Yöntem makalesi

Eksozom Tabanlı Dopamin Taşıyıcı Sistemin Formüle Edilmesi ve Karakterize Edilmesi

DOI:

10.3791/63624

⸱

4 Nisan 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinden izole edilen kök hücrelerin eksozomlarının dopamin yüklemesi ile bir formülasyon elde etmeyi amaçladık. Eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu, elde edilen eksozomlara ilaç yüklemesi ve geliştirilen formülasyonun sitotoksik aktivitesi bu protokolde tanımlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boyutları 40 ila 200 nm arasındaki eksozomlar, hücre dışı veziküllerin en küçük alt grubunu oluşturur. Hücreler tarafından salgılanan bu biyoaktif kesecikler, hücreler arası kargo ve iletişimde etkin rol oynar. Eksozomlar çoğunlukla plazma, beyin omurilik sıvısı, idrar, tükürük, amniyon sıvısı, kolostrum, anne sütü, eklem sıvısı, meni ve plevral asit gibi vücut sıvılarında bulunur. Eksozomların büyüklükleri göz önüne alındığında, kan-beyin bariyerini (BBB) geçebildikleri için merkezi sinir sistemi hastalıklarında önemli rol oynayabilecekleri düşünülmektedir. Bu nedenle, bu çalışma, dopamini Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinden (WJ-MSC'ler) izole edilen eksozomlara kapsülleyerek eksozom tabanlı bir nanotaşıyıcı sistem geliştirmeyi amaçladı. Karakterizasyon sürecinden geçen eksozomlar dopamin ile inkübe edildi. Dopamin yüklü eksozomlar, inkübasyonun sonunda yeniden karakterize edildi. Dopamin yüklü eksozomlar, ilaç salınımı ve sitotoksisite deneylerinde araştırıldı. Sonuçlar, dopaminin eksozomlar içinde başarılı bir şekilde kapsüllenebildiğini ve dopamin yüklü eksozomların fibroblast canlılığını etkilemediğini gösterdi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksozomlar, önemli özelliklere sahip biyoaktif veziküller, boyutları 40 nm ila 200 nm arasında değişir. Eksozomlar hücre zarından kaynaklanır ve endozomlarınsalınması nedeniyle oluşur 1. Bu yapılar hücreden hücreye iletişimciler olarak görev yapar ve aktif moleküllerin transferini kolaylaştırmak için komşu hücrelerle etkileşime girer. Eksozomlar birçok farklı kaynaktan izole edilebilir. Bunlar, plazma, idrar, beyin omurilik sıvısı, tükürük gibi vücut sıvılarının yanı sıra in vitro koşullar altında kültürlenen hücre dizilerini içerir. Eksozomlar, içerdikleri lipitler, proteinler ve nükleik asitler gibi biyomakromoleküller sayesinde sinir hasarının giderilmesinde önemli bir role sahiptir2. Sinir sisteminin3 destek hücreleri olan glia, proteinleri ve mikro RNA'ları eksozomlar4 aracılığıyla nöronların aksonlarına aktarır.

Sinir iletiminde karakteristik bir özellik olan miyelin kılıfını oluşturan lipitler de eksozomlar 4,5 aracılığıyla oligodendrositlerden salınır. Eksozomlar ayrıca sinaptik plastisite, nöronal stres tepkisi, hücre-hücre iletişimi ve beyindeki nörojenez gibi süreçlerde de rol oynar 6,7. Eksozomların nano boyutlara sahip olması, BBB'den geçmelerini sağlar. Bu zara nüfuz ettikten sonra interstisyel sıvıdan beyin omurilik sıvısına özel bir geçiş yolu vardır8. Eksozomlar, yüzey özellikleri sayesinde bir ilaç dağıtım sistemi olarak hedef hücrelerle verimli bir şekilde etkileşime girebilir ve yüklenen ilaçları aktif olarak iletebilir.

