Aedes albopictus Hücre Hatlarında Wolbachia Suşu wAlbB'nin Tespiti

Asya kaplan sivrisineği Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), Asya'da ve dünyanın diğer bölgelerinde dang virüsünün (DENV) önemli bir vektörüdür¹, germ hattı ve somatik doku^2,3 boyunca dağılmış iki tür hücre içi bakterinin, Wolbachia'nın (wAlbA ve wAlbB) doğal bir konakçısıdır. A. albopictus embriyolarından türetilen Aa23 hücre hattı, her ikisi de enfeksiyon^4'ü destekleyen ve antibiyotik (Aa23-T) kullanılarak doğal Wolbachia enfeksiyonundan tedavi edilebilen en az iki morfolojik hücre tipinden oluşur. Aa23'ün sadece wAlbB'yi koruduğu göz önüne alındığında, konakçı-endosimbiyont etkileşimlerinin incelenmesi için yararlı bir modeldir ^4,5,6.

Wolbachia maternal olarak bulaşır ve böcek türlerinin tahmini% 65'ini^{enfekte eder 8,9} ve sivrisinek türlerinin% ^{28'i 10}. Çeşitli dokuları enfekte eder ve konakçı ile yakın bir simbiyotik ilişki oluşturur, genellikle konakçı üreme sistemini manipüle ederek sitoplazmik uyumsuzluğa (CI)¹¹ ve popülasyon replasmanına neden olur^12,13. Bu konakçı tepkileri, Drosophila simulans^14'ün doğal popülasyonlarında ve A. aegypti'de bir laboratuvar kafesi ve saha denemesi^15'te gözlenmiştir. Wolbachia tarafından ortaya çıkarılan önemli bir üreme dışı manipülasyon, DENV, Chikungunya virüsü (CHIKV) ve Batı Nil virüsü (WNV) 16,17 dahil olmak üzere çeşitli patojenlere karşı konakçı direncine neden olur; bu, simbiyont ^18,19'un gelişmiş doğuştan gelen bağışıklık sistemi^, Wolbachia ve virüsler arasında temel konakçı kaynakları için rekabet 20 ve konakçı viral savunma yollarının manipülasyonu ²¹ .

Bu protokol, Wolbachia kaynaklı konakçı antiviral yanıtlarının bu altta yatan mekanizmalarını incelemek için geliştirilmiştir. Aa23 hücrelerinin hücre içi Wolbachia enfeksiyonunun tespitinde dört yöntem kullanır. Bu yöntemler, diğer konakçı türlerin hücre içi Wolbachia enfeksiyonu çalışmaları için güçlü bir teorik temel sağlar. İlk yöntem olan PCR - geleneksel klonlama prosedürlerini kullanmadan DNA'nın belirli bölgelerinin enzimatik amplifikasyonuna izin veren güçlü bir teknik - Wolbachia DNA'sını tespit etmek ve Wolbachia enfeksiyonunun varlığını / yokluğunu belirlemek için kullanıldı²². İkinci yöntem, PCR^23'ten önceki şablon miktarıyla doğru orantılı olan her PCR döngüsü sırasında üretilen ürünlerin güvenilir tespiti ve ölçümü için kantitatif PCR (qPCR) kullanarak Wolbachia DNA kopya yoğunluğunu ölçer. Üçüncü yöntem, elektroforezin yüksek ayırma gücünü, antikorların özgüllüğünü ve kromojenik enzimatik reaksiyonların duyarlılığını birleştirerek karmaşık karışımlardaki spesifik proteinleri tespit etmek için en güçlü araçlardan biri olan western blot'u kullanarak hücre içi Wolbachia proteinlerinin varlığını tespit eder. Son yöntem, Wolbachia'nın hücresel alımını doğrulamak ve hücresel lokalizasyonunu belirlemek için Wolbachia yüzey proteinini (wsp) bir antijen-antikor reaksiyonu yoluyla tespit etmek için immünoloji, biyokimya ve mikroskopiyi birleştiren bir immünofloresan testidir (IFA).

