Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mitokondriyal Geçirgenlik Geçiş Gözünün Koenzim Q Fazlalığı Ortamında Açık Olasılığının Değerlendirilmesi

2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63646

⸱

1 Haziran 2022

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

Bu makalede

Özet

Bu yöntem, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin düşük iletkenlikli proton sızıntısına katkısından, vahşi tip kontrolüne kıyasla artmış kardiyomiyosit mitokondriyal koenzim Q içeriğine sahip yenidoğan kırılgan X sendromlu farelerde gözenek açılması için voltaj eşiğini belirlemek için kullanır.

Özet

Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenekleri (mPTP), sağlık ve hastalıkta önemli olan voltaj kapılı, seçici olmayan, iç mitokondriyal membran (IMM) mega kanalıdır. mPTP, düşük iletkenlikli açıklık sırasında IMM boyunca protonların sızmasına aracılık eder ve özellikle siklosporin A (CsA) tarafından inhibe edilir. Koenzim Q (CoQ), mPTP'nin bir düzenleyicisidir ve CoQ içeriğinde dokuya özgü farklılıklar ve kırılgan X sendromunun (FXS, Fmr1 nakavtı) yenidoğan bir fare modelinde ön beyin ve kalp mitokondrisinde mPTP'nin açık olasılığı bulunmuştur. Bu mutant suşta mPTP açıklığı için voltaj eşiğini belirlemek için bir teknik geliştirdik ve mPTP'nin proton sızıntı kanalı olarak rolünden yararlandık.

Bunu yapmak için, oksijen tüketimi ve membran potansiyeli (ΔΨ), polarografi ve sızıntı solunumu sırasında bir tetrafenilfosfonyum (TPP +) iyon seçici elektrot kullanılarak izole mitokondride eşzamanlı olarak ölçülmüştür. mPTP açıklığı eşiği, belirli membran potansiyellerinde proton sızıntısının CsA aracılı inhibisyonunun başlangıcı ile belirlendi. Bu yaklaşım kullanılarak, mPTP'nin voltaj geçişindeki farklılıklar, CoQ fazlalığı bağlamında kesin olarak tanımlanmıştır. Bu yeni teknik, mPTP'nin düşük iletkenlikli açılmasının fizyolojik ve patolojik düzenlemesinin anlaşılmasını arttırmak için gelecekteki araştırmalara izin verecektir.

Giriş

mPTP, geçirgenlik geçişine (PT) aracılık eder, böylece İBB aniden küçük moleküllere geçirgen hale gelir ve 1,2'yi çözündürür. Bu çarpıcı fenomen, oksidatif fosforilasyon için gerekli elektrokimyasal gradyanı belirlemek için temel olan İBB'nin karakteristik geçirimsizliğinden belirgin bir sapmadır3. PT, diğer mitokondriyal taşıma mekanizmalarının aksine, 1.5 kDa 4,5'e kadar bir molekül aralığının geçişine izin veren, yüksek iletkenlikli, spesifik olmayan ve seçici olmayan bir işlemdir. mPTP, açıklığı ΔΨ, ATP üretimi, kalsiyum homeostazı, reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi ve hücre canlılığı4'ü değiştiren IMM içindeki voltaj kapılı bir kanaldır.

mPTP'nin patolojik aşırılıkta, kontrolsüz ve uzun süreli yüksek iletkenlikli açıklığı, elektrokimyasal gradyanın çökmesine, matris şişmesine, matriks piridin nükleotitlerinin tükenmesine, dış zar rüptürüne, membranlar arası proteinlerin salınmasına (sitokrom c dahil) ve nihayetinde hücre ölümüne yol açar 4,6. Bu patolojik mPTP açıklığı kardiyak iskemi-reperfüzyon hasarı, kalp yetmezliği, travmatik beyin hasarı, çeşitli nörodejeneratif hastalıklar ve diyabet 1,7 ile ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, düşük iletkenlikli mPTP açıklığı doğada fizyolojiktir ve yüksek iletkenlikli açıklığın aksine, derin depolarizasyona veya mitokondriyal şişmeye yol açmaz4.

