Yöntem makalesi

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

DOI:

10.3791/63614

⸱

13 Mayıs 2022

 ,  , 
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV'ler), tüm hücrelerden salınan, tüm biyoakışkanlarda bulunan ve türetildikleri ana hücreyi yansıtan proteinler, nükleik asitler ve lipitler içeren nano boyutlu lipit-membrana bağlı yapılardır. EV'lerin bir numunedeki diğer bileşenlerden uygun şekilde ayrılması, ilişkili kargolarının karakterizasyonuna izin verir ve sayısız hastalık için hücreler arası iletişimciler ve invaziv olmayan biyobelirteçler olarak potansiyelleri hakkında fikir verir. Bu çalışmada, oligodendrosit türevi EV'ler, EV'leri diğer hücre dışı proteinlerden ve protein komplekslerinden ayırmak için ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) dahil olmak üzere en son tekniklerin bir kombinasyonu kullanılarak hücre kültürü ortamından izole edildi. Ticari olarak temin edilebilen SEC kolonları kullanılarak, EV'ler hem kontrol hem de endoplazmik retikulum (ER) stres koşulları altında insan oligodendroglioma hücrelerinden salınan hücre dışı proteinlerden ayrıldı. Kanonik EV belirteçleri CD9, CD63 ve CD81, 1-4 fraksiyonlarında gözlendi, ancak 5-8 fraksiyonlarında gözlenmedi. Golgi aparatının bir proteini olan GM130 ve ER'nin ayrılmaz bir proteini olan kalneksin, negatif EV belirteçleri olarak kullanıldı ve herhangi bir fraksiyonda gözlenmedi. Ayrıca, EV fraksiyonu olarak 1-4 fraksiyonlarını ve protein fraksiyonu olarak 5-8 fraksiyonlarını bir araya getirip yoğunlaştırırken, EV fraksiyonunda CD63, CD81 ve CD9 ekspresyonu gözlenmiştir. GM130 veya kalneksin ekspresyonu, fraksiyon tiplerinin hiçbirinde gözlenmedi. Hem kontrol hem de ER stres koşullarından toplanan fraksiyonlar transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirildi ve veziküller EV fraksiyonlarında gözlendi, ancak protein fraksiyonlarında gözlenmedi. EV'deki parçacıklar ve her iki koşuldan protein fraksiyonları da nanopartikül izleme analizi ile ölçüldü. Birlikte, bu veriler SEC'in EV'leri şartlandırılmış hücre kültürü ortamından ayırmak için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı vezikülleri (EV'ler) incelemeye olan ilginin patlamasına, bu nano boyutlu, heterojen parçacıkları ayırmak ve incelemek için kullanılan teknoloji ve tekniklerdeki büyük gelişmeler eşlik etmiştir. Yaklaşık kırk yıl önce 1,2 keşfedilmelerinden bu yana geçen sürede, bu küçük membranöz yapıların biyoaktif lipitler, nükleik asitler ve proteinler içerdiği ve hücreler arası iletişimde önemli roller oynadığı bulunmuştur 3,4. EV'ler tüm hücre tiplerinden salınır ve bu nedenle kan plazması ve serum, tükürük ve idrar dahil olmak üzere tüm biyolojik sıvılarda bulunur. Bu sıvıların içindeki EV'ler, nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalıklar, kanserler ve otoimmün bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için invaziv olmayan biyobelirteçler olarak hizmet etme konusunda büyük umut vaat etmektedir 5,6,7. Ayrıca, in vitro mekanik çalışmalar, kültür ortamı 3,8,9'a salınan EV'leri ayırarak hücre kültürü teknikleri aracılığıyla gerçekleştirilebilir.

EV'lerin hastalık patofizyolojisindeki rolünü anlamak için, bulundukları sıvıdan yeterli ayrılma çok önemlidir. EV ayırma için altın standart uzun zamandır diferansiyel ultrasantrifüjleme (dUC)10 olmuştur, ancak EV'lerin diğer hücre dışı bileşenlerden daha iyi ayrılmasını sağlamak için daha sofistike teknikler ortaya çıkmıştır. Bu tekniklerden bazıları yoğunluk gradyanları, asimetrik akış alanı-akış fraksiyonu (A4F), akış sitometrisi, immünocapture, polietilen glikol çökeltmesi ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) 11,12,13'tür. Her tekniğin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır; Bununla birlikte, özellikle SEC'in EV'leri hem biyolojik sıvılardan hem de hücre kültürü süpernatantlarından oldukça etkili bir şekilde ayırdığı gösterilmiştir 8,14,15. SEC ayrıca nispeten basit ve kullanıcı dostu olma bonusuna sahiptir.

SEC, bir sıvının bileşenlerini boyuta göre ayıran bir yöntemdir. Bu teknikle, bir numuneyi fraksiyone etmek için bir reçine sütunu (şirket içinde yapılan veya ticari olarak satın alınan) kullanılır. Numunedeki küçük parçacıklar reçine içindeki boncuklar arasında sıkışıp kalırken, daha büyük parçacıklar reçineden daha serbest bir şekilde geçebilir ve böylece işlemin başlarında ortaya çıkabilir. EV'ler birçok hücre dışı proteinden ve protein agregalarından daha büyük boyuttadır, EV'ler kolondan daha hızlı geçer ve hücre dışı proteinlerden daha erken fraksiyonlarda süzülür14.