Bu makalede, hücrelerde Wolbachia'nın varlığını doğrulamak için yukarıda listelenen dört yöntem açıklanmaktadır; bu, eksojen Wolbachia'nın başarılı bir şekilde transfekte edilip edilmediğini ve hücredeki Wolbachia'nın temizlenip temizlenmediğini tespit etmek için kullanılabilir. Wolbachia'nın hücrelerde mevcut olup olmadığını belirledikten sonra, genomik, proteomik veya metabolomik dahil olmak üzere çeşitli farklı analizler yapılabilir. Bu protokol, Wolbachia'nın Aa23 hücreleri aracılığıyla tespit edilmesini gösterir, ancak diğer hücrelerde de kullanılabilir.

1. Malzemeler ve reaktifler

1. Hücre kültürü için pirojensiz çözeltiler ve ortamlar kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Tüm çözeltileri hazırlamak için ultra saf su kullanın.
3. Çok kontrol işlemini takiben, hücre kültürü için fetal sığır serumu (FBS) seçerken dikkatli olun.
   NOT: FBS lotları düzenli olarak değişikliğe tabi olduğundan, bu protokolde ilgili katalog ve lot numaralarını belirtmek mümkün değildir.
4. Wolbachia içermeyen Aa23-T'ye karşılık gelen A. albopictus yumurtalarından türetilen Aa23 hücre suşlarını seçin.

2. Hücre kültürü

1. FBS ile 4 mL Schneider ortamı ile^{25 cm2} hücre kültürü şişeleri hazırlayın.
2. Şişeleri 28 ° C'de% 5 CO₂ atmosferi altında 5 ila 7 gün ^{7,24 boyunca inkübe edin}.
3. 100x büyütmede ışık mikroskobu kullanarak şişelerdeki lekesiz Aa23 ve Aa23-T hücrelerini gözlemleyin (Şekil 1).

3. DNA ekstraksiyonu

1. Şişe başına% 70-80 birleşene kadar hücreleri 5-7 gün boyunca kültürleyin (adım 2). Hücreleri, bir mikrosantrifüjde 100 × g'da 5 dakika santrifüjleme yoluyla 1 mL yeniden askıya alınmış kültür ortamından manuel pipetleme ile toplayın.
2. Süpernatantı aspirasyonla çıkarın ve elde edilen hücre peletini -20 ° C'de saklayın.
3. Peletleri 0.40 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın, çözeltinin 50 μL'sini bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, 5 μL proteinaz K (20 mg / mL) ekleyin ve 1 saat boyunca 55 ° C'de inkübe edin. Son olarak, ham DNA'yı elde etmek ve -20 ° C'de saklamak için bu tüpleri 99 ° C'de 15 dakika ısıtın.

