Method Article

Kromoforların Varlığında ve Yokluğunda Cu(II) ve Peptit Kalıntıları Arasındaki Bağlanma Etkileşimlerinin Ölçülmesi

DOI:

10.3791/63668

⸱

April 5th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of San Francisco, 2Department of Chemistry, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, peptitlere ve proteinlere bağlanan Cu(II)'nin termodinamiğini araştırmak ve ölçmek için elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımına odaklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakır (II), biyolojik sistemlerde temel bir metaldir ve etkileşime girdiği biyomoleküllere benzersiz kimyasal özellikler kazandırır. Çeşitli peptitlere doğrudan bağlandığı ve aracılık yapısından elektron transfer özelliklerine ve katalitik fonksiyon vermeye kadar hem gerekli hem de patolojik rolleri oynadığı bildirilmiştir. Bu Cu(II)-peptid komplekslerinin in vitro bağlanma afinitesini ve termodinamiğini ölçmek, bağlanmanın termodinamik itici gücü, peptid için farklı metal iyonları veya Cu(II) için farklı peptitler arasındaki potansiyel rekabetler ve in vivo olarak Cu(II)-peptid kompleksinin prevalansı hakkında fikir verir. Bununla birlikte, bağlayıcı termodinamiğin nicelleştirilmesi, özellikle peptidi, d-blok metal iyonunu ve bunların etkileşimlerini temsil eden ayrı spektroskopik tutamakların bulunmadığı durumlarda, bir titrasyon deneyi içindeki tüm rakip dengelerin hesaplanması da dahil olmak üzere sayısız faktör nedeniyle zor olabilir.

Burada, Cu (II) -peptid termodinamiğinin doğru bir şekilde ölçülmesi için sağlam bir deney seti sağlanmıştır. Bu makalede, Cu(II) üzerinde gerekli spektroskopik tutamağı sağlamak için kromoforik ligandların varlığında ve yokluğunda elektronik absorpsiyon spektroskopisinin kullanımı ve etiketsiz izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımı üzerinde durulmaktadır. Her iki deneysel teknikte de, tüm rakip dengeleri hesaba katacak bir süreç tanımlanmıştır. Bu makalenin odak noktası Cu(II) üzerinde olsa da, açıklanan deney seti Cu(II)-peptid etkileşimlerinin ötesine geçebilir ve fizyolojik olarak ilgili koşullar altında diğer metal-peptid sistemlerinin doğru bir şekilde ölçülmesi için bir çerçeve sağlayabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyoloji, yaşamın çevresindeki çevreye uyum sağlaması ve hayatta kalması için gereken metal iyonlarının çeşitli kimyasını kullanmak için gelişmiştir. Proteinlerin tahmini% 25 -% 50'si yapı ve işlev için metal iyonları kullanır1. Metal iyonunun özel rolü ve redoks durumu, onu koordine eden biyolojik ligandların bileşimi ve geometrisi ile doğrudan ilgilidir. Ek olarak, Cu(II) gibi redoks-aktif metal iyonları, reaktif oksijen türleri (ROS) 2,3,4 oluşturmak için Fenton benzeri kimya yoluyla oksitleyici ajanlarla etkileşime girmemeleri için sıkı bir şekilde düzenlenmelidir. Biyokimyasını yönlendiren bağlanma modlarını ve afinitesini anlamak, metal iyonunun biyolojik rolünü aydınlatmaya yardımcı olmalıdır.

Metallerin ve peptitlerin bağlanma etkileşimlerini incelemek için birçok teknik kullanılır. Bunlar çoğunlukla spektroskopik tekniklerdir, ancak aynı zamanda bir amiloid beta (Aβ) 5 parçası ile Cu (II) etkileşimlerinde görüldüğü gibi moleküler dinamiği kullanan bilgisayar simülasyonlarını da içerir. Birçok üniversite tarafından erişilebilen yaygın olarak kullanılan spektroskopik bir teknik, nükleer manyetik rezonanstır (NMR). Cu (II)'nin paramanyetik doğasını kullanarak, Gaggelli ve ark. metal iyonunun yakındaki çekirdekleringevşemesi yoluyla bir petide nereye bağlandığını gösterebildiler 6. Elektron paramanyetik rezonansı (EPR), paramanyetik metal iyonu bağlama7'nin yerini ve modunu araştırmak için de kullanılabilir. Dairesel dikroizm (CD) gibi diğer spektroskopik teknikler, tripeptit sistemleri8 gibi sistemlerde Cu(II) ile ilgili koordinasyonu tanımlayabilir ve kütle spektrometrisi stokiyometriyi ve metal iyonunun parçalanma kalıpları 9,10 ile hangi kalıntıların koordine edildiğini gösterebilir.