Bu yöntem makalesinde, EV'lerin hücre kültürü ortamından (CCM) hem kontrol hem de endoplazmik retikulum (ER) stres koşulları altında insan oligodendrositlerinden ayrılması için SEC'in kullanımı özetlenmiştir. Bu protokolü kullanarak, bu teknikle ayrılan EV'lerin, birlikte toplanabilen ve aşağı akış karakterizasyonu için konsantre edilebilen spesifik fraksiyonlar içinde bulunduğu ve ayrılan EV'lerin, CCM'yi desteklemek için kullanılan fetal sığır serumu (FBS) gibi eksojen bir kaynaktan değil, hücrelerden türetildiği gösterilmiştir. EV fraksiyonlarında kanonik EV belirteçleri, CD63, CD81 ve CD916,17,18,19'un varlığı ve protein fraksiyonlarında yokluğu batı lekelenmesi ile gösterilmiştir. İletim elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak, EV'ler görselleştirilir ve beklenen morfolojiyi gösterir ve sadece EV fraksiyonunda gözlenir. Parçacıklar ayrıca hem kontrol hem de ER stres koşullarının EV ve protein fraksiyonlarında sayılır ve EV numunelerinde 50-200 nm çapında beklenen boyut aralığında çok sayıda parçacık gözlenir. Birlikte, bu veriler SEC'in EV'leri hücre kültürü ortamından ayırmak için etkili ve etkili bir yöntem olduğu fikrini desteklemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

NOT: Steriliteyi korumak için hücre kültürü reaktiflerini hücre kültürü davlumbazında yapın.

  1. Hücre kültürü reaktiflerinin hazırlanması
    1. 500 mL yüksek glikoz DMEM'ine 50 mL FBS ve 5 mL penisilin-streptokok (Pen-Strep) ekleyerek normal yüksek glikoz DMEM'i hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Hücreleri kültürlemek ve genişletmek için bu ortamı kullanın.
    2. 500 mL yüksek glikoz DMEM'ine 50 mL eksozom tükenmiş FBS ve 5 mL Pen-Strep ekleyerek eksozom tükenmiş yüksek glikoz DMEM'i hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Bu medyayı EV izolasyonundan önce hücre tedavileri için kullanın.
    3. 1 mL dimetil sülfoksite (DMSO) 10 mg tunikamisin ekleyerek tunikamisin hazırlayın. 0,2 mL tüplerde 50 μL alikot yapın ve -20 ° C'de saklayın.
  2. EV ayırma reaktiflerinin hazırlanması
    1. 1 L dereceli bir silindirde 1 L deiyonize (DI) suya 9.89 g PBS tozu ekleyerek 1x fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. PBS çözünene kadar çözeltiyi bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın.
    2. PBS eklemeden önce cam eşyaları sterilize etmek için otoklav kullanın. Cam eşyaları bir kutuya koyun, kapıyı kapatın ve 121 ° C'de 30 dakika sterilize edin.
    3. Laminer akış kabininin içinde, 0,22 μm filtreye bir vakum bağlayın ve filtreyi otoklavlanmış şişenin üzerine yerleştirin. PBS'yi yavaşça filtrenin üzerine dökün ve filtrelenmiş PBS'yi otoklavlanmış şişede toplayın.
    4. 500 mL dereceli bir silindirde 500 mL 1x PBS'ye 9.99 g sodyum hidroksit ekleyerek 0.5 M sodyum hidroksit hazırlayın. Sodyum hidroksit PBS'ye çözünene kadar çözeltiyi bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın ve ardından 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak otoklavlanmış 500 mL'lik bir şişeye filtreleyin.
    5. 500 mL dereceli bir silindirde 500 mL 1x PBS'ye 0.25 g sodyum azid ekleyerek% 0.05 sodyum azid hazırlayın. Sodyum azid PBS'ye çözünene kadar çözeltiyi bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın ve ardından 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak otoklavlanmış 500 mL'lik bir şişeye filtreleyin.
  3. Protein izolasyonunun hazırlanması, miktarının belirlenmesi ve tanımlanması reaktifleri
    1. 1 mL 1 M Tris (pH 7.4), 1 mL% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS), 1 g deoksikolat, 1 mL NP-40 ve 0.89 g sodyum klorür (NaCl) birleştirerek 100 mL RIPA lizis tamponu hazırlayın. DamıtılmışH2O ile hacmi 100 mL'ye getirin ve 4 °C'de saklayın. RIPA artı fosfataz ve proteaz inhibitörü çözeltisi yapmak için, 15 mL'lik bir tüpte her 1 mL RIPA tamponu için 10 μL fosfataz ve proteaz inhibitörü ekleyin ve çözeltiyi 4 ° C'de saklayın.
    2. Kullanımdan hemen önce, BCA tahlil kiti tarafından sağlanan 10 mL reaktif A ve 200 μL reaktif B ekleyerek BCA tahlili çalışma reaktifini 15 mL'lik bir tüpe hazırlayın. Kullanımdan hemen önce, 15 mL'lik bir tüpe 25 parça reaktif A, 24 parça reaktif B ve 1 parça reaktif C ekleyerek mikroBCA testi çalışma reaktifini hazırlayın.
    3. 1 L DI suya 30.3 g Tris bazı, 144 g glisin ve 10 g SDS ekleyerek 10x jel elektroforez çalışma tamponu hazırlayın. Çalışan tamponu 4 °C'de saklayın. 3.03 g Tris bazı, 14.4 g glisin ve 200 mL metanol ekleyerek 1x transfer tamponu hazırlayın ve hacmi DI su ile 1 L'ye ayarlayın. Transfer tamponunu 4 °C'de saklayın.
    4. 1 L DI suyuna 2.4 g Tris bazı, 8 g NaCl ve 1 mL Tween-20 ekleyerek Tris tamponlu salini Tween-20 (TBS-Tween) ile hazırlayın. TBS-Ara'yı 4 °C'de saklayın.
    5. 100 mL TBS-Ara'ya 5 g toz yağsız süt ekleyerek% 5 bloke edici çözelti hazırlayın. Blokaj tamponunu 4 °C'de saklayın.
    6. Kullanımdan hemen önce, 15 mL'lik bir tüpe 4 mL peroksit çözeltisi ve 4 mL luminol / arttırıcı çözeltisi ekleyerek kemilüminesan substratı hazırlayın ve karıştırmak için yavaşça ters çevirin.