4. Wolbachia nükleik asidinin tespiti

1. PCR analizi
   1. 8 μL ddH₂O, 10 μL Taq polimeraz (Malzeme Tablosuna bakınız), 1 μL DNA şablonu (adım 3'ten), 0,5 μL ileri ve geri primerler (10 μM) içeren toplam 20 μL'lik reaksiyon hacminde PCR gerçekleştirin: wsp81 F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') ve wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')²⁵, sırasıyla.
   2. Aşağıdaki PCR koşullarını kullanın: 5 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon, ardından 94 ° C'de 35 döngü denatürasyon, 55 ° C'de tavlama ve 72 ° C'de uzatma; daha sonra, 7 dakika boyunca 72 ° C'de son bir uzatma.
   3. Bir jel görüntüleyici kullanarak% 1'lik bir agaroz jeli (PBS'de % 1 w / v agaroz) üzerindeki DNA'yı tespit edin.
2. qPCR analizi
   1. Ekstrakte edilen DNA'dan (adım 3) üç biyolojik replikasyon (n = 6) için Wolbachia genom kopyasını, sırasıyla risozomal protein S6 (RPS6) ileri ve geri primerler (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' ve 5' GAGATGGTCAGGGTGATTT 3', 5' GAGATGGTCAGGGTGATTT 3', sırasıyla) ile normalleştirilmiş wsp primerleri 183 F (5' AAGGAACCGAAGGTTTCTG 3') ve QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3^')22 kullanarak analiz edin.
   2. wAlbB ve RPS6 için standart bir eğri oluşturun.
      1. PMD-18T'den (PCR ürünlerinin verimli klonlanması için özel bir vektör (TA klonlaması)) wsp ve rps6 gen fragmanları içeren rekombinant plazmidden (Ek Dosya) DNA ekstraksiyonu yapın ve plazmid DNA konsantrasyonunu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız).
      2. Plazmid DNA konsantrasyonunu Eq (1) kullanarak kopya sayısı konsantrasyonuna dönüştürün.
         Plazmid kopya sayısı = (1)
      3. Plazmid kopya numarasını 10 1'den^{10 8'e} kadar ultra saf suyla seyreltin ve her konsantrasyon gradyanı için 3 kopya ayarlayın.
      4. TB Green ve gerçek zamanlı bir PCR sistemi kullanarak qPCR amplifikasyonu gerçekleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve her reaksiyonun sonuçlarını kaydedin. Standart bir eğri geliştirmek için Ct değerini kullanın. DNA'yı, 7 μL ddH 2 O, 10.4 μL TB Yeşil (Malzeme Tablosuna bakınız), 1 μL DNA şablonu (Adım 3 tarafından sağlanmıştır) ve 0.8 μL ileri ve geri primerlerden (10 μM) oluşan toplam₂₀μL'lik bir reaksiyon hacminde analiz edin. Aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanın: 5 dakika boyunca 95 °C'de ilk denatürasyon, ardından 10 s için 95 °C'de 40 döngü denatürasyon ve 35 s için 60 °C'de tavlama.
      5. Hücrelerdeki WSP ve RPS6 gen kopya numaralarını, belirlenen standart eğriye göre ve Wolbachia bağıl yoğunluğunu wsp/RPS6'nın kopya sayısına göre hesaplayın. Bağımsız bir örnek t-testi kullanarak verileri analiz edin.
3. Wolbachia proteininin Batı lekesi analizi
   1. Protein ekstraksiyonu
      1. Bir mikrosantrifüj tüpünde altı delikli plakadan (adım 2'den itibaren) 2 × 10⁷ Aa23 ve Aa23-T hücrelerini toplayın, PBS ile üç kez yıkayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 × g'de santrifüj yapın.
      2. RIPA lizis tamponu (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl,% 1 Triton X-100,% 1 sodyum deoksikolat,% 0.1 sodyum dodesil sülfat [SDS], 2 mM sodyum pirofosfat, 25 mM β-gliserofosfat, 1 mM EDTA, 1 mM Na₃VO₄, 0.5 μg / mL leupeptin) ve PMSF (son konsantrasyon 1 mM) ile 1 mL lizat hazırlayın.
      3. Hücre peletine 200 μL lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika bekletin. Lisatları 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.
   2. Süpernatantın wsp konsantrasyonunu, üreticinin talimatlarını izleyerek bir biskinkoninik asit (BCA) protein tahlil kiti kullanarak (Malzeme Tablosuna bakınız) test edin.
   3. % 15'lik bir SDS-PAGE jeline eşit miktarda protein yükleyin [% 10 damıtılmış su; % 50 (% 30 Acr-Bis (29:1), % 38 1 M Tris, pH 8.8; % 1 (% 10 SDS),% 1 (% 10 amonyum persülfat), % 0.04 TEMED].
   4. Proteini nitroselüloz membranlara aktarın, membranları oda sıcaklığında 2 saat^26,27 saat% 5 yağsız sütle bloke edin ve ardından membranları TBST ile üç kez yıkayın (1 L TBS'de 1 mL Ara 20) (Malzeme Tablosuna bakınız).
   5. Membranları 4 ° C'de gece boyunca 100 μL anti-wsp poliklonal antikoru ile inkübe edin (şirket içinde hazırlanan, Ek Dosya'ya bakınız)), primer antikorun% 5 yağsız sütle seyreltilmesiyle hazırlanan (1: 12.000).
   6. Birincil antikoru TBST ile üç kez yıkayın.
   7. Membranları, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde 100 μL yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonjuge sekonder antikor içinde inkübe edin.
   8. Membranları TBST ile üç kez yıkayın ve kemilüminesans tespit kitinde 20 μL çözelti A (HRP Substrat Luminol Reaktifi) ve 20 μL çözelti B (HRP Substrat Peroksit Reaktifi) 1:1 oranında karıştırın. Tüm membranı aynı anda lüminesans çözeltisine daldırın ve çok işlevli bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri gözlemleyin.
4. Wolbachia proteininin immünofloresan lokalizasyonu
   1. 5 × 10⁵ Aa23 ve Aa23-T hücrelerini 28 °C'de, altta 0,17 mm kalınlığında bir Lazer konfokal Petri kabı üzerinde, 3 ila 4 gün boyunca %5 CO 2 atmosferi altında ^7,24 oranında inkübe edin. Hücre% 60 -% 70 birleşene kadar bekleyin ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
   2. PBS'de hücreleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 1 mL% 4 (w / v) paraformaldehit içinde sabitleyin.
   3. Sabit hücreleri PBST kullanarak (PBS'de% 0.2 v / v Triton X-100) 5 dakika boyunca yıkayın ve hücreleri PBS ile iki kez tekrar yıkayın.
   4. PBS'de kızakları 1 mL'lik %3 (w/v) sığır serum albümininde 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
   5. Slaytları gece boyunca 100 μL fare anti-wsp poliklonal antikoru (şirket içinde hazırlanan) ve fare serumunda (PBS'de 1:1.000 seyreltme) ıslak bir kutuda (nemi koruyabilir ve nemin buharlaşmasını önleyebilir) 4 ° C'de inkübe edin.
   6. Slaytları ıslak kutudan çıkarın ve oda sıcaklığına geri getirin; PBS ile üç kez yıkayın ve PBS'yi çıkarın.
      NOT: Adım 4.4.7'den itibaren, tüm işlemler ışıktan korunmalıdır.
   7. Slaytları, 30 dakika boyunca 37 °C'de 100 μL Alexa Fluor 488 konjuge keçi anti-fare antikoru (PBS'de 1:2.000 seyreltme) ile inkübe edin.
   8. Numune slaytlarını 5 dakika boyunca 37 ° C'de 50 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (PBS'de 10 μg / mL'ye seyreltilmiş DAPI, DNA'ya güçlü bir şekilde bağlanır) ile 5 dakika boyunca inkübe edin ve ardından PBS ile üç kez yıkayın.
   9. İmmünoboyamayı konfokal mikroskop altında gözlemleyin.
      1. Gücü ve lazeri açın.
      2. Mikroskobun normal ve cıva lambalarını açın.
      3. Sistemi başlatın ve işletim yazılımını çalıştırın. Numune slaytlarına bir damla sedir yağı koyun, numune slaytlarını mikroskop aşamasına yerleştirin ve sahneyi uygun konuma getirin.
      4. Yazılımdaki cıva lambası gözlem düğmesine tıklayın, cıva lambası deklanşörünü açın ve odaklanmak için ters çevrilmiş bir mikroskop altında numuneyi gözlemleyin.
      5. 100x büyütmenin altında floresan fotoğrafları çekmek üzere yeşil ve mavi floresanı seçmek için manuel kontrol panelini kullanın.
      6. Cıva lambası gözlem düğmesini kapatın ve görüntüleri almaya başlayın.
      7. İyi görüntü kalitesi sağlamak için, tarama boyutuna göre ön tarama yapın (512 piksel x 512 piksel). Net görüntüler elde etmek için tarama boyutunu ayarlayın (1.024 piksel x 1.024 piksel).
      8. Arka plan gürültüsü çok yüksekse gürültü azaltma işlemini gerçekleştirin.
      9. Taramayı durdurun ve görüntüleri kaydedin.
      10. Cıva lambasını ve lazerleri kapatın.
      11. Hedefi u alkolle silin ve hedefi en düşük konuma indirin.
      12. Deklanşör ve mikroskop gücünü kapatın.
      13. Cihaz soğuduktan sonra, toz kapağıyla örtün.