Eksozomların yüzeyindeki çeşitli yapışkan proteinlerin (tetraspaninler ve integrinler) ekspresyonu nedeniyle, bu hücre dışı veziküller, konakçı hücre zarları ile kolayca etkileşime girebilir ve kaynaşabilir9. Eksozomların BBB'ye nüfuz edebilme yetenekleri ve yüzey özellikleri nedeniyle özellikle merkezi sinir sistemi hastalıklarının tedavisinde ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. Mezenkimal kök hücre (MSC) kaynaklı eksozomlar, allojenik hücresel tedavilere kıyasla daha düşük immün reddi riskine sahiptir ve bu açıdan hücresiz tedavi uygulamalarının önemli bir bileşeni olabilirler10.

Dopamin, beyindeki eksikliği Parkinson hastalığının (PH) karakteristik özelliği olan ve her geçen gün kötüleşen bir moleküldür11,12,13. PH'nin mezensefalonun substantia nigra'sındaki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ve motor nöron fonksiyonlarının kaybı ile ilişkili olduğu bilinmektedir14,15. Dopaminerjik nöronların ölümü, nörotransmitter dopaminin beyin striatumuna beslenmesini engeller. Bu da PH'ye özgü semptomların ortaya çıkmasına neden olur16. PH'nin bu semptomları bradikinezi, postüral instabilite, rijidite ve özellikle istirahat tremorudur12,13. PH ilk kez iki yüzyıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış olmasına rağmen, hastalığın patolojisini ve etiyolojisini anlamaya yönelik çalışmalar halen devam etmektedir ve günümüzde PH'nin kompleks bir sistemik hastalık olduğu kabul edilmektedir17. Dopamin eksikliğinin ortaya çıktığı ve nöronların %80'inden fazlasının dejenere olduğu klinik PD semptomlarının gözlendiği öngörülmektedir18. Hastalığın tedavisinde motor semptomları azaltmak için eksik dopamin takviyesi tercih edilir. İn vivo çalışmalar, dopaminin beyne doğrudan infüzyonunun hayvanlarda semptomları önemli ölçüde azalttığını göstermiştir19. Klinikte L-DOPA (L-3,4-dihidroksifenilalanin) gibi dopamin öncülleri ve dopamin reseptör ilaçları kullanılmaktadır çünkü insanlarda dopaminin beyne doğrudan infüzyonu mümkün değildir ve sisteme giren dopamin BBB20'yi geçemez. Bu tür ilaçlar zamanla etkinliğini yitirir. Bununla birlikte, PH için hala küratif bir tedavi yaklaşımı yoktur. Bu nedenle, hastalığın patofizyolojisini ortaya koymak ve PH'nin hastalar üzerindeki etkisini azaltmak için yeni terapötik stratejiler ve tedavi modaliteleri geliştirmeye büyük ihtiyaç vardır.

Eksozom temelli çalışmalar son zamanlarda sinir sistemi hastalıklarının hem terapötik yaklaşımları hem de patolojileri hakkında bilgi toplamak açısından dikkat çekmektedir. MSC kaynaklı eksozomların sinir hasarında inflamasyonu azalttığı ve nöronal rejenerasyona katkıda bulunduğu gösterilmiştir21,22,23. Ayrıca MSC kaynaklı eksozom sekretomlarının özellikle dopaminerjik nöronlar üzerinde nörotrofik ve nöroprotektif etkiler göstererek apoptozu azalttığı bildirilmiştir24,25. Eksozomların terapötik ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanıldığı platformlar üzerine yapılan araştırmalar son yıllarda yoğun bir şekilde hızlanmıştır. Çok sayıda çalışmada, ilgili ilaçların eksozomlara kolayca kapsüllenebildiği ve hedef hücrelere, dokulara ve organlara güvenli bir şekilde verilebildiği gözlemlenmiştir26,27. Eksozomlara ilaç yüklemesi için inkübasyon, donma/çözülme döngüleri, sonikasyon ve ekstrüzyon gibi farklı yöntemlerkullanılabilir 28.

