Farelerde miyokard enfarktüsü bölgesi etrafında ultrason rehberliğinde hücre dağıtımı, hücre nakli için güvenli, etkili ve uygun bir yoldur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Miyokard Enfarktüslü Farelerde Ultrason Rehberliğinde İndüklenen Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit İmplantasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Miyokard enfarktüsü (MI) sonrası hücre tedavisinin temel amacı, hücre aşılama hızını etkili bir şekilde arttırmaktır ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), iskemik hasar sonrası kardiyak onarım için umut verici bir hücre kaynağıdır. Ancak düşük greft oranı, transplantasyon sonrası etkili kalp dokusu rejenerasyonu için önemli bir engeldir. Bu protokol, bir MI bölgesine çoklu hiPSC-CM ultrason rehberliğinde perkütan enjeksiyonların hücre transplantasyon oranlarını etkili bir şekilde artırdığını göstermektedir. Çalışma ayrıca tüm hiPSC-CM kültür sürecini, ön tedaviyi ve ultrason rehberliğinde perkütan dağıtım yöntemlerini tanımlamaktadır. Ek olarak, insan mitokondriyal DNA'sının kullanımı, diğer fare organlarında hiPSC-CM'lerin yokluğunu tespit etmeye yardımcı olur. Son olarak, bu yazıda hücre doğumundan 4 hafta sonra farelerde enfarktüslü sınır bölgesinde kardiyak fonksiyon, anjiyogenez, hücre büyüklüğü ve apoptozdaki değişiklikler açıklanmaktadır. Sol ventrikül miyokardının ekokardiyografi eşliğinde perkütan enjeksiyonunun uygulanabilir, nispeten invaziv, tatmin edici, tekrarlanabilir ve etkili bir hücresel tedavi olduğu sonucuna varılabilir.
Giriş
Akut MI meydana geldiğinde, enfarktüslü bölgedeki miyokard hücreleri iskemi ve hipoksi nedeniyle hızla ölür. Hücre ölümü ve rüptüründen sonra çeşitli enflamatuar faktörler salınırken, enflamatuar hücreler inflamasyona neden olmak için enfarktüs bölgesine sızar1. Önemli ölçüde, fibroblastlar ve kollajen, hem kontraktilitesi hem de elektriksel iletkenliği olmadan, enfarktüs bölgesindeki miyokard hücrelerini skar dokusu oluşturmak için değiştirir. Yetişkin memelilerde kardiyomiyositlerin sınırlı rejenerasyon kapasitesi nedeniyle, geniş bir enfarktüs alanından sonra oluşan canlı doku, yeterli kalp debisini korumak için genellikle yeterli değildir2. MI kalp yetmezliğine neden olur ve ciddi kalp yetmezliği vakalarında, hastalar normal kalp fonksiyonlarını korumak için sadece kalp nakillerine veya ventriküler destek cihazlarına güvenebilirler 3,4.
MI'den sonra ideal tedavi stratejisi, ölü kardiyomiyositlerin yeni oluşan kardiyomiyositlerle değiştirilmesi ve sağlıklı dokularla elektromekanik eşleşmenin oluşturulmasıdır. Bununla birlikte, tedavi seçenekleri tipik olarak replasman yerine miyokard kurtarmayı benimsemiştir. Günümüzde, kök hücre ve progenitör hücre bazlı tedaviler, MI5'ten sonra miyokard onarımını teşvik etmek için en umut verici stratejiler arasındadır. Bununla birlikte, bu hücrelerin transplantasyonunun, yetişkin kök hücrelerin kardiyomiyositlere farklılaşamaması ve kısa ömürleri6 olmak üzere çeşitli sorunları vardır.
Embriyonik kök (ES) hücrelerin kullanımı ile ilgili etik sorunlar, umut verici bir hücre kaynağı olan iPSC'ler tarafından atlatılabilir. Ek olarak, iPSC'ler güçlü kendini yenileme yeteneklerine sahiptir ve kardiyomiyositlere farklılaşabilir7. Çalışmalar, MI bölgesine nakledilen hiPSC-CM'lerin hayatta kalabildiğini ve konakçı hücrelerle boşluk kavşakları oluşturabildiğini göstermiştir8,9. Bununla birlikte, nakledilen bu hücreler iskemi ve inflamasyonun mikro ortamında bulunduğundan, hayatta kalma oranları son derece düşüktür10,11.