Wolbachia tespit edilmeden önce, iki hücre hattı arasındaki morfolojik farklılıkları belirlemek için Aa23 ve Aa23-T hücreleri ışık mikroskobu altında gözlendi. Aa23 ve Aa23-T hücreleri en az iki hücre morfolojisine sahiptir, ancak iki hücre tipi arasında belirgin bir morfolojik fark yoktur (Şekil 1). Burada, Aa23 hücreleri, Wolbachia enfeksiyonunu dört yöntem kullanarak tespit etmek için model bir sistem olarak kullanılmıştır. Wolbachiawsp geninin tanısal primerleri 81F/691R kullanılarak pozitif amplifikasyonu, Aa23 hücrelerinde (Şerit 1 ve 2) mümkün olmuş, ancak Aa23-T hücrelerinde (Şerit 3 ve 4) mümkün olmamıştır (Şekil 2A). QPCR kullanılarak hücre hatlarındaki Wolbachia yoğunluğunun analizi, Aa23 hücrelerinde 2.4'lük bir wsp / rps6 oranı gösterdi, ancak Aa23-T hücrelerinde Wolbachia yoktu (Şekil 2B). Protein ekstraktlarının Western blot analizi, Aa23 için güçlü bir wsp sinyali ve Aa23-T için sinyal göstermedi (Şekil 3A), dolaylı immünofloresan testi ise Aa23 hücrelerinde (yeşil) wsp proteinini (Şekil 3B) tespit ederken, Aa23-T hücrelerinde sadece DAPI (mavi) ile boyanmış DNA tespit edildi.

