Protokol, insan akciğer organoidlerini birincil akciğer dokularından türetmek, akciğer organoidlerini genişletmek ve insan hava yolu epitelini sadık bir şekilde fenotoskopik eden 3D ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşmayı indüklemek için bir yöntem sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Olgun Hava Yolu Organoidleri Üretmek için İnsan Akciğer Organoidlerinin ve Proksimal Farklılaşmasının Kurulması
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan solunum epitelinin sağlam bir in vitro modelinin olmaması, solunum sisteminin biyolojisinin ve patolojisinin anlaşılmasını engellemektedir. İnsan akciğer organoidlerini akciğer dokusundaki yetişkin kök hücrelerden türetmek ve olgun hava yolu organoidleri oluşturmak için proksimal farklılaşmayı indüklemek için tanımlanmış bir protokol tanımladık. Akciğer organoidleri daha sonra yüksek stabilite ile 1 yıldan fazla bir süre boyunca ardışık olarak genişletilirken, farklılaşmış hava yolu organoidleri morfolojik ve fonksiyonel olarak insan hava yolu epitelini fizyolojik bir seviyeye yakın bir seviyeye kadar simüle etmek için kullanılır. Böylece, insan hava yolu epitelinin sağlam bir organoid modelini oluşturuyoruz. Akciğer organoidlerinin ve farklılaşmış hava yolu organoidlerinin uzun süreli genişlemesi, bilim adamlarının kültür yemeklerinde insan hava yolu epitel hücrelerini yeniden yapılandırmalarını ve genişletmelerini sağlayan istikrarlı ve yenilenebilir bir kaynak oluşturur. İnsan akciğer organoid sistemi, virüs-konakçı etkileşimi, ilaç testi ve hastalık modellemesinin incelenmesi de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için benzersiz ve fizyolojik olarak aktif bir in vitro model sağlar.
Giriş
Organoidler, organ gelişiminin in vitro modellenmesi ve biyoloji ve hastalıkların incelenmesi için sağlam ve evrensel bir araç haline gelmiştir. Büyüme faktörü tanımlı bir kültür ortamında kültürlendiğinde, çeşitli organlardan gelen yetişkin kök hücreler (ASC) 3 boyutlu (3B) olarak genişletilebilir ve organoidler olarak adlandırılan çoklu hücre tiplerinden oluşan organ benzeri hücresel kümelere kendiliğinden monte edilebilir. Clevers'in laboratuvarı, 2009 yılında ilk ASC türevi organoid, insan bağırsak organoidinin türetildiğini bildirdi 1,2. Daha sonra, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan insan dokularını kullanan tüm deneyler, Hong Kong Üniversitesi / Hastane Otoritesi Hong Kong Batı Kümesi (UW13-364 ve UW21-695) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Doku toplanmasından önce hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.
1. İnsan akciğer organoidinin türetilmesi
- Deney materyallerinin hazırlanması
- Gelişmiş DMEM / F12 ortamını 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile destekleyerek bazal ortam hazırlayın.