NMR gibi bu tekniklerden bazıları etiketsizdir, ancak büyük konsantrasyonlarda peptid gerektirir ve bu da çalışma için zorluklar yaratır. Floresan spektroskopisi adı verilen bir başka yaygın teknik, bir tirozin veya triptofanın pozisyonunu bir Cu(II)11,12'den söndürme ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, bu teknik Cu(II) bağlama13'ün bir sonucu olarak yapısal değişiklikler gösterebilir. Bununla birlikte, bu metal-peptit bağlama çalışmalarındaki zorluklar, tüm sistemlerin sahip olmadığı tirozin gibi kromoforik amino asitleri araştırmaları, metal iyonunun klasik bir model altında bağlanması ve tekniğin fizyolojik koşullar altında elverişli olmayabilmesidir. Gerçekten de, bu tür kromoforik amino asitleri içermeyen veya klasik modellere bağlanmayan, bu tekniklerin kullanılmasını engelleyen birkaç peptit ortaya çıkmaktadır14,15. Bu makalede, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında bu senaryolardaki bağlanma özelliklerini değerlendirmek için yaklaşımlar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Biyolojik ligandlar, histidin üzerindeki imidazol halkası gibi metal iyon bağlanmasını etkileyebilecek farklı protonasyon durumlarını benimseyebilir. pH tutarlı bir şekilde korunmazsa, sonuçlar kıvrımlı veya çelişkili olabilir. Bu nedenle, tamponlar metal-protein / peptit etkileşimlerinin incelenmesinde önemli bir bileşendir. Bununla birlikte, birçok tamponun metal iyonları16,17 ile olumlu etkileşime girdiği gösterilmiştir. İlgilenilen biyolojik molekülle rekabet etmenin yanı sıra, tampon, peptid veya proteinin koordine edici atomlarından ayırt edilmesi zor olabilecek benzer koordine edici atomlara sahip olabilir. Bu çalışmada, tampon seçimi ile ilgili özel hususlar göz önünde bulundurularak, Cu(II)-peptid etkileşimlerini incelemek için iki tamamlayıcı teknik olarak elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) üzerinde durulmuştur.

Elektronik absorpsiyon spektroskopisi, metal bağlama etkileşimlerini incelemek için hızlı, yaygın olarak erişilebilir bir tekniktir. Ultraviyole (UV) veya görünür dalga boylarında ışıkla ışınlama, ligand sınıflandırması, metal geometrileri ve görünür bağlanma afiniteleri hakkında değerli bilgiler sağlayan metal merkezli d-d bantlarının emilimine yol açabilir18,19. Bu kompleksler için, metal iyonlarının protein veya peptit çözeltilerine doğrudan titrasyonları, bağlanma stokiyometrilerini ve görünür bağlanma afinitelerini ölçebilir. D5 veya d10 elektron konfigürasyonları gibi bazı durumlarda, kompleks ışığı emmez (yani, spektroskopik olarak sessizdir). Bu spektroskopik olarak sessiz geçiş metal komplekslerinde, bu sınırlamalar, metal iyonuna koordine edildikten sonra, tespit edilebilir yük transfer bantları veren rakip bir ligand kullanılarak aşılabilir. Her iki durumda da, bu yaklaşım sadece stokiyometriyi ve görünür bağlanma afinitesini ölçmekle sınırlıdır ve bağlayıcı entalpiye ilişkin hiçbir içgörü yaklaşımlar olmadan sağlanmamıştır.

Elektronik absorpsiyon spektroskopisinden elde edilen bilgileri tamamlayan ITC, bağlayıcı entalpi20'nin doğrudan ve titiz bir şekilde ölçülmesi için çekici bir tekniktir. ITC, bir bağlama olayı sırasında salınan veya tüketilen ısıyı doğrudan ölçer ve titrasyon sabit basınçta gerçekleştiği için ölçülen ısı, tüm dengelerin entalpisidir (ΔHITC). Ek olarak, bağlanma olayının (n) stokiyometrisi ve görünür bağlanma afinitesi (KITC) ölçülür. Bu parametrelerden, serbest enerji (ΔG ITC) ve entropi (ΔSITC) belirlenir ve bağlanma olayının termodinamik bir anlık görüntüsü sağlanır. Işık emilimine dayanmadığı için ITC, spektroskopik olarak sessiz türler, örneğin d5 veya d10 metal iyon kompleksleri için ideal bir tekniktir. Bununla birlikte, kalorimetri ısıyı ölçtüğünden, herhangi bir eşsiz tampon sistemi ve hesaplanmamış denge, metal iyonu bağlayıcı termodinamiği doğru bir şekilde belirlemek için analizi olumsuz yönde etkileyebilir ve bu faktörleri ele almak için büyük özen gösterilmelidir20. Uygun titizlikle gerçekleştirilirse, ITC metal-protein / peptit komplekslerinin termodinamiğini belirlemek için sağlam bir tekniktir.