Resim 1: Lekesiz Aa23 ve Aa23-T hücrelerinin ışık mikroskopisi. Heterojen morfoloji, oklarla gösterildiği gibi, her iki hücre hattında da birden fazla hücre tipinin bulunduğunu gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Nükleik asit seviyesindeki hücrelerde Wolbachia enfeksiyonunun saptanması. (A) Aa23 ve Aa23-T hücrelerinin PCR analizi% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çözüldü. Wolbachiawsp geninin pozitif PCR amplifikasyonu, tanısal primerler olan 81F / 691R kullanılarak, Aa23 hücrelerinde (Şerit 1 ve 2) gözlenir, ancak Aa23-T hücrelerinde (Şerit 3 ve 4) gözlenmez. (B) Aa23 ve Aa23-T hücrelerinin Wolbachia wsp kopya yoğunluğu. Yoğunluk Aa23 hücrelerinde daha fazlaydı ve Aa23-T hücrelerinde tespit edilemedi. Kopya numarası Aedes albopictus rps6 kullanılarak normalleştirildi; veriler ortalama ± SEM, n = 6'dır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Protein düzeyinde hücrelerde Wolbachia enfeksiyonunun saptanması. (A) Aa23 hücrelerinde (Şerit 1) wsp antikoru ile immünoblotlama, 25 kDa'ya yakın belirgin bir bantla; Tetrasiklin ile muamele edilen Aa23-T (Şerit 2). (B) Wolbachia'nın lokalizasyonunu gösteren hücrelerin immünofloresan etiketlemesi (yeşil); hücreler poliklonal anti-wsp antikoru (Wolbachia) ile incelendi, ardından keçi anti-fare (yeşil) Alexa Fluor 488-konjuge antikorlar ve çekirdekler (mavi) DAPI ile boyandı. Fare serumu negatif kontrol olarak kullanıldı, çünkü anti-wsp antikoru saflaştırılmadı ve poliklonal antikor fare kaynaklı idi. Wolbachia ile enfekte olmuş Aa23 hücreleri (Aa23-anti-wsp) beyaz bir okla belirtilir. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltma: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; M = işaretleyici. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya: Plazmid üretimi ve anti-wsp antikor preparasyonu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.