Gözeneklerin düşük iletkenlik açıklığı, geçirgenliği ~ 300 Da ile sınırlar, protonların ATP sentezinden bağımsız geçişine izin verir ve fizyolojik proton sızıntısı5'in potansiyel bir kaynağıdır. Fizyolojik mPTP açıklığı, ΔΨ'de kontrollü bir düşüşe neden olur, solunum taşıma zinciri boyunca elektron akışını arttırır ve kısa bir süperoksit patlaması veya parlaması ile sonuçlanır, bu da ROS sinyallemesine katkıda bulunur8. Bu tür geçici mPTP açıklığının düzenlenmesi kalsiyum homeostazı ve normal hücresel gelişim ve olgunlaşma 4,9,10,11 için önemlidir. Örneğin, gelişmekte olan nöronlarda geçici gözenek açıklığı farklılaşmayı tetiklerken, mPTP'nin kapanması olgunlaşmamış kardiyomiyositlerde olgunlaşmayı indükler 4,5.

mPTP'nin sağlık ve hastalıktaki fonksiyonel önemi iyi kurulmuş olmasına rağmen, kesin moleküler kimliği tartışılmaya devam etmektedir. mPTP'nin moleküler yapısı ve işlevi konusundaki ilerleme, başka yerlerde kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir12. Kısaca, şu anda, mPTP'nin yüksek ve düşük iletkenlik durumlarının, farklı varlıklar tarafından aracılık edildiği varsayılmıştır12. Önde gelen adaylar, sırasıyla yüksek ve düşük iletkenlik modları için F1 / F0 ATP sentaz (ATP sentaz) ve adenin nükleotid taşıyıcısıdır (ANT), 12.

mPTP'nin gözenek oluşturan bileşeninin tam kimliği konusunda fikir birliği olmamasına rağmen, bazı temel özellikler detaylandırılmıştır. mPTP'nin iyi bilinen bir özelliği, elektrokimyasal gradyan tarafından düzenlenmesidir, böylece İBB'nin depolarizasyonu gözenek açılmasına yol açar13. Önceki çalışmalar, vicinal tiol gruplarının redoks durumunun, mPTP'nin voltaj geçidini değiştirdiğini, böylece oksidasyonun gözenekleri nispeten daha yüksek ΔΨ'lerde açtığını ve tiol grubu azalmasının kapalı mPTP olasılığı14 ile sonuçlandığını göstermiştir. Bununla birlikte, proteinli voltaj sensörünün kimliği bilinmemektedir.

Gözeneklerin açık olasılığını modüle eden çeşitli küçük moleküller tanımlanmıştır. Örneğin, mPTP kalsiyum, inorganik fosfat, yağ asitleri ve ROS ile açılmaya teşvik edilebilir ve adenin nükleotidleri (özellikle ADP), magnezyum, protonlar ve CsA 5,12 tarafından inhibe edilebilir. Bu düzenleyicilerin bazılarının etki mekanizmaları açıklığa kavuşturulmuştur. Mitokondriyal kalsiyum, ATP sentaz15'in β alt birimine bağlanarak mPTP açılımını en azından kısmen tetikler. ROS, ADP'ye olan afinitesini azaltarak ve en iyi çalışılmış proteinli mPTP aktivatörü16 olan siklofilin D (CypD) için afinitesini artırarak mPTP'yi aktive edebilir. mPTP'nin inorganik fosfat ve yağ asitleri tarafından aktivasyon mekanizması daha az açıktır. Endojen inhibitörlere gelince, ADP'nin ANT veya ATP sentazına bağlanarak mPTP'yi inhibe ettiği düşünülürken, magnezyum kalsiyumu bağlanma bölgesinden 15,17,18,19 yerinden oynatarak inhibitör etkisini gösterir.

Düşük pH, ATP sentaz 12,20,21'in düzenleyici oligomisin duyarlılığı veren protein (OSCP) alt biriminin histidin112'sini protonlayarak mPTP açılmasını inhibe eder. mPTP'nin prototipik farmakolojik inhibitörü CsA, CypD'yi bağlayarak ve OSCP22,23 ile ilişkisini önleyerek etki eder. Önceki çalışmalar ayrıca çeşitli CoQ analoglarının mPTP ile etkileşime girdiğini, onu inhibe ettiğini veya24'ü aktive ettiğini göstermiştir. Son çalışmalarda, patolojik olarak açık bir mPTP, aşırı proton sızıntısı ve yenidoğan FXS fare yavrularının ön beyin mitokondrisinde CoQ eksikliğine bağlı olarak verimsiz oksidatif fosforilasyonun kanıtlarını bulduk25.