Burada, iki tekniğin tamamlayıcı kullanımını göstermek için kromoforik olarak sessiz bir bakır bağlayıcı peptid olan C-peptid kullanılır. C-peptid, insülin olgunlaşması sırasında oluşan 31 kalıntı bölünme ürünüdür (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ); kromoforik kalıntılardan yoksundur, ancak Cu(II)'yi fizyolojik olarak ilişkili afinite14,15 ile bağladığı gösterilmiştir. Cu (II) bağlanma bölgesi, bir glutamat ve bir aspartatın yan zincirlerinden ve ayrıca peptid 14,15'in N-terminusundan oluşur. Bu koordine edici atomlar, yaygın olarak kullanılan birçok tamponlu sisteminkine çok benzer. Burada, elektronik absorpsiyon spektroskopisinde d-d ve yük transfer bantlarının ve ITC'nin C-peptide bağlanan Cu (II) termodinamiğini ölçmede tandem kullanımı gösterilmiştir. Cu(II) bağlanmasının C-peptide bağlanmasını incelemekten yaklaşım, diğer metal iyonlarına ve protein / peptid sistemlerine uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Elektronik absorpsiyon spektroskopisi: tampon rekabeti ile doğrudan titrasyon

  1. Numune hazırlama
    1. Ultra saf su (>18 MΩ direnç) kullanarak pH 7.4'te 50 mM 2-[bis (2-hidroksietil) amino]-2-(hidroksimetil) propan-1,3-diol (bisTris) tamponlu bir çözelti hazırlayın. Eser metal iyonlarını, yüksek afiniteli bir reçine ile müteakip filtrasyon ile en az 2 saat boyunca inkübe ederek çıkarın.
    2. Peptitin bilinen bir miktarını metalsiz tampona çözün veya seyreltin.
      NOT: Küçük yok olma katsayıları21 olan d-d bantlarını izlerken, daha yüksek konsantrasyonlarda peptit kullanılmalıdır. Burada, tamponlanmış çözeltideki C-peptidin son konsantrasyonu 300 μM idi (hacim küvetin boyutuna bağlıdır). C-peptid, katı faz peptid sentezi ile sentezlenmiştir ve literatür14'ün başka bir yerinde detaylandırılmıştır.
    3. 10-15 mM'de bir çözelti yapmak için bilinen bir CuCl2 kütlesini ultra saf suda çözün.
      NOT: Yağışı önlemek için metal tuzunun başlangıçta tamponsuz suda çözülmesi önemlidir. Diğer Cu(II) tuzları kullanılabilir, ancak anyonun zayıf bir şekilde koordine olduğundan emin olmak için dikkatli olunmalıdır.
  2. Denemeyi çalıştırma
    1. Elektronik absorpsiyon spektrofotometresini açın ve kullanmadan önce ~ 15-20 dakika ısınmasına izin verin. Spektrofotometre yazılımını başlatın ve tarama aralığı (200-900 nm), tarama hızı (200 nm / s) ve çift ışın taban çizgisi düzeltilmiş ( Ek Dosyada daha fazla parametre listelenmiştir) gibi parametreleri yapılandırın.
    2. Kiriş yollarında küvet veya numune içermeyen bir taban çizgisi toplayın.
    3. Çift ışınlı spektrofotometrede iki eşleşen küvet kullanarak, bir küveti 115 μL ultra saf su ile ve diğer küveti 115 μL peptid numunesi ile yükleyin. Küvetlerde hava kabarcığı olmadığından emin olun, çünkü bunlar sinyale müdahale edecektir.
