Olgun Hava Yolu Organoidleri Üretmek için İnsan Akciğer Organoidlerinin ve Proksimal Farklılaşmasının Kurulması

Organoidler, organ gelişiminin in vitro modellenmesi ve biyoloji ve hastalıkların incelenmesi için sağlam ve evrensel bir araç haline gelmiştir. Büyüme faktörü tanımlı bir kültür ortamında kültürlendiğinde, çeşitli organlardan gelen yetişkin kök hücreler (ASC) 3 boyutlu (3B) olarak genişletilebilir ve organoidler olarak adlandırılan çoklu hücre tiplerinden oluşan organ benzeri hücresel kümelere kendiliğinden monte edilebilir. Clevers'in laboratuvarı, 2009 yılında ilk ASC türevi organoid, insan bağırsak organoidinin türetildiğini bildirdi ^1,2. Daha sonra, prostat 3,4, karaciğer ^5,6, mide ^7,8,9, pankreas ¹⁰, meme bezi 11 ve akciğer ^12,13 dahil olmak üzere çeşitli insan organları ve dokuları için ASC türevi organoidler kurulmuştur. . Bu ASC türevi organoidler, doğal organın kritik hücresel, yapısal ve fonksiyonel özelliklerini korumuş ve uzun süreli genişleme kültüründe genetik ve fenotipik stabiliteyi korumuştur^14,15.

Organoidler ayrıca embriyonik kök (ES) hücreler ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücre¹⁶ dahil olmak üzere pluripotent kök hücreden (PSC) türetilebilir. PSC türevi organoidler, kuruluşları için organ gelişim mekanizmalarından yararlanırken, ASC'ler, fizyolojik doku kendini yenileme veya doku onarımı sırasında kök hücre nişini taklit eden koşulları yeniden inşa ederek organoidler oluşturmaya zorlanabilir. PSC türevi organoidler, ASC türevi organoidlerin karşılaştırılabilir olgunlaşma seviyesine ulaşamasalar da, gelişim ve organogenezi araştırmak için elverişli modellerdir. PSC türevi organoidlerin fetal benzeri olgunlaşma durumu ve bu organoidlerin kurulmasının karmaşıklığı, olgun dokularda biyoloji ve patolojiyi incelemek için geniş uygulamalarını büyük ölçüde engellemektedir.

Burundan terminal bronşiyolele kadar insan solunum yolu, dört ana hücre tipinden, yani siliye hücre, kadeh hücresi, bazal hücre ve kulüp hücresinden oluşan psödostratifiye siliyer epitel olarak da adlandırılan hava yolu epiteli ile kaplıdır. ASC türevi insan akciğer organoidini, Clevers'in laboratuvarı^12,13 ile işbirliği içinde insan akciğer dokularından kurduk. Bu akciğer organoidleri, bir yıldan fazla bir süredir genişleme ortamında ardışık olarak genişletilir; kesin süre, farklı donörlerden elde edilen farklı organoid çizgiler arasında değişir. Bununla birlikte, doğal hava yolu epiteli ile karşılaştırıldığında, bu uzun süreli genişleyen akciğer organoidleri, insan hava yolundaki ana hücre popülasyonu olan siliyer hücreler bu akciğer organoidlerinde yeterince temsil edilmediğinden, yeterince olgun değildir. Bu nedenle, proksimal bir farklılaşma protokolü geliştirdik ve hava yolu epitelini morfolojik ve fonksiyonel olarak fizyolojik bir seviyeye yakın bir seviyeye kopyalayan 3D ve 2D hava yolu organoidleri ürettik.

Burada, birincil akciğer dokularından insan akciğer organoidlerini türetmek, akciğer organoidlerini genişletmek ve 3D ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşmayı indüklemek için bir video protokolü sunuyoruz.

Burada açıklanan insan dokularını kullanan tüm deneyler, Hong Kong Üniversitesi / Hastane Otoritesi Hong Kong Batı Kümesi (UW13-364 ve UW21-695) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Doku toplanmasından önce hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.