Eksozomlar veya eksozom benzeri veziküllerle çakışma, lipofilik küçük moleküllerin bu dağıtım sistemlerine pasif olarak kapsüllenmesine izin verir28,29,30. Özellikle, kurkumin 31, katalaz30, doksorubisin32 ve paklitaksel33 gibi çeşitli moleküller eksozomlara etkili bir şekilde yüklendi. Antioksidan aktiviteye sahip olan katalaz içeren eksozomların beyindeki nöronlarda ve mikroglial hücrelerde verimli bir şekilde biriktiği ve güçlü nöroprotektif aktiviteler sergilediği gözlemlenmiştir30. Aynı çalışmada, yükleme verimliliğini artırmak için kompleks içine eklenen saponinin, inkübasyon sırasında ilaç yükleme yüzdesini arttırdığı bulunmuştur30,34. Bununla birlikte, eksozomlara ilaç yüklemesi için standartları oluşturmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Bu makale, dopaminin WJ-MSC'lerden izole edilen eksozomlara kapsüllenmesiyle bir nanotaşıyıcı sistemin geliştirilmesini açıklamaktadır. WJ-MSC'lerin kültivasyonu, eksozomların izolasyonu ve karakterizasyonu, ilaç yükleme deneyleri, dopamin yüklü eksozomların çeşitli tekniklerle karakterizasyonu ve in vitro sitotoksisite analizi dahil olmak üzere tüm adımlar ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinin kültürlenmesi ve dondurularak saklanması

  1. WJ-MSC'leri (ATCC'den) -80 °C dondurucudan çıkarın. Hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM-F12 ortamı içeren bir şişeye tohumlayın. % 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Kültür ortamını 2 günde bir değiştirin. Hücreleri% 80 birleşmeye ulaştıklarında geçirin. Geçirilecek hücreleri 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
    NOT: Tripsin eklemeden önce PBS ile yıkamak, hücrelerin şişe yüzeyinden kolayca ayrılmasını sağlar.
  3. PBS'yi çıkarın ve şişeye 5 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Şişeyi% 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
  4. Süpernatanı tüpe toplayın ve 5 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve pipetleme ile tüpe 1 mL DMEM-F12 +% 10 FBS ekleyin.
  5. Hücreleri daha büyük bir şişeye aktarın ve yeterli eksozom elde edilene kadar DMEM-F12 +% 10 FBS ekleyerek kültüre devam edin35.
    NOT: Kültürlenmiş hücreler, dimetil sülfoksit (DMSO) ile 1 milyon/mL yoğunlukta dondurulur ve -80 °C'de saklanır.

2. Wharton Jelly mezenkimal kök hücrelerinden eksozom üretimi

NOT: Eksozomlar, kültürlenmiş WJ-MSC'lerden izole edilir. Eksozom izolasyonu, hücreler şişe yüzeyini kapladığında ve yaklaşık% 80 yoğunluğa ulaştığında gerçekleştirilir.

  1. % 10 FBS içeren süpernatan ortamı şişeden çıkarın ve hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. PBS ile duruladıktan sonra hücrelere serumsuz DMEM-F12 besiyeri ekleyin. Şişeleri %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 48 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, serumsuz ortamı tüpte toplayın ve -20 ° C'de saklayın.
    NOT: Adım 2.1'de, 180 mL serumsuz ortam toplanır ve -20 °C'de saklanır. Çözüldükten sonra, aşağıda açıklandığı gibi bir toplu santrifüj işlemi başlatılır.
  2. Eksozomların izolasyonu
    1. Toplanan serumsuz ortamı 300 x g'da +4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice geri çekin ve başka bir tüpe aktarın.
    2. Toplanan süpernatanı 2.000 × g'da +4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice geri çekin ve başka bir tüpe aktarın.
    3. Toplanan süpernatanı +4 °C'de 30 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice geri çekin ve başka bir tüpe aktarın.
    4. Toplanan süpernatanı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 130 dakika boyunca 110.000 × g'da ultrasantrifüje aktarın. Süpernatanı yavaşça çıkarın ve pelete 1 mL PBS ekleyin.
    5. Pelet ve ultrasantrifüjü 110.000 × g'da +4 °C'de 70 dakika vorteksleyin36 (Şekil 1). Süpernatanı yavaşça çıkarın ve pelete 1 mL PBS ekleyin.
      NOT: Ultrasantrifüj adımları tamamlandıktan sonra elde edilen eksozomlar -80 °C'de saklanabilir. Elde edilen pelet artık karakterizasyona hazırdır.