2. Hücrelerin kültürlenmesi ve işlenmesi

  1. Her biri 2.3 x 106 insan oligodendroglioma (HOG) hücresine sahip iki T175 hücre kültürü şişesini tohumlayın. Normal yüksek glikoz DMEM'in son hacmini 25 mL'ye getirin ve 48 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
  2. 48 saatin sonunda, 37 ° C'lik bir su banyosunda ılık eksozom tükenmiş yüksek glikoz DMEM. Tedavi için, 25 mL eksozom tükenmiş ortama 25 μL 10 mg / mL tunikamisin, ER stresini indüklemek için son konsantrasyonda 10 μg / mL tunikamisin ekleyin. Kontrol için, 25 mL eksozom tükenmiş ortama 25 μL DMSO ekleyin.
  3. Normal yüksek glikoz DMEM'ini hücrelerden çıkarın ve atın ve hücreleri nazikçe durulayın ve 10 mL 1x PBS ile şişeleyin. PBS'yi aspire edin ve atın.
  4. Kontrol etiketli şişeye 25 mL kontrol ortamı ve şişe etiketli işleme 25 mL 10 μg/mL tunicamisin ekleyin. Şişeleri 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri döndürün.

3. Şartlandırılmış CCM'nin toplanması ve konsantrasyonu (Şekil 1)

  1. PBS'yi 37 °C su banyosuna yerleştirin. Şişeleri 10x ve 100x objektif lensli bileşik bir mikroskop altında gözlemleyin. Şişeler arasındaki farkları not alın. Hem kontrol hem de işlem görmüş şişeler için aşağıdaki adımları uygulayın.
  2. Medyayı şişeden çıkarın ve 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir 50 mL tüpe aktarın.
  3. Tüpü 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir 50 mL tüpe aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
  4. Dört adet 15 mL 3 kDa kesme ultrafiltrasyon ünitesi elde edin ve her tüpe 5 mL PBS ekleyin. Ultrafiltrasyon ünitelerini 4 ° C'de 10 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj ederek filtreyi astarlayın.
    NOT: Hücrelerden salınan tüm hücre dışı proteinleri tutmak için mevcut protokolde 3 kDa moleküler ağırlık kesme ultrafiltrasyon üniteleri kullanılmıştır. Daha büyük moleküler ağırlıklı kesme ultrafiltrasyon üniteleri (örneğin, 30 kDa) da bu protokolle çalışacaktır, ancak 30 kDa'dan küçük hücre dışı proteinler filtrelenecek ve20,21 örneklerinden çıkarılacaktır.
  5. PBS'yi ultrafiltrasyon birimlerinden çıkarın. Süpernatantı her koşuldan (kontrol ve tunikamisin ile muamele edilmiş) her biri iki ultrafiltrasyon ünitesine, her birinde yaklaşık 12.5 mL ortama bölün.
  6. Tüpleri 4.000 x g'de 4 ° C'de 1 saat 45 dakika boyunca veya her ultrafiltrasyon ünitesindeki konsantre ortam (retentat olarak adlandırılır) 250 μL veya daha azına konsantre olana kadar santrifüj edin.
  7. Retentatı her iki kontrol ultrafiltrasyon ünitesinden etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Retentatı her iki işlenmiş ultrafiltrasyon ünitesinden başka bir etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  8. Her mikrosantrifüj tüpündeki retentatın toplam hacmini 500 μL olacak şekilde ölçün. Numune 500 μL'den küçükse, son hacim 500 μL olana kadar 0,22 μm filtrelenmiş 1x PBS ekleyin.

