Zebra Balığı Kornea Yara İyileşmesi: Aşınmadan Yara Kapatma Görüntüleme Analizine

Özet

Bu protokol, hücresel düzeyde sonraki yara kapanmasını değerlendirmek için zebra balıklarının oküler yüzeyine aşınma yoluyla zarar vermeye odaklanır. Bu yaklaşım, kornea epitelini kısmen çıkarmak için bir oküler çapaktan yararlanır ve yara kapanması sırasında hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanır.

Özet

Gözün şeffaf yüzeyi olarak, kornea net görme için etkilidir. Konumu nedeniyle, bu doku çevresel hakaretlere eğilimlidir. Nitekim klinik olarak en sık karşılaşılan göz yaralanmaları korneada görülen yaralanmalardır. Kornea yara iyileşmesi küçük memelilerde (yani fareler, sıçanlar ve tavşanlar) kapsamlı bir şekilde incelenirken, kornea fizyolojisi çalışmaları, zebra balığı klasik bir araştırma modeli olmasına rağmen, zebra balığı da dahil olmak üzere diğer türleri ihmal etmiştir.

Bu rapor, zebra balığı üzerinde kornea aşınması gerçekleştirmenin bir yöntemini açıklamaktadır. Yara, oküler çapak kullanılarak anestezi uygulanan balıklarda in vivo olarak gerçekleştirilir. Bu yöntem, gözün geri kalanını sağlam bırakarak tekrarlanabilir bir epitel yarasına izin verir. Aşınmadan sonra, yara kapanması 3 saat boyunca izlenir, daha sonra yara reepitelize edilir. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak, ardından görüntü işleme, epitel hücre şekli ve apikal çıkıntılar, kornea epitel yarası kapanması sırasında çeşitli adımları incelemek için araştırılabilir.

Zebra balığı modelinin özellikleri, epitel dokusu fizyolojisinin ve dokuya meydan okunduğunda epitel hücrelerinin kolektif davranışının incelenmesine izin verir. Ayrıca, gözyaşı filminin etkisinden yoksun bir modelin kullanılması, korneanın strese tepkisi ile ilgili yeni cevaplar üretebilir. Son olarak, bu model aynı zamanda fiziksel bir yaraya maruz kalan herhangi bir epitel dokusunda yer alan hücresel ve moleküler olayların tanımlanmasına da izin verir. Bu yöntem, preklinik testlerde ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde uygulanabilir.

Giriş

Epitelyaların çoğu dış çevre ile temas halinde olduğundan, fiziksel yaralanmaya eğilimlidirler, bu da onları yara iyileşme süreçlerinin incelenmesi için çok uygun hale getirir. İyi çalışılmış dokular arasında kornea, yara iyileşmesinin hücresel ve moleküler yönlerinin araştırılmasında son derece yararlı bir modeldir. Şeffaf bir dış yüzey olarak göze fiziksel koruma sağlar ve ışığı retinaya odaklayan ilk unsurdur. Retinanın yapısı ve hücre bileşimi tür¹ arasında farklılık gösterirken, korneanın bu elementleri, türlerden bağımsız olarak tüm kamera tipi gözlerde genellikle benzerdir.

Kornea üç ana tabakadan oluşur

Protokol

Tüm deneyler ulusal hayvan deney kurulu tarafından onaylandı.

1. Hazırlıklar

1. Anestezi²⁶ için kullanılan trikain stok çözeltisini önceden hazırlayın (bu protokolde kullanılan% 0.4 stok çözeltisi). Eldiven kullanın ve malzemeleri mümkün olduğunca bir duman başlığında tutun.
   1. % 0.4'lük bir çözeltinin 50 mL'si için, 50 mL'lik bir tüpe 200 mg trikain tozu tartın. Tozu yaklaşık 45 mL çift damıtılmış suda çözün.
   2. Trikain stok çözeltisinin pH'ını 1 M Tris (pH 8.8, ~ 1.25 mL) ile 7'ye ayarlayın. Tris çözeltisini alikotlardaki trikain stoğuna ekleyin, her alikottan sonra stoğu iyice ....

Sonuçlar

Bu çalışmada, zebra balığı kornea yara iyileşmesi deneylerinde oftalmik çapak kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, çapağın epitel hücre katmanlarını verimli bir şekilde çıkardığı gösterilen fareler üzerindeki önceki çalışmalardan modifiye edilmiştir¹³. Zebra balığı kornea yaralanmasındaki zorluklar, gözün nispeten küçük boyutunu ve zaman alıcı deneyler durumunda, solungaçlardan sabit bir su akışını sürdürme ihtiyacını içerir (Xu ve meslektaşları tarafından açıklandığı gibi

Tartışma

Kornea fiziksel yaralanmaları, oftalmoloji hastalarının hastaneye ziyaretlerinin en sık nedenidir. Bu nedenle, kornea patofizyolojisinin farklı yönlerinin incelenmesi için ilgili modellerin oluşturulması önemlidir. Şimdiye kadar, fare kornea yara iyileşmesi çalışması için en yaygın kullanılan modeldir. Bununla birlikte, belirli ilaçların kornea yarasının iyileşmesi üzerindeki etkisini doğrulamak için murin yaralı gözlere göz damlası eklemek zor olabilir. Bu bakımdan, zebra balığı modeli, kornea yarasının iyileşmesini etk.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.1M Na-PO < alt > < / alt > (sodyum fosfat tamponu), pH 7.4	kurum		Çözelti, 1M sodyum fosfat tamponundan (1M Na2 < / sub>HPO4 < / sub> 1M NaH ile pH 7.4'e ayarlanmış < > < / sub>PO4 < / sub>) ile hazırlanır.
0.2M Na-PO < alt > 4 < / alt > (sodyum fosfat tamponu), pH 7.4	kurum		Çözelti, 1M sodyum fosfat tamponundan (1M Na2 < / sub>HPO4 < / sub> 1M NaH < / sub>PO4 < / sub>) ile pH 7.4'e ayarlanır.
0,5 mm çapak uçları	Alger Ekipman Şirketi	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	şirket
yapışkan sekmeler	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush çapak, Komple cihaz Alger	Equipment Company	BR2-5
Pamuk takasları	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Diseksiyon plakası
Diseksiyon araçları	Güzel Bilim Araçları
içi			çift damıtılmış su
Eppedorf tüpleri, 2ml	herhangi bir sağlayıcı
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu	Sigma	A5040	Dikkat: tahrişe neden olur.
Gluteraldehit, %50 sulu çözelti, derece I	Sigma	G7651	Dikkat: toksik.
Lidokain hidroklorür	Sigma	L5647	Dikkat: toksik.
Agar Scientific	G301P
Petri kabı	Thermo Scientific	101VR20
pH indikatör şeritleri	monte eder Macherey-Nagel	92110
Plastik kaşıklar	herhangi bir sağlayıcı
Plastik tüpler, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastik tüpler, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Taramalı elektron mikroskobu	FEI	Quanta 250 FEG
Yumuşak sünger	herhangi bir sağlayıcı
Püskürtme kaplayıcı	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomikroskop	Leica

içi içi içikurum içişirket