    4. Küveti referans ışınına ultra saf su ile ve numune ışınına peptidli küvet yerleştirin.
    5. Metal içermeyen (apo) peptidin absorpsiyon spektrumunu toplayın.
    6. Peptit örneği ile küvete Cu(II) çözeltisinin sub-stokiyometrik bir miktarına (0.5 eşdeğeri, 150 μM) ekleyin. Eklenen Cu(II) hacminin 3 μL'den az olduğundan emin olun ve hacmi daha sonra analiz edilmek üzere kaydedin.
    7. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlerken çözeltiyi karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Çözeltinin 5 dakika boyunca reaksiyona girmesine ve dengelenmesine izin verin ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin.
    8. Aşağıdaki eşdeğerler için peptit çözeltisine adım 1.2.6'daki gibi Cu(II) alikotlarının eklenmesini tekrarlayın: 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 ve 5.0 (veya toplam 300, 450, 600, 900 ve 1.500 μM). Eklenen Cu(II)'nin toplam hacmini ve küvetin toplam hacmini kaydettiğinizden emin olun.
      NOT: Daha fazla çözünürlük isteniyorsa, eşdeğerleri arasındaki boşluğu azaltın.
    9. Numune küveti çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre iyice temizleyin.
    10. Peptit içermeyen tamponlanmış çözeltiyi ekleyin ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin. Her Cu(II) eşdeğeri için absorpsiyon spektrumunu kaydederek 1.2.5-1.2.8 adımlarında olduğu gibi Cu(II) alikotlarının eklenmesini tekrarlayın.
    11. Tüm spektrumları işlenmek üzere csv dosyaları olarak dışa aktarın. Küvetleri üreticinin talimatlarına göre iyice temizleyin ve spektrofotometreyi kapatın.
  3. Verilerin işlenmesi
    1. Tüm spektrumları bir elektronik tablo programına yükleyin.
    2. Yalnızca tampon (0 μM Cu(II)) spektrumunu diğer tüm spektrumlardan çıkararak tamponun kendisinden herhangi bir absorbans özelliğini kaldırın.
    3. Cu(II) çözeltisinin eklenmesinden kaynaklanan seyreltmeyi hesaba katmak için her spektrumu normalleştirin (adım 1.2.6). vbaşlangıcının küvete eklenen peptidin hacmi (115 μL), v Cu(II) adım 1.2.6'da eklenenCu(II) çözeltisinin hacmi ve Abstamponu çıkarılan spektrumun adım 1.2.7'de elde edilen veriler olduğu normalizasyon örneği için Ek Dosya, Eq (1)14'e bakınız.
    4. Değişim bölgelerini tanımlamak için tüm spektrumları birlikte grafiklendirin.
      NOT: Cu(II) komplekslerinden tipik d-d bantları 500 ila 750 nm arasında değişmektedir. Bu spektrofotometrik titrasyon, oktahedral geometri21'de Laporte tarafından yasaklanan geçişler olan d-d bantlarından gelen küçük yok olma katsayısı nedeniyle zor olabilir. Absorbans çok zayıfsa, alternatif bir yaklaşım, Cu(II)'ye bağlandıktan sonra yük transfer bantlarıyla sonuçlanan kromoforik ligandları kullanmaktır (bkz. bölüm 2).