4. Hücre toplama

  1. Tripsin, PBS ve eksozom tükenmiş DMEM'i 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Hem kontrol hem de tedavi şişelerine 7 mL tripsin ekleyin ve 5 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.
  2. Hücrelerin kaldırılıp kaldırılmadığını görmek için mikroskop altında görüntüleyin. Hücreler kaldırılmazsa, hücreleri yerinden çıkarmak için şişeyi elin avucuna sıkıca dokunun.
  3. Şişeyi 7 mL eksozom tükenmiş DMEM ile yıkayın. Şişedeki hücre süspansiyonunu toplayın ve 15 mL tüplere yerleştirin.
  4. Tüpleri 4 °C'de 500 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletine 5 mL 1x PBS ekleyin. Peletin parçalanması için pipetle hafifçe karıştırın.
  5. Tüpleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletine, karıştırmak için pipete 200 μL RIPA artı fosfataz ve proteaz inhibitörü çözeltisi ekleyin.
  6. RIPA çözeltisindeki hücreleri 1,5 mL tüplere aktarın. Tüpleri 5 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Tüpleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın.
  7. Süpernatantı yeni 1,5 mL tüplere aktarın. Tüpleri tedavi durumu ve tarihi ile etiketleyin. Tüpleri -80 °C dondurucuya yerleştirin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

5. Boyut dışlama kromatografisi kullanılarak EV ayrımı (Şekil 2)

NOT: Aşağıdaki adımları iki kez, bir kez kontrol retentat için ve bir kez tunikamisin ile tedavi edilmiş retentat için gerçekleştirin.
NOT: Bu bölümde kullanılan PBS, 0,22 μm filtrelenmiş 1x PBS'dir.

  1. Otomatik kesir toplayıcıyı (AFC) açın ve sekiz kesir, kesir başına 0,5 mL ve arabellek (boşluk) ses seviyesini varsayılan olarak toplamak için ayarları yapın.
    NOT: AFC çalışma koşulları aşağıdaki gibidir: sütun/yatak hacmi = 10 mL; boşluk hacmi = 2,70 mL; yıkama hacmi = 15 mL; optimal fraksiyon boyutu = 500 μL; çalıştırma başına gerekli tampon = 65 mL; 20 °C'de akış hızı = 1,0 mL/dak; sütunun yeniden kullanılabilirliği = beş kullanım.
  2. Kolonu 4 °C'den çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve başlamadan önce (genellikle ~ 30 dakika) sütunun oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
  3. Retentat numunelerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve çözülmesi için buzun üzerine yerleştirin. Beklerken, AFC atlıkarınca içinde kapakları içe dönük olacak şekilde sekiz adet etiketli 1,5 mL tüp yerleştirin.
  4. Barkodu okuyucuya bakacak şekilde AFC'ye sütun yerleştirin. Atlıkarınca içinde tüpler olduğunu ve atık toplayıcının düzgün çalıştığını doğrulamak için ekrandaki talimatları izleyerek toplamaya başlayın.
  5. Depolama arabelleği sütun matrisinin üst kısmına tamamen emildikten sonra sütuna 15 mL 1x PBS ekleyerek sütunu temizlemeye başlayın. PBS'yi çok erken eklemeyin, çünkü bu depolama arabelleğini seyreltir ve yeterli yıkamayı önler.
  6. 15 mL'lik PBS'nin tamamı matris tarafından emilmeden hemen önce, yıkamayı durdurmak ve sütun matrisinin üst kısmındaki artık PBS'yi bir mikropipetle çıkarmak için Tamam'ı tıklatın. Matrise dokunmayın.
  7. Kolonun ortasına 500 μL örnek ekleyin. Çalıştırmaya başlamak için Tamam'ı tıklatın. Numunenin matrise emilmesini izleyin ve numune tamamen emildikten hemen sonra sütuna hızlı bir şekilde 8 mL PBS ekleyin.
  8. AFC, boşluk hacmini otomatik olarak atlıkarınca merkezine atar ve ardından her biri 500 μL'lik sekiz fraksiyonun tümünü toplar. Koşunun sonunda, atlıkarınca kesirlerini çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. 1-4 fraksiyonları EV'leri içerirken, 5-8 fraksiyonları hücre dışı proteinler içerir. Döngünün ortasından boşluk hacmini kaldırın.
  9. Sütundan kalan herhangi bir örneği yıkamak için sekiz fraksiyon toplandıktan sonra sütuna 10 mL PBS ekleyin. Retentate örneği sütundan tamamen temizlendikten sonra, sütuna 15 mL 1x PBS ekleyin.
  10. Son PBS matris tarafından emildiğinden, kolonun matrisinin merkezine 500 μL 0,5 M sodyum hidroksit ekleyin. Sodyum hidroksit emildiğinde, kolona 30 mL 1x PBS ekleyin ve akmasına izin verin.
  11. Başka bir numune çalıştırıyorsanız, döngüye sekiz adet etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü ekleyin ve 5,7-5,10 arasındaki adımları tekrarlayın.
  12. Tüm örneklerle işiniz bittiğinde, sütunu daha sonra kullanmak üzere korumak için aşağıdaki adımları tamamlayın. Adım 5.10'da belirtildiği gibi sütundan 30 mL PBS akıttıktan sonra, sütuna 15 mL% 0.05 sodyum azid ekleyin.
  13. Kolon matrisinin üstüne yaklaşık 5 mL sodyum azid bırakın. Sütunu AFC'den çıkarın ve üst ve alt kapakları takın. Depolama için sütunu 4 ° C'ye geri yerleştirin (sütun beş defaya kadar kullanılabilir).