figure-protocol-1
Şekil 1: Eksozom izolasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Eksozomların karakterizasyonu

  1. Nanopartikül İzleme Analizi (NTA)
    NOT: İzole edilen eksozomların boyutunu ve konsantrasyonunu belirlemek için nanopartikül izleme analizi yapılır. 1x PBS çözeltisi için kullanılan tabletler pH 7.3-7.5 aralığında olmalıdır. 1x PBS Çözeltisi 10 mM fosfat tamponu, 137 mM sodyum klorür ve 2.7 mM potasyum klorür içerir. Çözelti, 100 mL damıtılmış suya 1 PBS tablet eklenerek hazırlanır. Hazırlanan bu çözelti otoklavlama ile sterilize edilir.
    1. 10 μL eksozoma 990 μL PBS ekleyerek eksozomları 100 kat seyreltin. Seyreltilmiş süspansiyonu tek kullanımlık bir şırıngaya alın.
    2. NTA aygıtını açın ve bilgisayarı bağlayın. Yazılımı açın.
    3. Şırıngadaki numuneyi cihazın kaset bölümündeki tüpe enjekte edin. Cihazın kaset kapağını kapatın.
    4. Açılan yazılımda, Analizi Başlat düğmesine tıklayın. Kaydet düğmesine basarak elde edilen sonuçları kaydedin.
  2. Dinamik ışık saçılımı analizi
    NOT: Zeta potansiyeli ve boyut ölçümü için izole edilen eksozomlar da NTA analizi ile aynı şekilde seyreltilir.
    1. 20 μL eksozomlara 980 μL PBS ekleyin.
    2. Zeta boyutlandırma cihazını ve bağlı bilgisayarı açın. Yazılımı açın.
    3. Adım 3.2.1'deki süspansiyonu tek kullanımlık küvete ekleyin. Cihazın kapağını açın, küveti kasete yerleştirin ve kapağı kapatın.
    4. Cihazın yazılımında küvet tipini seçin. Zeta potansiyeli ve boyutsal analiz için Analizi Başlat butonuna tıklayınız.
      NOT: Analizler boyutsal analiz ve zeta potansiyeli için ayrı ayrı yapılır.

4. Eksozomlara dopamin yüklenmesi

NOT: WJ-MSC'lerin eksozomlarının karakterizasyonu tamamlandıktan sonra, ilaç salım sistemi olarak dopamin yüklü eksozomlar elde edildi. Eksozomlara ilaç yüklemesi inkübasyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. Adım 2.2.5'ten eksozom süspansiyonuna 3 mL PBS ekleyin. Seyreltilmiş süspansiyonu 0.22 μm filtreler kullanarak filtreleyerek sterilize edin. 500 μL sterilize edilmiş eksozom süspansiyonunu başka bir tüpe aktarın.
  2. Damıtılmış su ile dopamin çözeltisi (0.5 mg / mL) hazırlayın. Eksozomları içeren tüplere 500 μL dopamin çözeltisi ekleyin.
  3. Adım 4.2'de süspansiyona saponin ekleyin. Hazırlanan eksozom-dopamin süspansiyonunu 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
    NOT: Saponin konsantrasyonu toplam çözeltinin% 0.002'sini geçmemelidir.
  4. Serbest dopamin ve saponini ortamdan uzaklaştırmak için süspansiyonu 70 dakika boyunca 90.000 × g'da ultrasantrifüjleyin. İzole edilmiş eksozomları daha fazla analiz için kullanılana kadar -20 °C'de saklayın37.
    NOT: Hazırlanan dopamin çözeltisinin stabilitesi için% 0.02 askorbik asit ekleyin.