1. İnsan akciğer organoidinin türetilmesi

1. Deney materyallerinin hazırlanması
   1. Gelişmiş DMEM / F12 ortamını 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile destekleyerek bazal ortam hazırlayın.
   2. Bazal besiyeri% 10 R-spondin 1 şartlı ortam,% 10 Noggin şartlı ortam,% 10 Noggin şartlı ortam, 1x B27 takviyesi, 1.25 mM N-asetilsistein, 10 mM nikotinamidin, 5 μM Y-27632, 500 nM A-83-01, 1 μM SB202190, 5 ng / mL fibroblst büyüme faktörü (FGF)-7, 20 ng / mL FGF-10 ve 100 μg / mL primosin ile takviye ederek insan akciğer organoid genişleme ortamı hazırlayın (bkz.
      NOT: R-spondin 1 ve Noggin şartlandırılmış ortam, ticari rekombinant R-spondin 1 (500 ng / mL) ve Noggin (100 ng / mL) ile değiştirilebilir.
   3. Bir hücre kültürü inkübatöründe 24 kuyucuklu bir süspansiyon kültür plakasını önceden ısıtın. % 5 CO₂ ve 37 ° C'de nemlendirilmiş atmosfere sahip standart bir hücre kültürü inkübatörü kullanın. Bodrum matrisini 4 °C buzdolabında çözün. Deney sırasında bodrum matrisini ve kültür ortamını buz üzerinde tutun.
2. 3D organoid kültür için insan akciğer dokularından hücre izolasyonu
   1. Çeşitli hastalıklar nedeniyle cerrahi rezeksiyon yapılan hastalardan yaklaşık 0,5 cm büyüklüğünde taze rezeke edilmiş insan akciğer dokuları temin edilir. Akciğer dokularını oda sıcaklığında 30 mL bazal ortamda taşıyın ve bir biyogüvenlik başlığı içinde mümkün olduğunca çabuk işleyin.
   2. Akciğer dokularını 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında steril bir neşterle küçük parçalara (0.5-1 mm) doğrayın. Doku parçalarını 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 mL soğuk bazal ortam ile yıkayın, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın.
   3. Süpernatantı atın ve peleti, 2 mg / mL'lik son konsantrasyonda kollajenaz ile desteklenmiş 8 mL bazal ortamda yeniden askıya alın. Tüpü 120 rpm'de 37 ° C'de 30-40 dakika çalkalayarak doku parçalarını sindirin.
   4. 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak sindirilen doku parçalarını kesmek için 20x yukarı ve aşağı pipetleyin. 100 μm'lik bir süzgeci 50 mL'lik bir santrifüj tüpü üzerine istifleyin ve süspansiyonu filtreleyin.
   5. Süzgeçteki doku parçalarını bazal ortamla geri kazanın ve bunları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, ardından ikinci bir kesme ve filtreleme turu izleyin. Daha fazla hücreyi izole etmek için ek kesme filtreleme 1x-2x yapılabilir, özellikle küçük bir doku parçası (örneğin, <0,5 cm) tedarik edildiğinde.
   6. Sindirimi sonlandırmak için akışa %2'lik son konsantrasyonla FBS ekleyin, ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın.
   7. Hücre peletini 10 mL bazal ortamda yeniden askıya alın, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın. Süper natantı atın.
   8. (İsteğe bağlı) Pelette birçok eritrosit, pelet görülürse (peletin rengine göre tahmin edilir), hücre peletini 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden askıya alın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, tüpe 10 mL bazal ortam ekleyin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın. Süper natantı atın.
   9. Pelet'i soğuk bodrum matrisinde yeniden askıya alın ve buz üzerinde tutun. Yaklaşık 0,5 cm büyüklüğünde bir akciğer dokusundan kurtarılan hücreler için 80-160 μL bodrum matrisi ekleyin; miktar 2-4 damlacık tohumlamak için yeterlidir.
   10. Önceden ısıtılmış 24 delikli süspansiyon kültür plakasının her bir kuyucuğuna 40 μL süspansiyon dağıtın. Kültür plakasını 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bodrum matrisinin bir damlacık oluşturmak için katılaşmasına izin verin.
   11. Her bir kuyucuğa 5 nM Heregulin beta-1 ile desteklenmiş 500 μL insan akciğer organoidi genişleme ortamı ekleyin ve plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
   12. Ortamı her 3 günde bir yenileyin. Damlacığı sağlam tutarken eski ortamı çıkarın ve dikkatli bir şekilde taze ortam ekleyin. Organoidleri inkübasyondan sonra 10-14 gün boyunca geçirin. Heregulin beta-1'i sadece ilk geçişten önceki ilk kültürde kullanın.
   13. Organoidlerin çok yüksek bir hücre yoğunluğu ile gömülmediğinden emin olmak için organoidleri mikroskop altında gözlemleyin. Bir damlacık aşırı yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle parçalanırsa, daha düşük ve arzu edilen bir hücre yoğunluğuna sahip daha fazla damlacık yapmak için organoidleri ve hücreleri daha yüksek hacimli bir bodrum matrisi ile geri kazanın ve yeniden gömün.