6. EV ve protein fraksiyonlarının ultrafiltrasyonu

  1. Numune başına iki adet 2 mL, 3 kDa kesme ultrafiltrasyon ünitesi elde edin. EV fraksiyonlarını (fraksiyonlar 1-4) konsantre etmek için bir birim ve protein fraksiyonlarını (fraksiyonlar 5-8) konsantre etmek için diğerini kullanın. Her ünite üç bölümden oluşur: koni, filtre ve akış silindiri; her parçayı düzgün bir şekilde etiketleyin.
  2. Ultrafiltrasyon ünitesini oluşturun ve filtre kısmına 1 mL 0,22 μm filtrelenmiş 1x PBS ekleyin ve koni parçasıyla kapatın. Ultrafiltrasyon ünitesini, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3.500 x g'de koni tarafı yukarı doğru santrifüj edin.
  3. Filtrelenmiş PBS'yi akış silindirinden çıkarın. Ultrafiltrasyon ünitesini baş aşağı çevirin (koni tarafı aşağı) ve 4 °C'de 1.000 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Kalan PBS'yi koniden çıkarın.
  4. Her ultrafiltrasyon ünitesine uygun fraksiyonları (500 μL hacmin tamamı) ekleyin (toplam hacim 2 mL olacaktır). Santrifüj sütunları, 4 ° C'de 3.500 x g'de 1 saat 45 dakika boyunca veya retentat seviyesi 100 μL'de olana kadar koni tarafı yukarı doğru uzanır.
  5. Akış silindirini çıkarın ve içinden akışı atın. Ultrafiltrasyon ünitesini baş aşağı çevirin (koni tarafı aşağı) ve 4 °C'de 1.000 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın.
  6. Konideki retentatı etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve her numune hacmini 0,22 μm filtrelenmiş 1x PBS ile 150 μL'ye getirin. Tüpleri -80 °C dondurucuya yerleştirin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

7. Medya kontrolleri

  1. İki T175 hücre kültürü şişesi elde edin. Bir şişe kontrolünü ve diğer tedaviyi etiketleyin. 37 °C su banyosunda ılık eksozom tükenmiş yüksek glikoz DMEM.
  2. 25 mL ortama 25 μL tunikamisin stok çözeltisi (10 mg / mL) ekleyin ve şişe etiketli işleme koyun. 25 mL ortama 25 μL DMSO ekleyin ve şişe etiketli kontrole koyun. Şişeleri 24 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe tutun.
  3. 3.2-3.8 numaralı adımlarda belirtildiği gibi EV'leri ayırmak için medya ve süreç toplayın. Daha sonra, bölüm 5 ve 6'da açıklanan tüm adımları gerçekleştirin.