5. Dopamin yüklü eksozomların karakterizasyonu

  1. Nanopartikül izleme analizi (NTA)
    NOT: İzole eksozomların boyutunu ve konsantrasyonunu belirlemek için nanopartikül izleme analizi yapılır.
    1. Eksozomları seyreltmek ve NTA gerçekleştirmek için 3.1.1-3.1.4 adımlarını izleyin.
  2. Dinamik ışık saçılımı analizi
    NOT: Zeta potansiyeli ve boyut ölçümü için izole edilen eksozomlar da NTA analizine benzer şekilde seyreltilir.
    1. Eksozomları seyreltmek ve dinamik ışık saçılımı analizi yapmak için 3.2.1-3.2.4 adımlarını izleyin.
      NOT: Her çözelti (saponin, dopamin, eksozom-dopamin) için boyut ve zeta potansiyelleri ayrı ayrı analiz edilir.

6. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)

NOT: Eksozomlara yüklenen dopamin miktarları, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile ölçülür. Elde edilen formülasyonda dopamin varlığını tespit etmek için eksozomlar özel bir işlemle patlatılır.

  1. Formülasyonu buharlaşması için 75 °C'lik bir ısıtıcıya koyun. Süspansiyona asetonitril (50:50 oranı) ekleyin ve girdap yapın. Çözeltiyi 10 dakika boyunca sonikleştirin.
  2. Çözeltiyi 10.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
  3. 30 °C'de 1 mL/dk akış hızında (mobil faz H 2 O / asetonitril) birC18kolonu kullanarak tüm analitleri analiz edin. Absorbansı 230 nm38'de ölçün.

7. İlaç yükleme kapasitesi (DL) ölçümü ve in vitro ilaç salım kinetiği

  1. İlaç yükleme kapasitesi (DL)
    NOT: Eksozomlara yüklenen dopamin miktarı, UV-Vis spektroskopisi kullanılarak ölçülür. Absorbans 280 nm'de okunur. Sentez sırasında toplanan süpernatanlar, boşaltılmış ilaç miktarını ölçmek için kullanılır. Süpernatanttaki dopamin konsantrasyonu, dopamin için standart bir kalibrasyon eğrisi ile belirlenir.
    1. 1 mg / mL dopamin içeren bir stok çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su kullanarak stok çözeltisinden 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg / mL konsantrasyonları hazırlayın.
      NOT: Hazırlanan dopamin çözeltisinin stabilitesi için% 0.02 askorbik asit ekleyin.
    2. Bir UV-Spektrofotometrede 280 nm'de her bir dopamin dilüsyonunun absorbansını ölçerek standart bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
    3. Süpernatantın absorbansını 280 nm'de ölçün.
    4. Eq (1)39 kullanarak dopamin için ilaç yükleme kapasitesini hesaplayın.
      DL (%) = figure-protocol-2 100 (1)
      NOT: Analiz üç nüsha halinde gerçekleştirilir.
  2. İn vitro ilaç salım kinetiği
    NOT: Dopamin yüklü eksozomların ilaç salım kinetiği, bir diyaliz membranı kullanılarak gerçekleştirilir. PBS, pH 7.4, fizyolojik bir mikro ortamı simüle etmek için salım ortamı olarak kullanılır.
    1. Diyaliz membranına 1 mL dopamin yüklü eksozom ekleyin. Membranı bir behere yerleştirin. Behere 15 mL PBS ekleyin.
    2. 0.5, 1, 2, 4, 6 ve 8 saatte bir beherde 1 mL salım ortamı örnekleyin. Her zaman noktasında, numunenin hacmini taze PBS ile değiştirin. Bir UV-Vis spektrometresi kullanarak 280 nm'de belirli aralıklarla alınan numuneleri analiz edin.
    3. Denklem (2)40 kullanarak sonuçları hesaplayın.
      Serbest bırakma (%) = figure-protocol-3 100 (2)
      NOT: İn vitro ilaç salım kinetiğinin belirlenmesi için bir kalibrasyon eğrisi hazırlanır. Dopamin çözeltisi 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 ve 5.0 mg / mL konsantrasyonlarında hazırlanır. Her konsantrasyonun UV absorbans değeri, bir UV-Vis spektrofotometresi ile 280 nm'de belirlenir.