Nakledilen hücrelerin hayatta kalma oranını artırmak için, nakledilen hücrelerin hipoksi ve ısı şoku ön tedavisi12,13, genetik modifikasyon 14,15 ve hücrelerin ve kılcal damarların eşzamanlı nakli 16 gibi çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Ne yazık ki, çoğu yöntem karmaşıklık ve yüksek maliyet ile sınırlıdır. Bu nedenle, bu çalışma tekrarlanabilir, uygun, nispeten invaziv ve etkili bir hiPSC-CM dağıtım yöntemi önermektedir.
Ultrason rehberliğinde intramiyokardiyal hücre enjeksiyonu, bölgeden bağımsız olarak sadece yüksek çözünürlüklü küçük bir veteriner ultrason makinesi ve bir mikroenjektör ile gerçekleştirilebilir. Ultrason rehberliğinde, farelerde perikarddan miyokarda ksifoid süreç altındaki hücreleri doğrudan teslim etmek, karaciğer ve akciğer hasarını önleyen güvenli bir protokoldür. Bu yöntem, nakledilen hücrelerin hayatta kalma oranını önemli ölçüde artırmak için diğer teknolojilerle aynı anda birleştirilebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri, Central South Üniversitesi İkinci Xiangya Hastanesi etik komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız. Hücre enjeksiyonu, görüntüleme ve ötenazi için zaman çizelgeleri aşağıdaki gibidir: t0- enfarktüsü indüklemek, t1 hafta- görüntü ve implant hücreleri, t2 hafta- görüntü ve implant hücreleri, t4 hafta- son görüntüleme, ötenazi ve doku toplama.
1. hiPSC kültürü, kardiyomiyosit farklılaşması ve hücre saflaştırması
- DMEM/F12 ve bazal membran matris stok solüsyonunu 4 °C'de buzla 1,5:1 oranında alikot ile karıştırın ve elde edilen karışımı (matris seyreltici) -20 °C'de saklayın. 25 mL DMEM/F12 kültür ortamını 4 °C'de ve 1 mL matris seyrelticiyi buzla iyice karıştırın ve 6 delikli bir plakada 1 mL/kuyucuk yayın. Plakayı 37 ° C'de bir inkübatörde 1 saat dik tutun ve DMEM / F12 süpernatantını kuyucuklardan aspire edin. İşlemi gerçekleştirirken 6 delikli plakanın tabanına dokunmayın.
- HiPSC'leri içeren kriyoprezervasyon tüpünü sıvı azottan çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözün. Kriyoprezervasyon tüpünün dış yüzeyini u alkol ile sterilize edin, alkolü silin ve tüpü steril ultra temiz bir masaya aktarın.
- HiPSC'ler içeren kriyoprezervasyon solüsyonunu nazikçe 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın, 5 mL besleyicisiz ES ortamı ekleyin ve süspansiyonu oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve besleyicisiz ES ortamının 6 mL'sindeki hücreleri yavaşça askıya alın. Hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonunu kültür ortamı ile 5 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın.
- HiPSC'lere 5 μM'lik son konsantrasyona kadar ROCK inhibitörü (Y27632) ekleyin. Y27632 ile hiPSC'leri bazal membran matrisi ile önceden işlenmiş 6 delikli plakaya aktarın ve hiPSC'leri eşit olarak dağıtmak için "8" sayısının şeklini izleyerek 6 delikli plakayı yavaşça döndürün. HiPSC'leri 37 °C, %5 CO2 içeren nemli bir inkübatöre 24 saat boyunca dik konumda yerleştirin. Supernatant'ı Y27632 olmadan besleyicisiz ES ortamıyla değiştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Her gruptaki farelerin sol ventrikül fonksiyonlarının değerlendirilmesi için yapılan ekokardiyografi, MD grubunda MI yaralanmalarının etkili bir şekilde tersine çevrildiğini ortaya koymuştur (Şekil 2A). MI grubu ile karşılaştırıldığında, SD grubu artmış ejeksiyon fraksiyonu (EF) gösterdi (% 30'dan% 35'e; Şekil 2B) ve fraksiyon kısalması (FS) ('den "'ye; Şekil 2C) MI'den sonra. Bununla birlikte, MD grubu farelerde hiPSC-CM'lerin çokl...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmanın kritik adımları arasında hiPSC kültürü, kardiyomiyosit farklılaşması, hiPSC-CM saflaştırma ve fare miyokard enfarktüsü bölgesine hiPSC-CM transplantasyonu yer almaktadır. Anahtar, hiPSC-CM'lerin bölgeye enjekte edildiği enfarktüsün kenarındaki enfarktüs bölgesine doğru tedaviyi transkutanöz olarak yönlendirmek için kardiyak ultrason kullanmaktır.
Kültür süresinin uzamasıyla birlikte, hiPSC-CM fenotipi morfolojide (daha büyük hücre boyutu), yapıda (kas, fibril yoğunluğu, düzenleme...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Büyük Araştırma Planı (No. 91539111to JY), Hunan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Anahtar Projesi (No. 2020SK53420 - JY) ve Hunan Eyaleti Bilim ve Teknoloji İnovasyon Programı (2021RC2106 - CF) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Antikor< / güçlü > | |||
| Kardiyak troponin T | Abcam | ab8295 | |
| Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150105 | |
| Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150110 | |
| Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | |
| Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| İnsan kardiyak troponin T | Abcam | ab91605 | |
| İzolektin B4 Vektör | FL-1201 | ||
| Sarkomerik alfa aktinin | Abcam | ab9465 | |
| Buğday tohumu aglütinin | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| < güçlü > Reaktif< / güçlü> | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| B27 Takviyesi (eksi insülin) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Takviyesi (serum içermez) | Thermo Fisher Scientific | 17– 504-044 | |
| Bouin'in çözümü | Thermo Fisher Scientific | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| siklosporin A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| DOĞRUDAN KIRMIZI | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DNeasy Kan & Doku Kiti | Qiagen | 69504 | |
| HIZLI YEŞİL FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Glikozsuz RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| laktik asit | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Kök Hücre Teknolojileri | 72562 | |
| OCT Bileşik | SAKURA | 4583 | |
| Paraformaldehit | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kiti | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RPMI1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| STEMdif Kardiyomiyosit Dondurma Ortamı/STEMdiff | Kök Hücre Teknolojileri | 5030 | |
| STEMdiff Kardiyomiyosit Destek Ortamı | Kök Hücre Teknolojileri | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| ultrason birleştirme ajanı | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Ekipman ve Malzemeler | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500 Gerçek Zamanlı PCR | |
| kriyostat | Leica | CM1950 | |
| floresan mikroskobu | Olympus | IX83 | |
| ince anatomik makas | Güzel Bilim Araçları | 15000-08 | |
| ince diseksiyon forseps | Güzel Bilim Araçları | 11255-20 | |
| Mikro şırınga | Hamilton | 7633 | |
| Küçük hayvan anestezi makinesi | MATRX | VMR | |
| Ultra yüksek çözünürlüklü küçük hayvan ultrason görüntüleme sistemi | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Software | |||
| Statistical Ürün ve Hizmet Çözümleri | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| İnsan mitokondriyal DNA primerleri | |||
| ileri primer dizisi | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| ters primer dizisi | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
Kaynaklar
- Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
- Lázár, E., et al. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Davis, M. K., et al. State of the art: cardiac transplantation. Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).
- Mancini, D., Colombo, P. C. Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant. Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).
- Zimmermann, W. H. Translating myocardial remuscularization. Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).
- Hu, X., et al. A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization. Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).
- Kempf, H., et al. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Nguyen, P. K., et al. Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review. JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).
- Zimmermann, W. H. Remuscularization of the failing heart. The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).
- Hu, X., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).
- Feng, Y., et al. Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway. Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).
- Fan, C., et al. Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Sun, X., et al. Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats. Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).
- Wu, X., et al. Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873(2021).
- Kannappan, R., et al. Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair. Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Zhao, M., et al. Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice. Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).
- Zhao, M., et al. Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452(2019).
- O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).
- Rainer, P. P., et al. Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction. Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).
- Yu, Y., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167(2019).
- Iwanaga, K., et al. Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