Gözeneklerin eksojen CoQ ile kapatılması patolojik proton sızıntısını bloke etti ve dendritik dikenlerin morfolojik olgunluğunu indükledi25. İlginç bir şekilde, aynı hayvanlarda, FXS kardiyomiyositleri aşırı CoQ seviyelerine sahipti ve wildtype kontrolleri26'ya kıyasla mPTP olasılığını kapattı. CoQ seviyelerindeki bu dokuya özgü farklılıkların nedeni bilinmemekle birlikte, bulgular endojen CoQ'nun muhtemelen mPTP'nin önemli bir düzenleyicisi olduğu kavramını vurgulamaktadır. Bununla birlikte, bilgimizde büyük bir boşluk vardır, çünkü mPTP'nin CoQ aracılı inhibisyon mekanizması bilinmemektedir.

mPTP'nin düzenlenmesi, hücre sinyalizasyonu ve sağkalımının kritik bir belirleyicisidir4. Bu nedenle, mitokondri içinde mPTP açıklığının saptanması, spesifik patofizyolojik mekanizmalar göz önüne alındığında anahtardır. Tipik olarak, yüksek iletkenlikli gözenek açma eşiği, geçirgenlik geçişini tetiklemek için kalsiyum kullanılarak belirlenir. Bu tür kalsiyum yüklemesi, membran potansiyelinin çökmesine, oksidatif fosforilasyonun hızlı bir şekilde ayrılmasına ve mitokondriyal şişmeye yol açar27,28. Düşük iletkenlikli mPTP açıklığını kendi başına indüklemeden in situ olarak tespit etmek için bir yöntem geliştirmeye çalıştık.

Yaklaşım, mPTP'nin proton sızıntı kanalı olarak rolünden yararlanır. Bunu yapmak için, Clark-Tipi ve TPP + iyon seçici elektrotlar, sızıntı solunumu sırasında izole mitokondride sırasıyla oksijen tüketimini ve membran potansiyelini aynı anda ölçmek için kullanıldı29. mPTP açıklığı eşiği, belirli membran potansiyellerinde proton sızıntısının CsA aracılı inhibisyonunun başlangıcı ile belirlendi. Bu yaklaşım kullanılarak, CoQ fazlalığı bağlamında mPTP'nin voltaj geçidindeki farklılıklar kesin olarak tanımlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi açıklanan tüm yöntemler için onay alınmıştır. Bu çalışma için model sistemleri olarak kullanılan FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyr c-ch Fmr1 tm1Cgr/J) ve kontrol (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) fareleri ticari olarak edinilmiştir (bkz. Her deney grubunda beş ila on bir hayvan kullanıldı. Doğum sonrası gün 10 (P10) fareleri, insan bebekliğinde bir zaman noktasını modellemek için kullanıldı.