8. İn vitro sitotoksisite testi

  1. Fibroblastların canlandırılması ve kültürü
    1. Fibroblastları -80 °C dondurucudan çıkarın. Hücreleri DMEM-F12 +% 10 FBS içeren bir şişeye tohumlayın.
    2. Hücreleri% 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Kültür ortamını 2 günde bir değiştirin.
    3. Hücreleri% 80 birleşmeye ulaşana kadar geçirin. 1.3-1.5 adımlarını izleyin. 5 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın, 1 mL DMEM-F12 +% 10 FBS ekleyin ve 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 10.000 hücre tohumlayın.
      1. DMEM-F12 ortamı +% 10 FBS ekleyin ve% 5 CO2 içeren bir inkübatörde hücreleri 18 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kuluçka sonunda kuyuların ortamını değiştirin.
    4. Dopamin yüklü eksozom süspansiyonu stoğunu hazırlayın. 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL ve 1.000 μL/mL konsantrasyonları elde etmek için dopamin yüklü eksozom formülasyonunu ortamla seyreltin.
    5. Hazırlanan konsantrasyonları 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücrelere ekleyin. Plakaları 37 °C'de 18 saat boyunca %5 CO241 içeren bir inkübatörde inkübe edin.
  2. MTT hücre canlılık testi
    NOT: İnkübasyon sonunda MTT testi ile hücrelerin canlılık oranları belirlenir.
    1. MTT çözeltisini (5 mg / mL) PBS ile hazırlayın. Her kuyucuğa 10 μL MTT çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 4 saat inkübe edin.
    2. İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa 100 μL DMSO ekleyin. Plakaları karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. ELISA okuyucusundaki absorbans değerlerini 570 nm42,43'te ölçün.
      NOT: MTT canlılık testi üç kopya halinde gerçekleştirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu
Wharton jöle kök hücreleri kültürlenir ve kültür yeterli yoğunluğa ulaştığında 48 saat boyunca serumsuz bir ortamda inkübe edilir. İnkübasyonun bitiminden sonra, süpernatan -20 ° C'de saklanır. Toplanan süpernatanlar PBS ile seyreltilir ve ultrasantrifüjlemeye tabi tutulur (Şekil 1). Elde edilen çözelti NTA ve DLS analizleri ile analiz edilmiştir. Eksozomlar 0.22 μm'lik bir filtreden geçirilerek sterilize edilir. Elde edilen eksozom...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksozomlar, çoğu hücre tipi, örneğin MSC'ler1 tarafından salgılanan 40-200 nm boyutlarında küçük zar vezikülleridir. Hücreler arasındaki iletişimi sağlayabilen eksozomlar, hücrelere endositoz, fagositoz, mikropinositoz, lipid aracılı içselleştirme ve füzyon gibi farklı yollarla girebilirler33,44. Diğer nanotaşıyıcı sistemlerle karşılaştırıldığında, eksozom yüzeyinde bulunan lipitler ve kolesterol, hem hidrofilik hem de hidrofobik molekülle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, öncelikle Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (TSA-2021-4713) tarafından sağlanan araştırma fonu ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 ve mikro; m membran filtreAisimoSterilizasyon işlemi için kullanılan
0.45 & m şırınga filtresiAisimoSterilizasyon işlemi için kullanılır
15 mL Falcon tüpYuvasıHücre kültürü adımında kullanılır
25 cm2 hücre kültürü şişeleri (Falcon, TPP doku kültürü şişeleriNestHücre kültürü adımında kullanılır
50 mL Falcon tüpYuvasıHücre kültürü adımında kullanılır
75 cm2 hücre kültürü şişeleri (Falcon, TPP doku kültürü şişeleriYuvaHücre kültürü adımında kullanılan
96 kuyulu plakalar (Falcon, TPP mikroplakalar)Merck MilliporeHücre kültürü adımında kullanılır
AsetonitrilSigma271004-1LHPLC analizi için kullanılır
OtoklavNUVE-OT 90LSterilizasyon işlemi için kullanılır
Hücre Kültür KabiniHera Safe KSHücre kültürü işlemi için kullanılır
SantrifüjHitachiCF16RN
CO2 inkübatördeHücre kültürü işlemi için kullanılır
Dopamin hidroklorür H8502-10GSigmaH8502-10GEksozom dopamin yüklemesinde kullanılır
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium/Nutrient Mix-F12SigmaRNBJ7249Hücre kültürü ortamı olarak kullanılan
Fetal Sığır Serumu-FBSCapricornFBS-16Ahücre kültürü ortamına eklenerek kullanılmıştır.
Dondurucu -80 ° C; CPanasonicMDF-U5386S-PEHücreleri ve elde edilen eksozomları depolamak için
BuzdolabıPanasonicMPR-215-PEHücre kültürü ve diğer malzemeleri depolamak için kullanılır
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi-HPLCAgilent TeknolojileriElde edilen formülasyonun içeriğinden dopamin varlığı araştırıldı.
Mikroskop- PrimovertZeissHücre kültüründeki hücreleri gözlemlemek için kullanılır.
