Yöntem makalesi

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

DOI:

10.3791/63614

⸱

13 Mayıs 2022

 ,  , 
1Department of Biology, School of Science, Penn State Erie, The Behrend College, 2Magee Womens Research Institute—Allied Member

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV'ler), tüm hücrelerden salınan, tüm biyoakışkanlarda bulunan ve türetildikleri ana hücreyi yansıtan proteinler, nükleik asitler ve lipitler içeren nano boyutlu lipit-membrana bağlı yapılardır. EV'lerin bir numunedeki diğer bileşenlerden uygun şekilde ayrılması, ilişkili kargolarının karakterizasyonuna izin verir ve sayısız hastalık için hücreler arası iletişimciler ve invaziv olmayan biyobelirteçler olarak potansiyelleri hakkında fikir verir. Bu çalışmada, oligodendrosit türevi EV'ler, EV'leri diğer hücre dışı proteinlerden ve protein komplekslerinden ayırmak için ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) dahil olmak üzere en son tekniklerin bir kombinasyonu kullanılarak hücre kültürü ortamından izole edildi. Ticari olarak temin edilebilen SEC kolonları kullanılarak, EV'ler hem kontrol hem de endoplazmik retikulum (ER) stres koşulları altında insan oligodendroglioma hücrelerinden salınan hücre dışı proteinlerden ayrıldı. Kanonik EV belirteçleri CD9, CD63 ve CD81, 1-4 fraksiyonlarında gözlendi, ancak 5-8 fraksiyonlarında gözlenmedi. Golgi aparatının bir proteini olan GM130 ve ER'nin ayrılmaz bir proteini olan kalneksin, negatif EV belirteçleri olarak kullanıldı ve herhangi bir fraksiyonda gözlenmedi. Ayrıca, EV fraksiyonu olarak 1-4 fraksiyonlarını ve protein fraksiyonu olarak 5-8 fraksiyonlarını bir araya getirip yoğunlaştırırken, EV fraksiyonunda CD63, CD81 ve CD9 ekspresyonu gözlenmiştir. GM130 veya kalneksin ekspresyonu, fraksiyon tiplerinin hiçbirinde gözlenmedi. Hem kontrol hem de ER stres koşullarından toplanan fraksiyonlar transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirildi ve veziküller EV fraksiyonlarında gözlendi, ancak protein fraksiyonlarında gözlenmedi. EV'deki parçacıklar ve her iki koşuldan protein fraksiyonları da nanopartikül izleme analizi ile ölçüldü. Birlikte, bu veriler SEC'in EV'leri şartlandırılmış hücre kültürü ortamından ayırmak için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı vezikülleri (EV'ler) incelemeye olan ilginin patlamasına, bu nano boyutlu, heterojen parçacıkları ayırmak ve incelemek için kullanılan teknoloji ve tekniklerdeki büyük gelişmeler eşlik etmiştir. Yaklaşık kırk yıl önce 1,2 keşfedilmelerinden bu yana geçen sürede, bu küçük membranöz yapıların biyoaktif lipitler, nükleik asitler ve proteinler içerdiği ve hücreler arası iletişimde önemli roller oynadığı bulunmuştur 3,4. EV'ler tüm hücre tiplerinden salınır ve bu nedenle kan plazması ve serum, tükürük ve idrar dahil olmak üzere tüm biyolojik sıvı....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

NOT: Steriliteyi korumak için hücre kültürü reaktiflerini hücre kültürü davlumbazında yapın.

  1. Hücre kültürü reaktiflerinin hazırlanması
    1. 500 mL yüksek glikoz DMEM'ine 50 mL FBS ve 5 mL penisilin-streptokok (Pen-Strep) ekleyerek normal yüksek glikoz DMEM'i hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Hücreleri kültürlemek ve genişletmek için bu ortamı kullanın.
    2. 500 mL yüksek glikoz DMEM'ine 50 mL eksozom tükenmiş FBS ve 5 mL Pen-Strep ekleyerek eksozom tükenmiş yüksek glikoz DMEM'i hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Bu medyayı EV izolasyonundan önce hücre tedavileri i....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Batı lekelenmesi, EV'lerin CCM'den yeterli şekilde ayrıldığını ortaya koymaktadır
EV'leri hücre kültürü ortamından ayırmak için SEC'in etkinliğini değerlendirmek için, kontrol örneklerinden her bir fraksiyon kullanılarak, üç kanonik EV belirtecinin, CD9, CD63 ve CD81'in yanı sıra negatif kontroller olarak kullanılan GM130 ve calnexin18'in ekspresyonunu araştırmak için bir batı lekesi çalıştırıldı (Şekil 3). Albümin ekspresyonu18