2. Elektronik absorpsiyon spektroskopisi: kromoforik ligand ile peptid rekabeti

  1. Numune hazırlama
    1. ~1 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1,10-fenantrolin (fen) ultra saf suda çözün.
    2. Peptit (adım 1.1.2) ve Cu(II) (adım 1.1.3) için bölüm 1.1'de açıklanan numune preparatına ek olarak, tamponda ([Cu(fen)3]2+) 10 μM Cu(II) ve 40 μM fen çözeltisi hazırlayın. Hacmin küvetin doldurduğundan emin olun.
  2. Denemeyi çalıştırma
    1. Elektronik absorpsiyon spektrofotometresini 1.2.1 ve 1.2.2 adımlarında olduğu gibi başlatın, ancak tarama aralığını 200-400 nm olarak ayarlayın.
    2. Eşleşen iki küvette, bir küveti 115 μL ultra saf su ile ve diğer küveti 115 μL [Cu(phen)3]2+ çözeltisi ile yükleyin. Küvetin referans kirişine su ile ve küvetin numune kirişine [Cu(phen)3]2+ çözeltisi ile yerleştirin.
    3. Metal ligand kompleksinin absorpsiyon spektrumunu toplayın.
    4. [Cu(phen)3]2+ çözeltisine stokiyometrik miktarda (≈1 eşdeğeri, ≈10 μM) peptid ekleyin. İyice karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın, ancak hava kabarcıkları sokmamaya dikkat edin. Gelecekteki analizler için eklenen peptid hacmini kaydedin.
      NOT: 115 μL tutan küvetler kullanıldığında, 3.83 μL 300 μM peptid eklenmesi, 9.7 μM'lik bir nihai peptid konsantrasyonu verir.
    5. Dengeye ulaşmak için çözeltiyi 5 dakika boyunca inkübe edin. Absorpsiyon spektrumunu kaydedin.
      NOT: Metal-peptid ve metal-ligandın bağlanma afinitesi benzerse, eklenen peptid konsantrasyonunun büyük miktarda olması gerekecektir. Normalizasyon için eklenen toplam peptit hacmini hesaba kattığınızdan emin olun.
    6. Aşağıdaki yaklaşık eşdeğerler için [Cu(phen)3]2+ çözeltisine peptid alikotlarının eklenmesini tekrarlayın: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 ve 26 . Seyreltilmiş konsantrasyonun belirlenebilmesi için eklenen peptidin hacmini kaydedin.
    7. Numuneyi çıkarın ve küvetleri üreticinin talimatlarına göre iyice temizleyin. Arabelleğin bir spektrumunu toplayın. Tamponda 50 μM peptid spektrumu toplayın.
    8. Tüm verileri işlemek için csv dosyaları olarak dışa aktarın ve küvetleri üreticinin talimatlarına göre temizleyin.
  3. Verilerin işlenmesi
    1. Spektrumları bir elektronik tablo programına yükleyin ve arabellek spektrumunu diğer spektrumlardan çıkarın.
    2. Ek Dosya, Eq (2)14'ü izleyerek spektrumları normalleştirin.
    3. 265 nm'de [Cu(phen)3]2+ için yok olma katsayısını kullanarak (εmax = 90.000 M-1 cm-1)22, peptidin her ilavesiyle [Cu(phen)3]2+ konsantrasyonunu belirleyin.
    4. Peptitin her bir ilavesi için, 2.3.2 adımında belirlenen [Cu(phen)3]2+ 'nın kalan konsantrasyonunu, [Cu(phen)3]2+ 'nın başlangıç konsantrasyonundan (0 μM peptidde) çıkararak Cu(II)-peptid kompleksinin konsantrasyonunu belirleyin.
    5. Serbest fen ligandının konsantrasyonunu Ek Dosya, Eq (3)14'teki denklemle hesaplayın.
    6. Ek Dosya, Eq (4) 14 kullanarak serbest peptit konsantrasyonunu hesaplayın, burada [peptid] stok, küvete titre edilmiş seyreltilmemiş peptidi temsil eder, V 1, eklenen stok peptidinin hacmini temsil eder, V 2, küvetin toplam hacmidir ve [Cu 2 + -peptid] adım2.3.4'te belirlenir.
    7. Ek Dosya23'teki Eq (5)'i kullanarak deneysel bağlama afinitesini (Kex) hesaplayın.
    8. Cu(II)-peptidin ayrışma sabitini Ek Dosyada Eq (6)23 ile Kex ile ilişkilendirin, burada Kd,Cu(II)-phen = 1.0 × 10-9 (bkz. 22). Belirlenen tüm ayrışma sabitlerinden ortalama ve standart sapmayı belirleyin.
      NOT: 4: 1 phen oranı altında: Cu (II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(phen)2]2+ ve [Cu(phen)]2+ çözeltide bulunur ve peptid, Cu(II)'yi türlerden ([Cu(phen)]2+) en zayıf bağlanma 22 ile şelatlar.