2. İnsan akciğer organoidlerinin genişlemesi

1. Açıklığı 1,5 mm'den yaklaşık 1,0 mm çapa daraltmak için Pasteur pipetinin ucunu Bunsen brülör gibi bir alev üzerine yakarak bir Pasteur pipeti hazırlayın. Pipetleri soğutun, ardından sterilize etmek için otoklavlama yapın. Mekanik kesme sırasında hücre yapışmasını ve kaybını önlemek için pipetleri bazal ortamla ıslatın.
2. Mekanik kesme ile akciğer organoidleri geçişi
   1. Yukarıda elde edilen damlacıkları kırmak için 1 mL'lik bir uç ve pipet yukarı ve aşağı kullanın. Daha sonra, organoidleri ortamla birlikte 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve soğuk bazal ortam ile hacmi 10 mL'ye ayarlayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın
   2. Organoidleri bir kez daha 10 mL soğuk bazal ortam ile yıkayın. Organoidleri 2 mL soğuk bazal ortamda yeniden askıya alın. Organoidleri bir Pasteur pipet ile küçük parçalara ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
   3. Bazal orta ile toplam 10 mL hacme kadar takviye edin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme yapın. Organoid fragmanları, 1:3 ila 1:5 genişlemeyi sağlamak için yeterli soğuk bodrum matrisi ile yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun.
   4. Önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 μL organoid süspansiyon yerleştirin. Kültür plakasını 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bodrum matrisinin katılaşmasına izin verin.
   5. Her bir oyuğa 500 μL akciğer organoid genleşme ortamı ekleyin ve bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Ortamı her 3 günde bir yenileyin. Organoidleri her 2 haftada bir 1: 3 ila 1: 5 oranında geçirin.
3. Akciğer organoidlerinin tripsinizasyon ile geçişi
   NOT: Tripsinizasyon, akciğer organoidini bir Pasteur pipet kullanarak küçük parçalara ayırmak zor olduğunda veya organoidlerin boyutu oldukça değişken olduğunda veya sonraki deneyler daha düzgün boyutta organoidler gerektirdiğinde tercih edilir.
   1. Akciğer organoidlerini adım 2.2.1'de gösterildiği gibi toplayın. Organoidi 1 mL ayrışma enziminde yeniden askıya alın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
   2. Tüpe 1 mL bazal ortam ekleyin. Bir Pasteur pipet kullanarak organoidleri yukarı ve aşağı küçük parçalara ayırarak organoidleri mekanik olarak kesin. Organoid parçaların boyutunu mikroskop altında 4x büyütmede kontrol edin. Ardından, sindirimi sonlandırmak için 40 μL FBS ekleyin.
      NOT: Deneysel düzenlemeye göre mikroskop altında organoid fragmanlarının boyutunu belirleyin. Bir deney daha fazla organoide veya daha düzgün boyutta organoidlere ihtiyaç duyarsa, organoidleri daha küçük parçalara veya hatta tek hücrelere ayırın. Daha sonra, organoidlerin deneye hazır olması daha uzun bir zaman, muhtemelen 3 hafta sürer.
   3. Bazal orta ile 10 mL'lik son hacme kadar doldurun, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme yapın. Organoid parçaları soğuk bodrum matrisinde 1:5-1:10 oranında geçiş için yeterli hacimle yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun.
   4. Önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 μL organoid süspansiyon yerleştirin. Kültür plakasını 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bodrum matrisinin katılaşmasına izin verin.
   5. Kuyu başına 500 μL akciğer organoid genleşme ortamı ile takviye edin ve bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Genişletme ortamını her 3 günde bir yenileyin. Organoidleri 2-3 hafta sonra geçirin.
      NOT: Yaklaşık 100 organoid, 40 μL'lik bir bodrum matrisi damlacığı içine monte edilmiştir. Akciğer organoidleri normalde nispeten yüksek hücre yoğunluğu ile daha iyi büyür. Damlacıklar parçalanırsa veya aşırı yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle büyüyen organoidler birbirine bağlanırsa, organoidleri daha düşük hücre yoğunluğu ile yeniden gömün.

