar

  1. Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
  2. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  3. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  4. Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
  5. Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
  6. Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
  7. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
  8. Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
  9. Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
  10. Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
  11. Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
  12. Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
  13. Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
  14. Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
  15. Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
  16. Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
  17. Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
  18. Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Ubikitinlenmiş Proteinlerp53 ProteiniProtein UbikitinasyonuProtein SaflaştırmaWestern BlotİmmünopresipitasyonDenatüre KoşullarNikel ReçineFLAG Etiketi
Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.