- Bazal besiyeri% 10 R-spondin 1 şartlı ortam,% 10 Noggin şartlı ortam,% 10 Noggin şartlı ortam, 1x B27 takviyesi, 1....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, insan akciğer organoidlerinin yüksek başarı oranıyla türetilmesini sağlar. Taze insan akciğer dokusu küçük parçalara ayrılır ve daha sonra kollajenaz ile ayrıştırılır. Elde edilen tek hücreler bodrum matriksine gömülür ve epitel kök hücrelerinin büyümesi için niş faktörlerin bir kokteyli ile desteklenen akciğer organoid genişleme ortamında inkübe edilir (adım 1.1.2). Şekil 1 , indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi Tip 2'ye gömülü yeni izole edilmiş akciğer hücrelerini.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İnsan hava yolları, psödostratifiye siliyer epitel olarak da bilinen hava yolu epiteli ile kaplıdır. Üst solunum yolu epitelinin ana hücre tipleri, apikal kirpiklerinin mukus ve solunan parçacıkları hava yollarından dışarı atmak için koordineli hareketini sağlayan siliye hücreler, mukus üreten ve salgılayan kadeh hücreleri ve bazal membranı kaplayan ve rejenerasyonda rol oynayan bazal hücrelerdir. Bronşiyoller gibi küçük hava yolunda, küboidal hava yolu epiteli, salgı kulübü hücreleri ve üst solunum yolu bölgelerine göre.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
J. Z., C.L. ve M.C.C., hava yolu organoidlerinin patentinde mucit olarak listelenmiştir (yayın No: US-2021-0207081-A1). Diğer yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Hong Kong Üniversitesi PanorOmik Bilimler ve Elektron Mikroskobu Birimi Merkezi, Li Ka Shing Tıp Fakültesi'ne konfokal görüntüleme ve akış sitometrisindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Gıda ve Sağlık Bürosu'nun Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu'ndan (HMRF, 17161272 ve 19180392) gelen fonlarla desteklenmiştir; Araştırma Hibeleri Konseyi Genel Araştırma Fonu (GRF, 17105420); ve Health@InnoHK, İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu, Hong Kong Özel İdari Bölgesi Hükümeti.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| < Akciğer organoid kültürü için güçlü > reaktifler< / güçlü > | |||
| Gelişmiş DMEM / F12 | Invitrogen | ||
| 12634010-A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 takviyesi | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Matrisi, Tip 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | %70-80 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamin) | İnvitrojen | 35050061 1x | |
| HEPES 1M | İnvitrojen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Asetilsistein | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nikotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (koşullu orta) | ev | yapımı-10x | |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL) | İnvitrojen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 ve mikro; g/mL |
| Rspondin1 (koşullu orta) | ev | yapımı-10x | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 & mikro; M |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 & M |
| Proksimal farklılaşma ortamı | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 & mikro; M |
| Heparin | Solüsyonu Kök Hücre Teknolojisi | 7980 | 4 & g/mL |
| Hidrokortizon Stok Çözeltisi | Kök Hücre Teknolojisi | 7925 | 1 & M |
| PneumaCult-ALI 10X Takviyesi | hava sıvı arayüz takviyesi | ||
| PneumaCult-ALI Bazal Orta Kök | Hücre Teknolojisi | 05001 | hava sıvı arayüzü bazal ortam |
| PneumaCult-ALI Bakım Takviyesi | hava sıvı arayüzü bakım takviyesi | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 &mikro; M |
| Ekipman | |||
| Biyolojik güvenlik kabini | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 veya 800 | Zeiss | konfokal mikroskop | |
| CO2 İnkübatörü | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-mikroskop | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serolojik pipetleyici | Eppendorf | ||
| Mikropipet | Eppendorf | ||
| ZEN siyah veya ZEN mavi yazılım | Zeiss | analiz yazılımı | |
| Sarf malzemeleri | |||
| 12mm Trans-kuyu | Kök Hücre Teknolojisi | # 38023 | |
| 12 oyuklu hücre kültürü plakası | Cellstar | 665970 | |
| 15 ve 50 ml konik tüpler | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24 oyuklu hücre kültürü plakası | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-kuyu | Kök Hücre Teknolojisi | # 38024 | |
| Tıbbi Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 &; mikro; m | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Mikrofüj tüpleri | Eppendorf | ||
| Mikropipet uçları | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipet camı | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serolojik pipetler (5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antikorlar< / güçlü > | |||
| Keçi Anti-Fare Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Keçi Anti-Fare, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Keçi Anti-Tavşan Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Keçi Anti-Tavşan Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Keçi Anti-Sıçan Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Fare Anti-Sitokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Fare Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Fare Anti-Müsin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Fare Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Tavşan Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Sıçan Anti-Uteroglobin / CC-10 | R& D Sistemleri | MAB4218-SP | |
| Diğer reaktif | |||
| TripLE Enzimi Seçin (10X) | Thermo Fisher Bilimsel | A1217701 | ayrışma enzimi |
Kaynaklar
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. S....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