8. Batı lekelenmesi

  1. BCA testi ile hücre lizatlarından ve protein fraksiyonlarından protein nicelleştirmesi
    NOT: Hem kontrol hem de tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerden protein niceliği aşağıdaki adımlarla gerçekleştirilir.
    1. Lize edilmiş hücreleri ve protein fraksiyonlarını buz üzerinde çözün. Her numune için üç seyreltme tüpü yapın; 1:2, 1:10 ve 1:100.
    2. 96 kuyucuklu berrak tabanlı bir tahlil plakasına, 25 μL sığır serum albümini (BSA) protein standartlarına ve her numune seyreltmesinin 25 μL'sine üçlü olarak yükleyin. Çok kanallı pipet kullanarak standart veya numune içeren her bir kuyucuğa 200 μL çalışma reaktifi ekleyin.
    3. Plakayı 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından plakayı 562 nm emici bir plaka okuyucu ile okuyun. Her numunedeki protein konsantrasyonunu hesaplayın ve hücre lizatları için 20 μg protein ve protein fraksiyonları için 15 μg protein elde etmek için gereken numune hacmini belirleyin.
  2. MikroBCA testi ile EV fraksiyonlarından protein nicelleştirme
    1. EV örneklerini buz üzerinde çözün. Her örnek için iki seyreltme yapın: 1:50 ve 1:100.
    2. 96 kuyucuklu şeffaf tabanlı bir tahlil plakasına, 100 μL BSA protein standartlarına ve her numune seyreltmesinin 100 μL'sine üçlü olarak yükleyin. Çok kanallı pipet kullanarak standart veya numune içeren her bir kuyucuğa 100 μL microBCA çalışma reaktifi ekleyin.
    3. Plakayı 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından plakayı 562 nm emici bir plaka okuyucu ile okuyun. Her numunedeki protein konsantrasyonunu hesaplayın ve EV fraksiyonları için 15 μg protein elde etmek için gereken numune hacmini belirleyin.
  3. Batı lekelenmesi
    NOT: Batı lekeleme protokolü22'de açıklananlara benzer şekilde gerçekleştirilmiş ve aşağıda belirtildiği gibi değiştirilmiştir.
    1. Üreticinin talimatlarını kullanarak, jel yapım kiti ile% 10 poliakrilamid jeller yapın.
    2. Jel elektroforezi için, 1.5 mL'lik bir tüpte, 20 μg protein için gerekli hücre lizatının hacmini, 5 μL 4x Laemmli tamponunda ve toplam hacmi 20 μL'ye getirmek için gerekli RIPA tamponunun hacmini birleştirerek hücre lizat örnekleri hazırlayın.
    3. 15 μg protein, 5 μL 4x Laemmli tamponu ve RIPA tamponu için gerekli numune hacmini 1,5 mL'lik bir tüpte birleştirerek EV ve protein fraksiyonu numuneleri hazırlayın.
    4. 1,5 mL'lik bir tüp 15 μL numune ve 5 μL 4x Laemmli tamponunda birleştirerek ortam kontrol numuneleri hazırlayın.
      NOT: Kullanılacak antikorlara bağlı olarak, Laemmli tamponunun 50 mM ditiyotreitol (DTT) gibi bir indirgeyici ajan içermesi gerekebilir veya gerekmeyebilir.
    5. Tüm numuneleri 95 ° C'de 5 dakika kaynatın, numuneleri soğuması için buza aktarın ve 10.000 x g'de 30 s için kısaca santrifüj yapın, ardından numuneleri buza geri verin.
    6. Elektroforez tankına jeller ekleyin ve 1x jel elektroforez çalışma tamponu ekleyin. 15 μL protein merdiveni ve 20 μL numune yükleyin. Jeli 200 V'ta 30-50 dakika boyunca veya numuneler jelin dibine ulaşana kadar, akmadan hemen önce çalıştırın.
    7. Proteini, 100 V'ta 30 dakika boyunca veya transfer tamamlanana kadar 4 ° C'de 1x transfer tamponu olan bir PVDF membranına aktarın. Ek Şekil 1, Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3, transfer tamamlandıktan sonra her lekenin lekesiz görüntülerini gösterir.
    8. Membranı %5 süt/TBS-Ara'da oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat boyunca bloke edin. Membranı birincil antikor çözeltisinde gece boyunca 4 ° C'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Antikor seyreltme bilgileri için Tablo 1'e bakınız.
    9. Ertesi gün, birincil antikoru çıkarın ve membranı 3x TBS-Tween ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde yıkayın.
    10. % 5 süt / TBS-Ara'da uygun ikincil antikorları hazırlayın. Seyreltme bilgileri için Tablo 1'e bakın. Membrana ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin, ardından bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca TBS-Tween ile 3x yıkayın.
    11. Membrana kemilüminesan substrat ekleyin ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Kolorimetrik ve kemilüminesan analiz kullanılarak görüntü lekesi. Ek Şekil 4, Ek Şekil 5 ve Ek Şekil 6, her lekenin kırpılmamış görüntülerini gösterir.

9. TEM görüntüleme

  1. Hidrokarbonları uzaklaştırmak ve ızgaraları hidrofilik hale getirmek için23 400 örgü karbon / formvar kaplı ızgaraları kızdırma deşarjı.
  2. Izgaralara 5 μL EV veya protein fraksiyonu örneği ekleyin. Izgaraları oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Filtre kağıdı ile fitil yaparak fazla çözeltiyi çıkarın. Izgaraları 5 μL nanosaf su ile yıkayın ve fazlalığı fitil ile temizleyin.
  4. 5 μL% 1 sulu uranil asetat uygulayın ve hemen fitil yapın. Izgaraların kurumasına izin verin. Bir iletim elektron mikroskobunda 120 kV'luk görüntü ızgaraları ve yüklü çift cihaz kamerasıyla görüntü yakalar.