3. Olgun hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşma

1. Hava sıvı arayüzü bazal ortamını 1x hava sıvı arayüz takviyesi, 1x hava sıvı arayüzü bakım takviyesi, 4 μg / mL heparin, 1 μM hidrokortizon, 10 μM Y-27632 ve 10 μM DAPT ile destekleyerek proksimal farklılaşma ortamı (PD ortamı) hazırlayın (bkz.
2. 3D hava yolu organoidleri
   1. Akciğer organoidlerini mekanik kesme yoluyla geçtikten sonra 7-10 gün boyunca genleşme ortamında inkübe edin. Genleşme ortamını PD ortamıyla değiştirin. Organoidleri PD ortamında bir hücre kültürü inkübatöründe 14 gün boyunca inkübe edin.
   2. PD ortamını her bir kuyucukta atın. RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR testi ile hücresel gen ekspresyonunun tespiti için farklılaşmış hava yolu organoidini toplamak için hücre lizat tamponu ekleyin.
   3. Alternatif olarak, organoidleri tek hücrelere ayırmak için 10 mM EDTA ilavesinden sonra organoidleri 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin, ardından hücre popülasyonlarını incelemek için akış sitometri analizi yapın. Organoidler çeşitli deneysel manipülasyonlar için hazırdır.
3. 2D hava yolu organoidi
   1. 2D farklılaşma kültürü için yeterli 3D akciğer organoidleri hazırlayın. 24 delikli geçirgen destek kesici ucu ve 12 delikli geçirgen destek kesici ucu için sırasıyla toplam 1,3 x 10^{5 ve} 4,5 x 10⁵ hücre gerekir.
   2. 3D akciğer organoidleri 2 hafta boyunca genişleme ortamında büyüdükten sonra, organoidleri tek hücrelere sindirir ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için 24 kuyucuklu ve 12 delikli eklere tohum atar.
   3. Ekleri bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca bazal ortamla önceden inkübe edin. 24 delikli bir plakanın üst ve alt odasına sırasıyla 250 μL ve 500 μL bazal ortam ekleyin. 12 delikli bir plaka için, üst ve alt odaya sırasıyla 500 μL ve 1.000 μL bazal ortam ekleyin.
   4. Adım 2.2.1'de açıklandığı gibi 3D akciğer organoidlerini hasat edin. Organoidleri 1 mL ayrışma enzimi ile yeniden askıya alın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
   5. Tüpe 1 mL bazal ortam ekleyin. Pipet, organoidleri bir Pasteur pipet ile tek hücrelere ayırmak ve hücreleri mikroskop altında kontrol etmek için yukarı ve aşağı doğru pişirin. Ardından, sindirimi sonlandırmak için 40 μL FBS ekleyin.
   6. Hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne filtreleyin. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Bazal orta ile toplam 10 mL hacme kadar doldurun, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme yapın.
   7. 24 damlacıktan (40 μL) toplanan peleti, damlacıklardaki hücre yoğunluğuna bağlı olarak 1-2.5 mL akciğer organoid genleşme ortamında yeniden askıya alın. Mikroskop altında bir hücre sayacı olan hücrelerin sayısını sayın. Hücre konsantrasyonunu 1,3 x 10⁶/mL (24 delikli kesici uçlar için) veya 9 x 10⁵/mL (12 delikli kesici uçlar için) olarak ayarlayın.
   8. Bazal ortamı üst ve alt odalardan çıkarın. 24 delikli kesici ucun ve 12 delikli kesici ucun alt haznesine sırasıyla 500 μL ve 1.000 μL genleşme ortamı ekleyin. 3.3.7 adımında hazırlanan tohum 100 μL ve 500 μL hücre süspansiyonu, sırasıyla 24 delikli kesici uç ve 12 delikli kesici ucun apikal odasına yerleştirilir.
   9. 2 gün boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Genleşme ortamını, plakaların hem apikal hem de alt haznesindeki PD ortamı ile değiştirin. Organoidleri hücre kültürü inkübatöründe 14 gün boyunca inkübe edin ve PD ortamını her 3 günde bir yenileyin.
      NOT: Mobil kirpikler, PD ortamında inkübasyondan sonraki 7. günden itibaren mikroskop altında 3D ve 2D organoidlerde ayırt edilebilir. PD ortamında 14 günlük farklılaşma kültüründen sonra, hava yolu organoidleri çeşitli deneysel manipülasyonlar için olgunlaşır.
   10. Trans-epitelyal elektrik direncini (TEER) her gün bir elektriksel direnç ölçüm sistemi kullanarak^{ölçün, 17'de} açıklanan standart bir protokole göre.