1. Fare kalbinden mitokondriyal izolasyon

  1. Tablo 1'de açıklandığı gibi mitokondriyal izolasyon ve solunum deneyleri için tamponlar hazırlayın. Önceden yapılmışsa 4 ° C'de saklayın.
    1. %15 yoğunluklu gradyan ortamı hazırlayın: ticari yoğunluk gradyan ortamını yoğunluk gradyanı seyreltici ile %80 hacim/hacme (v/v) kadar seyreltin. Mitokondriyal izolasyon tamponu (MI)/sığır serum albümini (BSA) ekleyerek %80 yoğunluk gradyan ortamı %15 v/v daha da seyreltin.
  2. Mitokondrileri bu deneyler için taze, dondurulmamış dokudan izole edin ve hazırlık gününde, tipik olarak beş saat içinde kullanın26. Tüm izolasyon adımlarını buz üzerinde gerçekleştirin.
    1. Farenin kafasını kesin ve kalbi tüketin. Hemen 1-2 kez Petri kabında buz gibi soğuk MI / BSA ile yıkayın. Atriyumu kesin ve dokuyu kesin.
    2. Kıyılmış kalp dokusunu 1 mL MI / BSA içeren bir cam-cam homojenizatöre aktarın. Daha gevşek (A) bir havane (10 vuruş), daha sonra daha sıkı bir (B) havaneli (10 vuruş) ile homojenize edin.
    3. Nükleer ve hücresel kalıntıları gidermek için homojenatı 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.100 × g'da santrifüj yapın.
    4. Süpernatantı kabarık peletlere dokunmadan nazikçe alın ve bir santrifüj tüpünde 700 μL% 15 yoğunluk gradyan ortamının üzerine dikkatlice yerleştirin. 4 °C'de 15 dakika boyunca 18.500 × g'de santrifüj.
    5. Peleti 1 mL sakkaroz tamponu (SB) / BSA içinde yeniden askıya alın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.000 × g'de santrifüj yapın.
    6. Süper natantı tamamen çıkarın ve atın. SB/BSA'daki peleti 55 μL'lik son hacme kadar yeniden askıya alın.
    7. Biskinkoninik asit (BCA) protein testi gibi standart bir tahlil kullanarak mitokondriyal protein içeriğini sayısallaştırın.