10. Nanopartikül izleme analizi (NTA)

  1. -80 °C'den EV ve protein fraksiyonu örnekleri alın ve buz üzerinde çözün.
  2. Bilgisayarı ve NTA aygıtını açın. NTA yazılımını açtığınızda otomatik olarak başlatılmaya başlayacaktır.
  3. Parçacıksız su içeren uygun pompayı seçin ve hücreyi durulamak için Cihazı Durula'ya tıklayın. Durulama sırasında, bir şırınga kullanarak aletin önündeki enjeksiyon portuna 10-20 mL parçacıksız su enjekte edin ve hava kabarcıklarından kaçının.
  4. Hücre kalitesi kontrol ekranı açılacaktır; tıklayın Tamam ve hücre kalitesi kontrolü başlayacaktır. Kontrol başarıyla geçildikten sonra, otomatik hizalama açılır ekranı görünecektir: Lütfen hücreyi 100 nm hizalama süspansiyonu ile doldurun (seyreltme 1: 250.000).
    1. Bir tüpe 10 mL parçacıksız su ve 10 μL 100 nm polistiren boncuk ekleyerek hizalama süspansiyonunun seyreltme 1'ini hazırlayın (1:1.000 seyreltme). Karıştırmak için yavaşça ters çevirin. Seyreltme 1, 4 °C'de 2-3 günlük raf ömrüne sahiptir.
    2. 1:250.000 seyreltme oluşturmak için bir tüpe 20 mL parçacıksız su ve 80 μL seyreltme 1 (1:1.000) ekleyerek hizalama süspansiyonunun seyreltme 2'sini oluşturun. Karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin. Seyreltme 2, oda sıcaklığında 30-60 dakika raf ömrüne sahiptir.
  5. Hücreyi 2 mL seyreltme 2 (1:250.000) ile doldurun. Tamam'a tıkladığınızda program otomatik hizalamayı (odak) ve odak optimizasyonunu tamamlayacaktır. Analiz sekmesi, bir paraboldeki ölçüm hücresinin temizliğinin ve simetrisinin sonuçlarını sağlayan bir profil oluşturarak açılacaktır. Bir açılır ekran şunları belirtir: Video Mikroskobunu Görüntüle artık deneyler için hazır, görünecektir; Tamam'ı tıklattığınızda program hücre denetimi sekmesine geri dönecektir.
  6. Hücreyi yıkamak için enjeksiyon portuna parçacıksız su enjekte ederek polistiren boncukları hücreden durulayın. Tespit edilen partikül sayısı 0-10 arasında olana kadar (genellikle 5-10 mL arasında) yıkamaya devam edin. İlk numune için hücreyi hazırlamak üzere 1 mL 0,22 μm filtrelenmiş PBS ekleyin.
  7. İlk numuneyi 0,22 μm filtrelenmiş PBS ile seyreltin (1:1000 seyreltme ile başlayın) ve seyreltme faktörünü programa girin. Hücreye 1 mL numune yerleştirin ve başlangıçta ekran boyunca çok hızlı hareket edecekleri için parçacık hareketinin yavaşlaması için 5 dakika bekleyin. Hassasiyeti ve deklanşörü sırasıyla 75,0 ve 100 olarak ayarlayın.
  8. İdeal numune seyreltmesi için tespit edilen partikül sayısı 50-200 partiküldür. 50'nin altında veya 200'ün üzerinde partikül bildirilirse, numunenin seyreltilmesini ayarlayın. Yeni bir seyreltme gerekiyorsa, 0-10 partikül tespit edilene kadar hücreyi parçacıksız suyla yıkayın. Seyreltilmiş numune eklemeyi tekrarlayın ve ideal seyreltme bulunana kadar yıkayın.
  9. Parçacık hareketinin yavaşladığını görselleştirmek için 11 kamera konumunun tümünü kontrol edin ve algılanan parçacık sayısının tüm kamera konumları arasında benzer olduğundan emin olun. Parçacık sayısı kamera konumları arasında büyük farklılıklar gösteriyorsa, daha fazla örnek ekleyin.
  10. Ölçüm sekmesine tıklayın ve Video Çekimini Çalıştır'ı çalıştırın. Video alma sekmesinin altında, örnek için özel bir ad girin ve güvenli bir konum belirleyin. Verileri kaydetmek için otomatik kaydet.txt ve otomatik kaydet.pdf kutularını işaretleyin.
  11. Sıcaklığı 25 ° C'ye ayarlayın, lazeri ayarlamak için 488 nm'ye tıklayın ve kamera konumları için 11'e tıklayın. Veri toplamayı çalıştırmak için Tamam'ı tıklatın. Program, 11 pozisyonun hepsinde parçacık sayısını ve boyutunu analiz etmeye başlayacaktır. Analiz sekmesinin altında, x ekseninde çap/nm ve y ekseninde parçacıklar/mL içeren bir çubuk grafik görünür.
  12. Veriler toplandıktan sonra, 11 pozisyonun her biri için veri sağlayan Pozisyonlara Genel Bakış başlıklı bir açılır ekran görünecektir. Analizden çıkarılan ikiden fazla pozisyon varsa, prosedürü daha fazla numune ile tekrarlayın. Değilse, Devam düğmesine tıklayın. Sonuçları içeren bir PDF ve txt dosyası açılır. Dosyaları güvenli bir konuma kaydedin.
  13. Başka bir örnek çalıştırmak için Hücre Denetimi sekmesine gidin ve 10.6 ile 10.12 arasındaki adımları yineleyin. Yapılırsa, tespit edilen partikül sayısı 0-10 (yaklaşık 5-10 mL) olana kadar hücreyi parçacıksız suyla yıkayın. 1 mL'lik 0,22 μm filtrelenmiş PBS ile hücreyi durulayın, programı kapatın ve bilgisayarı kapatın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Batı lekelenmesi, EV'lerin CCM'den yeterli şekilde ayrıldığını ortaya koymaktadır
EV'leri hücre kültürü ortamından ayırmak için SEC'in etkinliğini değerlendirmek için, kontrol örneklerinden her bir fraksiyon kullanılarak, üç kanonik EV belirtecinin, CD9, CD63 ve CD81'in yanı sıra negatif kontroller olarak kullanılan GM130 ve calnexin18'in ekspresyonunu araştırmak için bir batı lekesi çalıştırıldı (Şekil 3). Albümin ekspresyonu18

