Yöntem makalesi
Bu makale, aynı mikroskop platformuna entegre edilmiş uyarılmış Raman saçılmasının (SRS) ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılmasının (CARS) çözünürlüğünü, hassasiyetini ve görüntüleme kontrastlarını doğrudan karşılaştırmaktadır. Sonuçlar, CARS'ın daha iyi bir uzamsal çözünürlüğe sahip olduğunu, SRS'nin daha iyi kontrastlar ve spektral çözünürlük sağladığını ve her iki yöntemin de benzer hassasiyete sahip olduğunu göstermektedir.
Uyarılmış Raman saçılması (SRS) ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) mikroskobu en yaygın kullanılan tutarlı Raman saçılma görüntüleme teknolojileridir. Hiperspektral SRS ve CARS görüntüleme, her pikselde Raman spektral bilgisi sunar ve bu da farklı kimyasal bileşimlerin daha iyi ayrılmasını sağlar. Her iki teknik de iki uyarma lazeri gerektirse de, sinyal algılama şemaları ve spektral özellikleri oldukça farklıdır. Bu protokolün amacı, hem hiperspektral SRS hem de CARS görüntülemeyi tek bir platformda gerçekleştirmek ve farklı biyolojik örnekleri görüntülemek için iki mikroskopi tekniğini karşılaştırmaktır. Spektral odaklama yöntemi, femtosaniye lazerler kullanılarak spektral bilgi elde etmek için kullanılır. Standart kimyasal numuneler kullanılarak, SRS ve CARS'ın aynı uyarma koşullarında (yani, numunedeki güç, piksel bekleme süresi, objektif lens, darbe enerjisi) hassasiyeti, uzamsal çözünürlüğü ve spektral çözünürlüğü karşılaştırılır. Biyolojik örnekler için CARS ve SRS'nin görüntüleme kontrastları yan yana getirilir ve karşılaştırılır. CARS ve SRS performanslarının doğrudan karşılaştırılması, kimyasal görüntüleme için modalitenin optimal seçimine izin verecektir.
Raman saçılma fenomeni ilk olarak 1928'de C. V. Raman1 tarafından gözlemlenmiştir. Bir olay fotonu bir örnekle etkileşime girdiğinde, fotonun enerji değişiminin analiz edilen kimyasal türlerin titreşimsel geçişiyle eşleştiği elastik olmayan bir saçılma olayı kendiliğinden meydana gelebilir. Bu işlem kimyasal etiket kullanımını gerektirmez, bu da onu numune bozulmasını en aza indirirken kimyasal analiz için çok yönlü, etiketsiz bir araç haline getirir. Avantajlarına rağmen, spontan Raman saçılması, analiz2 için uzun edinme süreleri gerektiren düşük bir saçılma kesitinden (tipik olarak kızılötesi [IR]....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. Hiperspektral CRS görüntüleme için enstrümantal kurulum
NOT: CRS sinyalinin oluşturulması, yüksek güçlü (yani sınıf 3B veya sınıf 4) lazerlerin kullanılmasını gerektirir. Güvenlik protokolleri ele alınmalı ve bu kadar yüksek tepe güçlerinde çalışırken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilmelidir. Denemeden önce uygun belgelere başvurun. Bu protokol, ışın yolunu tasarlamaya, femtosaniye darbelerini cıvıl cı Bu hiperspektral CRS mikroskobunun genel optik düzeni Şekil 1'de gösterilmiştir. Burada gösterilen yapılandırma, CRS mikroskobu için mevcut birçok yapılandırmadan biridir. Bu ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Spektral çözünürlüğün karşılaştırılması
Şekil 2, bir DMSO örneği kullanarak hiperspektral SRS (Şekil 2A) ve CARS (Şekil 2B) mikroskobunun spektral çözünürlüğünü karşılaştırır. SRS spektrumu için, spektruma uyacak şekilde iki Lorentzian fonksiyonu (protokol adım 2.3'e bakınız) uygulandı ve 2.913 cm-1 tepe noktası kullanılarak 14.6 cm-1'lik bir çözünürlük elde edildi. CARS için, 17.1 cm-1'lik .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Burada sunulan protokol, multimodal CRS mikroskobunun yapımını ve CARS ile SRS görüntüleme arasındaki doğrudan karşılaştırmayı açıklamaktadır. Mikroskop yapımı için kritik adımlar mekansal ve zamansal ışın örtüşmesi ve ışın boyutu optimizasyonudur. SNR'yi optimize etmek ve Raman kaymalarını kalibre etmek için biyolojik görüntülemeden önce DMSO gibi standart bir numune kullanılması önerilir. CARS ve SRS görüntüleri arasındaki doğrudan karşılaştırma, CARS'ın daha iyi bir uzamsal çözünürlüğe sahip olduğunu ortaya koyarken, .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Bu araştırma Purdue Üniversitesi Kimya Bölümü başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2D galvo tarayıcı seti | Thorlabs | GVS002 | |
| Akusto-optik modülatör | Isomet | M1205-P80L-0.5 | |
| AOM sürücüsü | Isomet | 532B-2 | |
| Veri toplama kartı | National Instruments | PCle 6363 | Özel sipariş edilen filtre (980 sp) |
| Gecikme aşaması | Zaber | X-LSM050A | |
| Döteryum oksit | Millipore Sigma | 151882-100G | |
| Işın kombinasyonu için dikroik ayna | Thorlabs | DMLP1000 | |
| Sinyal ayırma için dikroik ayna | Semrock | FF776-Di01-25x36 | |
| DMSO | MiliporeSigma | 200-664-3 | |
| MIA PaCa 2 Hücreli | ATCC | CRL-1420 | |
| Femtosaniye lazer sistemi | Spektral Fizik | InSightX3+ | |
| CARS için Filtre | Chroma | AT655/30m | |
| SRS | Chroma | ET980sp | |
| Fonksiyon üreteci | Rigol | DG1022Z | |
| Cam çubuklar | Kafes Elektro Optik | SF-57 | |
| Yarım dalga plakası | Newport | 10RP02-51; 10RP02-46 | |
| LabVIEW 2020 | Ulusal Enstrümanlar | Bu, görüntü elde etme yazılımıdır | |
| Kilitli amplifikatör | Zürih Enstrüman | HF2LI | |
| Mikroskop muhafazası | Olympus | BX51W1 | |
| Objektif lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Origin Pro 2019b | OriginLab Corporation | Bu spektral montaj yazılımıdır | |
| Osiloskop | Tektronix | TBS2204B | |
| Fotodiyot | Hamamatsu | S3994-01 | |
| PMT dedektörü | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| PMT voltaj amplifikatörü | Gelişmiş Araştırma Enstrümanı A.Ş. | PMT4V3 | |
| Polarize ışın ayırıcı küp | Thorlabs | PBS255 | |
| Terminal bloğu | Ulusal Aletler | BNC-2110 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste