Hücre içi Wolbachia'yı tespit etmek için birbirini tamamlayan ve Aedes albopictus'tan türetilmiş Aa23 ve Aa23-T'nin Wolbachia enfeksiyonunun antibiyotik kullanılarak tedavi edilen Wolbachia enfeksiyonunun tespit doğruluğunu artıran dört yöntem kullanıldı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Aedes albopictus Hücre Hatlarında Wolbachia Suşu wAlbB'nin Tespiti
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Anne tarafından barındırılan bir endosimbiyont olarak Wolbachia, böcek popülasyonlarının büyük bir bölümünü enfekte eder. Çalışmalar son zamanlarda Wolbachia-transfekte sivrisinekler kullanarak RNA virüsü iletiminin başarılı bir şekilde düzenlendiğini bildirmiştir. Virüsleri kontrol etmek için anahtar stratejiler, sitoplazmik uyumsuzluk yoluyla konakçı üremesinin manipülasyonunu ve immün hazırlama yoluyla viral transkriptlerin inhibisyonunu ve konakçı kaynaklı kaynaklar için rekabeti içerir. Bununla birlikte, Wolbachia-transfekte sivrisineklerin viral enfeksiyona verdiği yanıtların altında yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu yazıda, Wolbachia ve böcek vektörleri arasındaki etkileşimlerin anlaşılmasını arttırmak için Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 hücrelerinde nükleik asit ve protein düzeylerinde Wolbachia enfeksiyonunun in vitro tanımlanması için bir protokol sunulmaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), kantitatif PCR, batı lekesi ve immünolojik analitik yöntemlerin kombine kullanımı sayesinde, Wolbachia ile enfekte olmuş hücrelerin tespiti için tek bir yöntemin kullanılmasından daha doğru olan standart bir morfolojik protokol tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, diğer böcek taksonlarında Wolbachia enfeksiyonunun tespitine de uygulanabilir.
Giriş
Asya kaplan sivrisineği Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), Asya'da ve dünyanın diğer bölgelerinde dang virüsünün (DENV) önemli bir vektörüdür1, germ hattı ve somatik doku2,3 boyunca dağılmış iki tür hücre içi bakterinin, Wolbachia'nın (wAlbA ve wAlbB) doğal bir konakçısıdır. A. albopictus embriyolarından türetilen Aa23 hücre hattı, her ikisi de enfeksiyon4'ü destekleyen ve antibiyotik (Aa23-T) kullanılarak doğal Wolbachia enfeksiyonundan tedavi edilebilen en az iki morfolojik hücre tipinden oluşur.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Malzemeler ve reaktifler
- Hücre kültürü için pirojensiz çözeltiler ve ortamlar kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Tüm çözeltileri hazırlamak için ultra saf su kullanın.
- Çok kontrol işlemini takiben, hücre kültürü için fetal sığır serumu (FBS) seçerken dikkatli olun.
NOT: FBS lotları düzenli olarak değişikliğe tabi olduğundan, bu protokolde ilgili katalog ve lot numaralarını belirtmek mümkün değildir. - Wolbachia içermeyen Aa23-T'ye karşılık gelen A. albopictus yumurtalarından türetilen Aa23 hücre suşlarını seçin.
2. Hücre kültürü
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Wolbachia tespit edilmeden önce, iki hücre hattı arasındaki morfolojik farklılıkları belirlemek için Aa23 ve Aa23-T hücreleri ışık mikroskobu altında gözlendi. Aa23 ve Aa23-T hücreleri en az iki hücre morfolojisine sahiptir, ancak iki hücre tipi arasında belirgin bir morfolojik fark yoktur (Şekil 1). Burada, Aa23 hücreleri, Wolbachia enfeksiyonunu dört yöntem kullanarak tespit etmek için model bir sistem olarak kullanılmıştır. Wolbachiawsp geninin .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücre içi Wolbachia enfeksiyonunun saptanması, Wolbachia-konakçı etkileşimlerinin incelenmesi ve yeni suşlarla hücrelerin başarılı transfeksiyonunun doğrulanması için gereklidir. Bu protokolde, nükleik asit ve protein seviyelerinde hücre içi Wolbachia enfeksiyonunu başarılı bir şekilde tespit etmek için dört yöntem kullanılmıştır. Bu dört deneysel yöntem, hücrelerin Wolbachia enfeksiyonunun tespit doğruluğunu doğruladı ve geliştirdi.
PCR, nükleik asit seviye.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Minnesota Üniversitesi'nden Dr. Xin-Ru Wang'a anlayışlı önerileri ve rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (No.81760374) bir hibe ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Mikroskop | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri kabı | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipet | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platformu | |||
| Analiz yazılımı | Şirket içinde geliştirilen | ||
| Seryum katkılı itriyum alüminyum granat | MSE Malzemeleri | Ce:Y3Al5O12, YAG tek kristal yüzeyler | |
| Çip tutucu | Kurum içi geliştirilen | ||
| Kontrol yazılımı | Kurum içi geliştirilen | ||
| Daldırma yağı | Cargille Laboratories | 16482 | Tip A düşük viskozite 150 cSt |
| inSituX platformu | Şirket içi geliştirilen | ||
| IR ışık kaynağı | Thorlabs Incorporated | LED1085L | Cam Lensli LED, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Dış halka | Şirket içinde geliştirilen | ||
| Pompa lazerleri | Thorlabs Anonim Şirketi | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, ve Oslash; 9 mm, E Pin Kodu, Lazer Diyot |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fonlama | ||
| Tutma halkası | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 tutma halkası & Oslash için; 1" lens tüpleri ve yuvaları |
| Çekirdeksiz kuvars kristali | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25,4 mm çap Z-kesim 0,05 mm kalınlık çift taraflı cila 8 mm on -X |
| Şim | Şirket içi geliştirilen | ||
| X-ışını huzme durdurucu | Şirket içi geliştirildi |
Kaynaklar
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