MTT TestiBiomatikHücre canlılığını ölçmek için kullanılır
NanoSight NS300Malvern panalitikMalvern panalitikEksozom karakterizasyonu için kullanılır
Optima XPN-100 UltrasantrifüjBeckman CoulterEksozom izolasyon adımında kullanılır
PBS tabletBiomatik43602PBS çözeltisinin hazırlanmasında
Penicilin/ Streptomisin ÇözeltisiCapricornPB-Shücre kültüründe kontaminasyonu önlemek için besiyerine ilave edildi.
Pipet YardımıIsolab
Hassas terazi-KernKern-ABJ220-4NMÇözeltilerin hazırlanmasında kullanılan
Q500 SonicatorQsonica, LLCHPLC analizinde eksozomları sindirmek için kullanılan
SaponinSigma47036-50G-Feksozom dopamin yükleme işleminde toplam çözeltiye eklenerek kullanılmıştır.
Spektrostar-Nano-SpektrofotometriBMG LABTECHMTT ve ilaç salım analizleri için kullanılır
SPSS 22istatistik paket programı
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexÇözeltileri homojen bir şekilde karıştırmak için kullanılır
Su Banyosu 37 ve derece; C-SenovaSenovaHücre kültürü basamağında kullanılan
Wharton' s jöle mezenkimal kök hücrelerATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSEksozom karakterizasyonu için kullanılır
Safe Cell UV Panasonic ile eksozom izolasyon adımında kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
  3. Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
  4. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  5. Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
  6. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
  7. Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122(2019).
  8. Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317(2017).
  9. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  10. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  11. Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
  12. Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
  13. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737(2017).
  14. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
  15. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  16. Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
  17. Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
  18. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
  19. Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
  20. Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180(2014).
  21. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
  22. Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
  23. Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
  24. Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
  25. Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294(2019).
  26. Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
  27. Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
  28. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  29. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
  30. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  31. Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
  32. Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
  33. Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
  34. Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288(2020).
  35. Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
  36. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).
  37. Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
  38. Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
  39. Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
  40. Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
  41. Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
  42. Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
  43. Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
  44. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
  45. Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
  46. Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291(2017).
  47. Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
  48. Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
  49. Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
  50. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
  51. Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
  52. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Exosome Carrier SystemDopamine EncapsulationExtracellular VesiclesBlood Brain BarrierWharton s Jelly ExosomesNanoparticle TrackingSerial CentrifugationDrug Release AssayCytotoxicity AssayMTT Assay

İlgili makaleler