3. İzotermal titrasyon kalorimetrisi

  1. Numune hazırlama
    1. Ultra saf su (>18 MΩ direnç) kullanarak pH 7.4'te 15 mM 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS) tamponlu bir çözelti hazırlayın. Eser metal iyonlarını, şişe üstü 0,45 μm'lik bir membrandan daha sonra vakum filtrasyonu ile en az 2 saat boyunca yüksek afiniteli bir reçine ile inkübe ederek çıkarın.
    2. ≈50-100 mM'lik bir çözelti hazırlamak için bilinen bir CuCl2 kütlesini ultra saf suda çözün. Son konsantrasyonu 1,4 mM Cu(II) olan 1,0 mL'lik bir çözelti elde etmek için bu Cu(II) çözeltisini tampon halinde seyreltin. Kullanılan CuCl 2 çözeltisinin tamhacmini kaydedin.
    3. 154 μM'lik bir peptid çözeltisinin 450 μL'sini yapmak için peptid çözeltisini tamponda çözün veya seyreltin. Peptit çözeltisine, 3.1.2 adımındaki aynı oranda ilave ultra saf suyun eklendiğinden emin olun, bu da seyreltme ısısını azaltacak ve sinyal-gürültüyü artıracaktır.
    4. Numunelerin hazırlanmasından sonra, çözeltilerin aynı pH'ta olduğundan emin olun ve gerekirse buna göre ayarlayın.
    5. İsteğe bağlı adım: ITC'ye yüklenen mikro kabarcıkları en aza indirmek için çözeltilerin gazını çözün.
  2. Denemeyi çalıştırma
    1. ITC'yi açın. Cihazı çalıştırmak için ITC yazılımını başlatın. Böreği yeniden eve döndürmeyi isteyecek ilk başlatmayı bekleyin; tıklayın, sonra ekrandaki yönergeleri izleyin.
    2. Kapağı referans hücresinden çıkarın. Referans hücresinden herhangi bir suyu çıkarın ve 450 μL gazdan arındırılmış ultra saf su ile üç kez durulayın.
    3. Bir yükleme şırıngasının 450 μL işaretine yavaşça ultra saf su çekin, şırıngaya hava kabarcıkları sokmamaya dikkat edin. Yükleme şırıngasını alttan ≈1 mm uzakta olana kadar referans hücresine yerleştirin ve yükleme şırıngasında 150 μL kalana kadar çözeltinin bir kısmını yavaşça enjekte edin. Hücre yüzeyindeki kabarcıkları yerinden çıkarmak için yükleme şırıngası pistonunu birkaç kez ≈25 μL hızla yukarı ve aşağı hareket ettirin. Piston yükleme şırıngasındaki 100 μL işaretine ulaşana kadar yavaşça enjekte edin, böylece referans hücresine toplam 350 μL ultra saf su dağıtın ve referans hücre kapağını değiştirin.
    4. Herhangi bir kalıntı çözeltiyi numune hücresinden çıkarın ve bir yükleme şırıngası kullanarak 450 μL 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile yükleyin. EDTA eser metalleri bağlayacağı için eser metal iyonlarının uzaklaştırıldığından emin olmak için 10 dakika bekletin.
    5. EDTA çözeltisini (bağlı eser metal iyonları ile) çıkarın ve yükleme şırıngasını bol miktarda ultra saf su ile iyice durulayın.
    6. ITC'yi üreticinin talimatlarına uygun olarak temizleyin, numune hücresini ultra saf suyla durulayın.
    7. Numune hücresini en az üç kez 450 μL tamponla durulayın.
    8. Örnek hücreyi koşullandıran arabelleği çıkarın. Yükleme şırıngasını kullanarak peptid çözeltisini numune hücresine yükleyin (adım 3.2.3'ü izleyin).
    9. Titrasyon şırıngasını 200 μL tamponlu çözelti ile durulayın. Bunu yapmak için, pistonu çıkarın ve tamponu cam titrasyon şırıngasının üstündeki delikten, şırıngadan ve aşağıdaki iğneden pipetle çıkarmak için bir mikropipet kullanın.
    10. Pistonu titrasyon şırıngasına tamamen takın.
    11. Titrasyon şırınga iğnesinin ucunu metal çözeltiye batırın ve pistonu yavaşça yukarı çekerek metal çözeltinin şırıngayı doldurmasına neden olur ve titrasyon şırıngasının cam kısmının üstünde bir boşluk hacmine neden olur. Titrasyon şırıngasını zemine paralel olarak döndürerek boşluk hacminin çoğunu çıkarın, pistonu çıkarın ve cam kısmı hafifçe zemine doğru eğin. Titrasyona şırıngayı hafifçe sallayın, böylece çözelti titrasyon şırıngasının cam kısmının sonuna doğru hareket eder ve boşluk hacminin çoğunu doldurur, ancak 2-3 μL boşluk hacminin kaldığından emin olun. Şırıngayı zemine paralel tutarken, pistonu tekrar takın.
    12. Titrasyon şırıngasını dik tutun, iğnenin ucunu tekrar metal çözeltiye batırın ve iğneden hava çıkmayı bırakana kadar pistonu aşağı doğru itin. İğnenin ucunu çözeltide tutarken pistonu yavaşça yukarı çekerek titrasyon şırıngasını 50 μL işaretinin hemen üstüne doğru yükleyin.