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEC, EV'leri şartlandırılmış CCM'den yeterince ayırmak için kullanıcı dostu bir yöntemdir. Hücre kaynaklı EV'leri spesifik olarak izole etmek için, CCM tipinin ve takviyelerinin dikkatli bir şekilde dikkate alınması gerekir. Birçok hücre kültürü ortamının, serumun toplandığı hayvandan türetilen EV'leri içeren FBS ile desteklenmesi gerekir. Bu serum EV'leri, kültür26'daki hücrelerden türetilen EV'ler tarafından üretilen herhangi bir sinyali doyurabilir ve maskeleyebilir. Bu nedenle, deneyler yapılı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Penn State Behrend ve Hamot Sağlık Vakfı'na finansman için ve ayrıca University Park, PA'daki Penn State Mikroskopi Tesisi'ne teşekkür etmek istiyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-MerkaptoetanolVWR97064-588
4X Laemmli Numune TamponuBioRad1610747
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Ünitesi, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC9003083 kDa kesme
Amicon Ultra-2 Ultracel-3 membranlı Santrifüj Filtre ÜnitesiSigma-AldrichUFC200324 3 kDa kesme
Amonyum PersülfatSigma-AldrichA3678-100G
Anti tavşan IgG, HRP bağlantılı AntikorHücre Sinyal Teknolojisi7074V1:1000 Seyreltme
Anti-Calnexin antikoruAbcam  ab225951:500 Seyreltme
Anti-CD9 Fare Monoklonal AntikoruBioLegend3121021:500 Seyreltme
Anti-GM130 antikoru [EP892Y] - cis-Golgi İşaretleyiciAbcamab526491:500 Seyreltme
Anti-fare IgG, HRP'ye bağlı AntikorHücre Sinyalleme Teknolojisi7076V1:1000 Seyreltme
Otomatik Fraksiyon ToplayıcıIzon Science
BCA tahlil KitiBio-Rad
CCD kameraGatan Orius SC200
Cd63 Fare anti İnsanBD5560191:1000 Seyreltme
CD81 AntikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-23962 1:1000 Seyreltme
Cellstar Filtre Kapağı Hücre Kültürü ŞişeleriGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP GörüntüleyiciBioRad
Clarity Western ECL SubstratBioRad1705061
deoksikolatSigma-AldrichD6750-10G
ditiyotreitolSigma3483-12-3
DMEM/L-glutamin ile yüksek glikoz; sodyumCytivaSH300022 içermez.
Fetal Sığır Serumu Birinci sınıfVWR97068-085
Fetal Sığır Serumu, eksozomu tükenmişThermo ScientificA2720801
GlisinBioRad1610718
Çok Değerli Yağsız Kuru SütAmazonB076NRD2TZ
HOG İnsan Oligodendroglioma Hücre HattıSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Boyut Dışlama Sütunları 5pkIzon Science
Methanol >99.8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Cam plakalarBioRad16533100,75 mm ara parçalı
Mini-PROTEAN Kısa plakalarBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penisilin-Streptomisin, ÇözeltiSigma-AldrichP4458-100mL
Fosfat Tamponlu Tuzlu Sun PBSFisher ScientificBP66150
Pierce BCA Protein Test Kitleri ve ReaktifleriThermo Fisher Scientific23227
Pierce PVDF Transfer MembranlarıThermo Scientific88518
Pierce Western BlottingFiltre Kağıdı Termo Bilimsel84783
Polioksietilen-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Proteaz/fosfataz İnhibitörü Kokteyli (100X)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi5872S
Rekombinant Anti-TSG101 antikoru [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 seyreltme
Slodiyum hidroksitSigma-AldrichSX0603
Sodyum azidFisher ScientificBP922I-500
Sodyum KlorürSigma-AldrichS9888-500G
Sodyum dodesil sülfat,> %99,0 (GC), tozsuz peletlerSigma-Aldrich75746-1KG
TetrametiletilendiaminSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Lekesiz FastCast Akrilamid Kiti, %10BioRad1610183
Transmisyon Elektron MikroskobuFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Domuz tripsini, HBSS, EDTA ile tripsin% 0.25 proteaz; kalsiyum, magnezyum içermezCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta View yazılımıAnalytikNTA yazılımı
FS

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
  3. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  4. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  5. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
  6. Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).
  7. Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
  8. O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).
  9. Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
  11. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).
  12. Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).
  13. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).
  14. Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  15. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  16. Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).
  17. Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
  20. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).
  21. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  23. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).
  24. Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
  25. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  26. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).
  27. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  28. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  29. Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).
  30. Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).
  31. Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).
  32. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

UltrafiltrasyonEV Ayr t rmaOligodendrosit EV leriWestern BlotNanopartik l zlemeGe irimli Elektron MikroskobuEV Mark rleri

İlgili makaleler