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEC, EV'leri şartlandırılmış CCM'den yeterince ayırmak için kullanıcı dostu bir yöntemdir. Hücre kaynaklı EV'leri spesifik olarak izole etmek için, CCM tipinin ve takviyelerinin dikkatli bir şekilde dikkate alınması gerekir. Birçok hücre kültürü ortamının, serumun toplandığı hayvandan türetilen EV'leri içeren FBS ile desteklenmesi gerekir. Bu serum EV'leri, kültür26'daki hücrelerden türetilen EV'ler tarafından üretilen herhangi bir sinyali doyurabilir ve maskeleyebilir. Bu nedenle, deneyler yapılı.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Penn State Behrend ve Hamot Sağlık Vakfı'na finansman için ve ayrıca University Park, PA'daki Penn State Mikroskopi Tesisi'ne teşekkür etmek istiyor.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-MerkaptoetanolVWR97064-588
4X Laemmli Numune TamponuBioRad1610747
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Ünitesi, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC9003083 kDa kesme
Amicon Ultra-2 Ultracel-3 membranlı Santrifüj Filtre ÜnitesiSigma-AldrichUFC200324 3 kDa kesme
Amonyum PersülfatSigma-AldrichA3678-100G
Anti tavşan IgG, HRP bağlantılı AntikorHücre Sinyal Teknolojisi7074V1:1000 Seyreltme
Anti-Calnexin antikoruAbcam  ab225951:500 Seyreltme
Anti-CD9 Fare Monoklonal AntikoruBioLegend3121021:500 Seyreltme
Anti-GM130 antikoru [EP892Y] - cis-Golgi İşaretleyiciAbcamab526491:500 Seyreltme
Anti-fare IgG, HRP'ye bağlı AntikorHücre Sinyalleme Teknolojisi7076V1:1000 Seyreltme
Otomatik Fraksiyon ToplayıcıIzon Science
BCA tahlil KitiBio-Rad
CCD kameraGatan Orius SC200
Cd63 Fare anti İnsanBD5560191:1000 Seyreltme
CD81 AntikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-23962 1:1000 Seyreltme
Cellstar Filtre Kapağı Hücre Kültürü ŞişeleriGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP GörüntüleyiciBioRad
Clarity Western ECL SubstratBioRad1705061
deoksikolatSigma-AldrichD6750-10G
ditiyotreitolSigma3483-12-3
DMEM/L-glutamin ile yüksek glikoz; sodyumCytivaSH300022 içermez.
Fetal Sığır Serumu Birinci sınıfVWR97068-085
Fetal Sığır Serumu, eksozomu tükenmişThermo ScientificA2720801
GlisinBioRad1610718
Çok Değerli Yağsız Kuru SütAmazonB076NRD2TZ
HOG İnsan Oligodendroglioma Hücre HattıSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Boyut Dışlama Sütunları 5pkIzon Science
Methanol >99.8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Cam plakalarBioRad16533100,75 mm ara parçalı
Mini-PROTEAN Kısa plakalarBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penisilin-Streptomisin, ÇözeltiSigma-AldrichP4458-100mL
Fosfat Tamponlu Tuzlu Sun PBSFisher ScientificBP66150
Pierce BCA Protein Test Kitleri ve ReaktifleriThermo Fisher Scientific23227
Pierce PVDF Transfer MembranlarıThermo Scientific88518
Pierce Western BlottingFiltre Kağıdı Termo Bilimsel84783
Polioksietilen-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Proteaz/fosfataz İnhibitörü Kokteyli (100X)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi5872S
Rekombinant Anti-TSG101 antikoru [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 seyreltme
Slodiyum hidroksitSigma-AldrichSX0603
Sodyum azidFisher ScientificBP922I-500
Sodyum KlorürSigma-AldrichS9888-500G
Sodyum dodesil sülfat,> %99,0 (GC), tozsuz peletlerSigma-Aldrich75746-1KG
TetrametiletilendiaminSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Lekesiz FastCast Akrilamid Kiti, %10BioRad1610183
Transmisyon Elektron MikroskobuFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Domuz tripsini, HBSS, EDTA ile tripsin% 0.25 proteaz; kalsiyum, magnezyum içermezCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta View yazılımıAnalytikNTA yazılımı
FS

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

UltrafiltrasyonEV Ayr t rmaOligodendrosit EV leriWestern BlotNanopartik l zlemeGe irimli Elektron MikroskobuEV Mark rleri

İlgili makaleler