Bu protokol, insan akciğer organoidlerinin yüksek başarı oranıyla türetilmesini sağlar. Taze insan akciğer dokusu küçük parçalara ayrılır ve daha sonra kollajenaz ile ayrıştırılır. Elde edilen tek hücreler bodrum matriksine gömülür ve epitel kök hücrelerinin büyümesi için niş faktörlerin bir kokteyli ile desteklenen akciğer organoid genişleme ortamında inkübe edilir (adım 1.1.2). Şekil 1 , indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi Tip 2'ye gömülü yeni izole edilmiş akciğer hücrelerinin mikrofotoğrafını göstermektedir (BME; Şekil 1A, solda). Kistik organoidler zamanla ortaya çıkar ve büyür (Şekil 1A, sağda). Bu arada, ilgisiz hücreler yavaş yavaş hücre ölümüne uğrarlar. Fibroblastlar birinci veya ikinci pasajlar sırasında kültürde bulunur. Daha sonra, kültür sadece primer akciğer dokularında bulunan epitel kök hücrelerinden türetilen akciğer organoidleri olan epitel organoidlerini içerir. Bu akciğer organoidleri her 2-3 haftada bir, 1:3 ila 1:5 oranında mekanik kesme veya 1:5 ila 1:10 oranında tripsinizasyon ile geçirilir (adım 2.2-2.3). Dördüncü pasajdan sonra akciğer organoidlerinin temsili mikrofotoğrafları Şekil 1B'de gösterilmiştir. Mekanik kesmeden sonra, BME'ye gömülü organoid fragmanlar birkaç saat içinde kistik alanlar oluşturur (Şekil 1B, solda). 5. günde aynı alanın bir mikrofotografı (Şekil 1B, sağda) organoidlerin zamanla büyüdüğünü göstermektedir. Bu genişleyen insan akciğer organoidleri, ACCTUB + veya FOXJ 1 + siliye hücre, P63 + bazal hücre, CC10 + kulüp hücresi ve MUC5AC + kadeh hücresi18 (Şekil 1C) dahil olmak üzere dört ana hava yolu epitel hücresi tipinin tümünü erken bir durumda barındırır. Özellikle, bu insan akciğer organoidleri 1 yıldan fazla bir süre boyunca ardışık ve istikrarlı bir şekilde geçirilebilir. Bodrum matriksi içinde tutulduğunda, akciğer organoidlerinin apikal-in polaritesi gösterme olasılığı yüksektir, akciğer organoidlerinin% 2-3'ünden azı apikal-çıkış polaritesi gösterir13. Sonuç olarak, hücre apeksleri, 3D organoidler kesilmedikçe kolayca erişilemez.