    13. Titrasyon şırıngasının cam kısmını dikkatlice böreğe yerleştirin ve parmağınızı sıkana kadar vidalayın. Pistonun sıkıştırılması nedeniyle titrasyon şırıngasından az miktarda çözelti çıktığında, iğnenin ucuna dokunmadan çözeltiyi dikkatlice emmek için hafif hizmet tipi hassas bir silecek kullanın.
    14. Böreği titrasyon şırıngalı numune hücresine yerleştirin ve güvenli bir şekilde sabitleyin.
    15. ITC yazılımındaki parametreleri ayarlayın. Cihaz Kontrolünden başlayarak, karıştırma hızını (tipik karıştırma hızları 150 ila 350 RPM arasında değişir) ve deneyin gerçekleştirileceği sıcaklığı (tipik olarak 25 ° C) ayarlayın. Şırınga ve hücre konsantrasyonlarını milimolar birimler halinde Deney Ayrıntıları altında girin.
    16. Deneme Yöntemi bölümünde, Artımlı Titrasyon'u seçin. Kurulum'a tıklayın ve 20 adet 2,5 μL'lik enjeksiyon belirtin. Bağlanma olayını gözlemlemek için daha fazla çözünürlük gerekiyorsa, enjeksiyon sayısını artırın ve enjeksiyon başına hacmi azaltın. Her enjeksiyon arasındaki zaman aralığını girin, böylece sinyalin dengelenmesi ve taban çizgisine, tipik olarak 300 s'ye dönmesi için yeterince uzun olur.
    17. Denemeyi başlatmak ve verilerin nereye kaydedileceğini belirtmek için çalıştır düğmesini tıklayın.
    18. Deneyin tamamlanmasının ardından, numune hücresini ve titrasyon şırıngasını temizleyin.
    19. Kesin veri toplama sağlamak için tüm denemeleri en az üç kat halinde çalıştırın.
    20. Metal iyonundan seyreltme ısısının küçük olduğundan ve hesaplanmamış denge olmadığından emin olmak için metal çözeltinin tamponlu çözeltiye (peptid yokluğunda) titre edildiği bir kontrol deneyi çalıştırın. Seyreltme ısısı büyükse, mümkünse farklı bir tampon sistemi düşünün.
  3. Verilerin işlenmesi
    1. ITC analiz yazılımını başlatın ve analiz için veri dosyasını yükleyin.
    2. Temel sekmesine gidin ve termogramı inceleyin. Hava kabarcıklarından veya termogramdaki diğer eserlerden evrimleşen veya emilen herhangi bir eksojen ısıya dikkat edin. Metal çözeltinin enjeksiyonundan kaynaklanmayan sivri uçları arayın.
    3. Analiz yazılımı tarafından oluşturulan taban çizgisinin, enjeksiyon ve dengelemeden sonra verilerin bir kısmını takip ettiğinden emin olun. Sapma olursa, taban çizgisini ayarlamak için Temel Pivot Noktaları'nı kullanın. Entegrasyon Bölgelerinin , metalin enjeksiyonundan üretilen tepe noktasını içerdiğinden emin olun, ancak adım 2'de bulunan termogramdaki hava kabarcıklarını veya eserleri engelleyin. Taban çizgisini termogramdan çıkarın.
      NOT: Bu tür bir manipülasyon yalnızca birden fazla termogram toplandıktan sonra önerilir, bu nedenle deneyci gerçek verilerin ne olduğunu ve bir yapının ne olduğunu bilir, çünkü taban çizgisini ve Entegrasyon Bölgelerini ayarlamak verileri büyük ölçüde etkileyebilir.
    4. Analiz yazılımının her enjeksiyon için entegre ve konsantrasyon normalleştirilmiş verileri göstereceği verileri sığdırmaya başlamak için Modelleme penceresine gidin.
    5. Montaj algoritmasından çıkarmak için ilk enjeksiyonun verisine sol tıklayın.
      NOT: Bu yaygındır, çünkü titrant ve numune hücre çözeltisi arasında küçük bir karışım olacaktır ve bu da ilk enjeksiyonun kesin olmayan azı dişlerinin dağıtılmasına yol açacaktır.
    6. Modeller bölümünde, son enjeksiyon entalpisi temel alınarak her veri noktasından çıkarılacak olan ve seyreltme ısısını hesaba katarak Stil açılır menüsünde Boş (sabit) seçeneğini belirleyin. Ayrıca, verileri sığdırmak için ikinci Stil açılır menüsünde Bağımsız'ı (veya sistem için en iyi modeli) seçin.
      NOT: Standart 1:1 bağlama etkileşimleri için en yaygın model Bağımsız'dır.
    7. Yeşil oynat düğmesine Σ ile basarak iki modeli kullanarak verileri sığdırın.
      NOT: ITC verilerini işlemek için başka bir yazılım SEDPHAT24'tür.