2. Mitokondriyal oksijen (O2) tüketimi ve ΔΨ

  1. Oksijen elektrodu montajı ve kalibrasyonu
    1. Oksijen elektrodunu üreticinin talimatlarına göre kurun ve kalibre edin ( Malzeme Tablosuna bakın).
      1. Elektrot diskinin kubbesinin üzerine %50 damla potasyum klorür (KCl) elektrolit çözeltisi yerleştirin.
      2. Elektrolit damlasının üzerine sağlanan politetrafloroetilen (PTFE) membranın biraz daha büyük bir parçası ile kaplanmış küçük bir parça ~2 cm2 sigara kağıdı ara parçası yerleştirin.
      3. Sağlanan aplikatör aletini kullanarak, küçük elektrot diski O-ring'i elektrotun kubbesi üzerine itin.
        NOT: Hava kabarcığı olmadığından ve membranın pürüzsüz olduğundan emin olun.
    2. Rezervuarı elektrolit çözeltisi ile iyice doldurun.
    3. Daha büyük O-ring'i elektrot diskinin etrafındaki girintiye iyice yerleştirin.
    4. Diski elektrot odasına takın ve kontrol ünitesine bağlayın.
    5. Reaksiyon odasına 2 mL hava doymuş deiyonize su ve odaya PTFE kaplı mıknatıs ekleyin.
    6. Odayı kontrol ünitesinin arkasına bağlayın.
    7. Sıcaklığı 37 °C'ye ve karıştırma hızını 100'e ayarlayın.
    8. Kalibrasyona başlamadan önce sistem sıcaklığının dengelenmesi için 10 dakika bekleyin.
    9. Kalibrasyon sekmesi altında, sıvı faz kalibrasyonu gerçekleştirmek için Sıvı Faz Kalibrasyonu'nu seçin. Sıcaklığın 37 °C'ye ayarlandığını, karıştırma hızının 100 olduğunu ve basıncın atmosferik basınca (101,32 kPa) ayarlandığını onaylayın.
    10. Tamam'a basın ve sinyalin plato yapmasını bekleyin.
    11. Bir platoya ulaşıldığında, Tamam'a basın.
    12. Az miktarda (~20 mg) sodyum ditionit ekleyerek odaya sıfır O2 oluşturun.
    13. Tamam'a basın ve sinyalin plato yapmasını bekleyin.
    14. Bir platoya ulaşıldığında, kalibrasyonu kabul etmek için Kaydet'e basın.
  2. TPP + seçici elektrot montajı
    1. TPP + seçici elektrot ucunu, sağlanan şırıngayı ve esnek iğneyi kullanarak 10 mM TPP çözeltisi ile doldurun ve hava kabarcıklarını önlemeye özen gösterin.
    2. Referans elektrot ve elektrot tutucu dahil olmak üzere TPP + seçici elektrot aparatını üreticinin talimatlarına göre monte edin (bkz.
    3. Kısacası, elektrot tutucu kapağını gevşetin ve dahili referans elektrodunu TPP + ucuna yerleştirin. Ucu sabitlemek için kapağı sıkın. Birlikte verilen kabloyu elektrot tutucusuna ve kontrol kutusunun yardımcı portuna bağlayın.
    4. TPP + seçici elektrot ve referans elektrotlarını, iyon seçici elektrotlar için uyarlanmış piston tertibatına yerleştirin. Referans elektrodunu kontrol kutusunun referans portuna bağlayın.
    5. TPP + seçici ve referans elektrotlarını, iyon seçici elektrotlar için uyarlanmış piston tertibatına yerleştirin.
  3. Reaksiyon odası hazırlığı
    1. Reaksiyon karışımını reaksiyon odasına ekleyin: 10 mM süksinat (kompleks II substrat), 5 μM rotenon (kompleks I inhibitörü), 80 ng mL−1 nigerisin (IMM'de pH gradyanını çökertmek için), 2.5 μg mL-1 oligomisin (durum 4 solunumu indüklemek için) ve solunum tamponu (RB) / BSA reaksiyon tamponu 1 mL'lik son hacme kadar. Odaya hava kabarcıkları sokmaktan kaçınmaya dikkat edin.
    2. TPP+seçici ve referans elektrodu yerinde olacak şekilde uyarlanmış piston tertibatı ile odayı kapatın. Kayda başlamak için GİT'i seçin. Oda kapatıldıktan sonra, iğne uzunluğunu ayarlamak için plastik boru ile modifiye edilmiş ayrı mikroşırıngalar kullanarak doğrudan reaksiyon çözeltisine ek reaktifler sürün.
  4. TPP+ kalibrasyonu
    1. Kararlı bir voltaj sinyali elde edildikten sonra, 3 μM'lik bir nihai konsantrasyona 0,1 mM'lik bir TPP çözeltisinin 1 μM artışını ekleyerek TPP + seçici elektrodu kalibre edin. Her eklemede TPP + voltaj sinyalinde logaritmik bir düşüş olduğunu gözlemleyin.
      NOT: Her deneyin başında TPP + seçici elektrodu kalibre edin.
  5. Veri toplama
    1. O2 ve TPP + izlerinin stabilize olmasına izin verin ve piston tertibatındaki reaktif ekleme portu aracılığıyla reaksiyon odasına 100 μg taze hazırlanmış kardiyomiyosit mitokondri ekleyin ve 0.1 mg mL-1'lik son konsantrasyona ekleyin. Mitokondri enerjilendirildikçe veO2'yi tüketirken odadakiO2 seviyelerindeki düşüşü ve mitokondri bir membran potansiyeli oluştururken ve çözeltiden TPP + 'yı alırken TPP + voltaj sinyalindeki ani artışı gözlemleyin.
    2. Durum 4 solunumu indüklemek için 2.5 μg mL-1 oligomisin ekleyin.
      NOT: O2 tüketim oranları artık proton sızıntısı solunumunun oranını temsil edecektir. Oligomisin, alternatif olarak TPP + 'dan önce reaksiyon odasına eklenebilir.
  6. mPTP'nin açık olasılığını değerlendirme
    1. Sızıntı solunumu sırasında ΔΨ'nin zamanla azaldığını gözlemleyin. İstenilen ΔΨ'ye ulaşıldıktan sonra, mPTP'nin bu spesifik ΔΨ'deki açık olasılığını değerlendirmek için reaksiyon odasına 1 μM CsA (mPTP inhibitörü) ekleyin.
    2. CsA'nınO2 tüketimi ve ΔΨ üzerindeki etkisini CsA ilavesinden önce ve sonra ölçün