    8. Daha önce Grossoehme ve ark. tarafından bildirilen post hoc analizdeki tüm rakip dengeleri hesaba katın. 20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amaç, elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve ITC'nin tamamlayıcı tekniklerini kullanarak C-peptide bağlanan Cu (II) termodinamiğini ölçmek ve doğrulamaktı. Elektronik absorpsiyon spektroskopisinin sağlam doğası nedeniyle, Cu(II)'nin 300 μM C-peptide doğrudan titrasyonu gerçekleştirilmiştir (Şekil 1). 150 μM Cu(II) ilavesi, Cu(II)'nin d-d bandına atfedilen 600 nm'de bantta ani bir artışa neden oldu ve 300 μM Cu(II) eklenene kadar artmaya devam etti. 300 μM Cu(II)'nin üzerindeki ilave ekleme...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, peptitlere bağlanan Cu(II)'nin afinitesini ve termodinamiğini ölçmek için sağlam bir yöntem sunmaktadır. Cu(II) içeren kompleksler, d9 elektron konfigürasyonu nedeniyle metal sahasındaki d-d absorpsiyon bandını izlemek için idealdir. Her ne kadar yok olma katsayısı küçük olsa da, bu nedenle güvenilir bir sinyal vermek için kompleksin daha büyük konsantrasyonlarını gerektirse de, Cu(II)'nin peptide titrasyonları, bağlanma stokiyometrisi ve yaklaşık bağlanma afinitesi hakkında hızlı bir şekilde fikir ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SC, Whitehead Yaz Araştırma Bursu'na teşekkür eder. MJS, San Francisco Üniversitesi'ndeki Başlangıç Fonlarına ve Fakülte Geliştirme Fonu'na teşekkür eder. MCH, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH MIRA 5R35GM133684-02) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF KARİYER 2048265) gelen fonları kabul etmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,10-fenantrolinSigma Aldrich131377-25G
bis-Tris tamponuFisherBP301-100
Şişe üstü 0.45 mikron membranNalgene296-4545Kirletici maddeler eklemeden reçineyi çıkaran herhangi bir filtreleme sistemi kabul edilebilir
Bakır(II) klorürAlfa Aesar12458
EDTASigma AldrichEDS-500G
Elektronik absorpsiyon spektrofotometresiVarianCary 5000Başka bir uygun hassas spektrofotometre kabul edilebilir
yüksek afiniteli reçinedirSigma AldrichC7901-25G
İzotermal titrasyon kalorimetresi (ITC)TA InstrumentsNano ITC Düşük Hacimli
ITC analiz yazılımıTA InstrumentsNanoAnalyzeSEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137– 148) ITC yazılımı da kullanılabilir
TA InstrumentsITCRun
hafif hizmet tipi hassas silecekKimwipe34155
yükleme şırıngasıHamiltonSyr 500 uL, 1750 TLL-SAL
uyumlu küvetlerStarna Cells, Inc16.100-Q-10/Z20Küçük hacimli küvet penceresinin spektrofotometrenin
MOPS tamponuAlfa AesarA12914
spektrofotometre yazılımıCaryWinUV Scan
elektronik tablo programıMicrosoftExcelHerhangi bir uygun elektronik tablo programı
titrasyon şırıngasıçalışacaktır TA Instruments5346
ultra saf suMillipore SigmaMilli-Q>18 M & Omega olduğu sürece herhangi bir su tamam; direnç
ışın yüksekliğine uygun olduğundan emin olun

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
  2. Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
  3. Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
  4. Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
  5. Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
  6. Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
  7. García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
  8. Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
  9. Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
  10. Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
  11. Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
  12. Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
  13. Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
  14. Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
  15. Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
  16. Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
  17. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  18. Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
  19. Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366(2014).
  20. Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
  21. Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
  22. Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
  23. Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
  24. Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
  25. NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
  26. Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
  27. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cu II PeptideMetal Peptide BindingBinding ThermodynamicsElectronic Absorption SpectroscopyIsothermal Titration CalorimetryChromophoric LigandsMetal Protein InteractionsCircular DichroismMass SpectrometryBinding Affinity

Related Articles