    3. Ardışık deneylerde CsA'nın eklendiği ΔΨ'yi değiştirerek mPTP açıklığının voltaj bağımlılığını belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu deneylerde üretilen tipikO2 tüketimi ve ΔΨ eğrileri gösterilmiştir (Şekil 1A,B). TPP + kalibrasyonu ile voltaj sinyalindeki logaritmik düşüş, her deneyin başında gösterilir. Bu logaritmik modelin yokluğu, TPP + seçici elektrot ile ilgili bir sorun olduğunu düşündürebilir. Mitokondri tipik olarak solunum tamponuna eklendikten hemen sonra ΔΨ üretir. ΔΨ, Nernst denklemine dayanan TPP + voltajındaki değişikliklerden yorumlanabilir (mitokondriy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda mPTP'nin açık olasılığını değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Spesifik olarak, düşük iletkenlikli mPTP açıklığı için voltaj eşiği, CsA inhibisyonunun bir dizi ΔΨ üzerindeki proton sızıntısı üzerindeki etkisinin değerlendirilmesiyle belirlendi. Bu tekniği kullanarak, FXS fareleri ve FVB kontrolleri arasındaki mPTP'nin voltaj geçişindeki farklılıkları, dokuya özgü CoQ içeriğindeki farklılıklarıyla tutarlı olarak tanımlayabiliriz. Bu metodolojinin başarısı için kritik olan, mitokondrilerin kullanımdan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmektedir: NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia Üniversitesi Irving Tıp Merkezi Anesteziyoloji Bölümü'ne Fırsat Provost Hedefi Ödülü (K.K.G.), Pediatrik Anestezi Derneği Genç Araştırmacı Araştırma Ödülü (K.K.G.) ve NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)Fisher Scientific15630080
OXYT1 PP sistemleriyle kullanım için pH veya iyon seçici elektrotlar için uyarlanmış piston tertibatı941039
BD Intramedic PE Boru, PE 50, 0.023 inç. 10 ft.Fisher Scientific14-170-11Bhamilton synringe'in uzunluğunu gerektiği gibi değiştirmek için
Sığır Serumu Albümini (BSA). Yağ asidi içermeyenSigmaA7030-10G
Dri-Ref Referans Elektrodu, 2 mmWorld Precision Inst. LLCDRIREF-2
KWIK-Tips WorldPrecision Inst. LLCKWIK-2  iyon seçici elektrot tutucu
Etilen glikol-bis (β -aminoetil eter) -N, N, N ve asal;, N ve asal; -tetraasetik asit   (EGTA)Sigma324626
FVB.129P2-PDE6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/JJackson Laboratuvarı, Bar Harbor, MEFXS fareleri, Fmr1 KO 
FVB.129P2-PDE6b+ Tyrc-ch/AntJJackson Laboratuvarı, Bar Harbor, MEFVB fareleri
Hamilton 80366 Standart Şırıngalar, 10 uL, Çimentolu İğne, 6/pkCole-ParmerEW-07938-30mikroşırınga
Hamilton 80500 Standart Mikrolitre Şırıngalar, 50 uL, Çimentolu İğneliCole-ParmerEW-07938-02mikroşırınga
Hansatech Instruments Oxytherm+ Sistemi (Solunum) KomplePP sistemleriOXYTHERM+Roksijen elektrodu ve yazılımı
Magnezyum Klorür (MgCl2)Sigma1374248
MannitolSigmaM9546-250G
P1, P5-diadenosin-5 ve prime; pentafosfat pentasodyum (AP5A)SigmaD4022-10MG
Percollgradyanı ayırma içinSigmaP1644
Potasyum klorür (KCl)SigmaP3911
Potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4)Sigma5.43841
SükrozSigmaS0389
TPP+ Elektrot İpuçları (3)Dünya Hassas Inst. LLCTIPTPP
, için Elektrot Tutucu Yoğunluk orta

Kaynaklar

  1. Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
  2. Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
  3. Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. Molecular Biology of the Cell. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).
  4. Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
  5. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
  6. Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76(2013).
  7. Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
  8. Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
  9. Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
  10. Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
  11. Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
  12. Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
  13. Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
  14. Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
  15. Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
  16. Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
  17. Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
  18. Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
  19. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  20. Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
  21. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
  22. Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
  23. Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
  24. Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
  25. Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
  26. Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
  27. Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).
  28. Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
  29. Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).
  30. Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).
  31. Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357(2021).
  32. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
  33. Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
  34. Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Membran PotansiyeliSiklosporin AOksijen TüketimiTPP ElektroduKardiyak MitokondriSızıntı SolunumuKalsiyum Yüklemesi
Mitokondriyal Geçirgenlik Geçiş Gözünün Koenzim Q Fazlalığı Ortamında Açık Olasılığının Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.