Bununla birlikte, doğal insan hava yolu epiteli ile karşılaştırıldığında, bu uzun süreli genişleyen akciğer organoidleri, doğal insan hava yolu epitelindeki baskın hücre popülasyonu, siliye hücre, akciğer organoidinde yeterince temsil edilmediğinden yeterince olgun değildir. Daha sonra insan akciğer organoidlerinin olgunlaşma durumunu iyileştirmek için proksimal bir farklılaşma (PD) ortamı tanımladık. Genleşme ortamında inkübe edilen organoidler ve PD ortamı zamanla farklı morfoloji geliştirmiştir (Şekil 2A). Hareketli kirpikler, PD ortamındaki organoidlerde, genişleme ortamındakilerden daha fazlaydı. PD ortamında 2 haftalık farklılaşma kültüründen sonra, her bir organoidde hareketli kirpikler fark edilebilir (Şekil 2B ve Ek Video 1). İlginçtir ki, dövülen kirpikler, organoid lümen içindeki hücre kalıntılarını ve atılan müsinini tek yönlü olarak dönmeye yönlendirir, bu da insan hava yollarının önemli bir kendi kendini temizleme mekanizması olan solunan parçacıkları çıkarmak için mukosiliyer yürüyen merdiveni yeterince özetler (Ek Video 1). Siliyer hücrelerin, orijinal akciğer organoidlerine kıyasla farklılaşmış organoidlerde dramatik bir şekilde yaklaşık% 50'ye yükseldiğini gösterdik. Dört tip epitel hücresinin yüzdelerini değerlendirmek için, 2D hava yolu organoidleri akış sitometrisi ile analiz edildi. Kısaca, organoidler 37 ° C'de 60 dakika boyunca 10 mM EDTA ile ayrıştırıldı,% 4 PFA ile sabitlendi ve% 0.1 yüzey aktif madde ile geçirgenleştirildi. Daha sonra, hücreler 4 ° C'de 1 saat boyunca birincil antikorlarla (bakınız Malzeme Tablosu) inkübe edildi ve ardından ikincil antikorlarla boyandı. Numuneleri analiz etmek için bir FACS sistemi kullanıldı. Akım sitometri analizi, diferansiye organoidlerin dört hava yolu epitel hücre tipini barındırdığını göstermiştir (Şekil 2C). Bu nedenle, insan hava yolu epitelini fizyolojik bir seviyeye yakın bir seviyeye sadık bir şekilde simüle edebilen hava yolu organoidleri üretmek için proksimal bir farklılaşma protokolü geliştirdik.

Organoid apikal yüzeyin kolayca erişilebilir olmasını sağlamak ve solunum yolu patojenlerine maruz kalan insan hava yolu epitelini daha iyi modellemek için, hava yolu organoidlerinin 2D monokatmanlarını ürettik. 2 haftalık farklılaşma kültüründen sonra, 2D hava yolu organoidleri sağlam bir epitel bariyeri geliştirdi (Şekil 3A, B). Ayrıca 2D hava yolu organoidlerinde oluşan epitel bariyerinin bütünlüğünü değerlendirmek için bir dekstran blokaj testi yaptık. Transwell eklerde kültürden sonraki 10. günde, üst haznenin ortasına floresein izotiyosiyanat-dekstran (MW 10.000) ilave edildi ve 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edildi. Üst ve alt odalardaki ortamlar floresan testi için toplandı. Dextran blokaj indeksi, üst odadaki ortamın alt odacıktakilere kıyasla floresan yoğunluğunu ifade eder (Şekil 3B). Bu 2D hava yolu organoidleri ayrıca bol miktarda siliyer hücre içerir (Şekil 3C). Kirpiklenmiş hücreler anti-β-Tubulin IV antikoru (ACCTUB) ve keçi anti-fare 488 sekonder antikoru ile etiketlendi. Konfokal görüntüler konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Çok kanallı görüntüler, DAPI için 405 nm, ACCTUB için 488 nm ve Phalloidin için 633/640 nm lazerler kullanılarak elde edildi. Görüntüleme parametreleri konfokal mikroskobun kullanım kılavuzuna göre ayarlandı. Kısaca, iğne deliği boyutu 1 AU olarak ayarlandı, ana kazanç 1.0 dijital kazançla 650 V ila 750 V olarak ayarlandı ve lazer gücü% 0.2 ila% 5 aralığında her kanal için ayarlandı. Görüntü işleme, sağlanan analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

İnsan solunum yolu iki farklı epitel tipiyle, yani hava yolu epiteli ve alveoler epitel ile kaplıdır. İlki, hava yollarını burun boşluğundan terminal bronşiyolle doğru hizalar ve dört ana epitel hücresi tipinden, yani siliyer hücre, kadeh hücresi, kulüp hücresi ve bazal hücreden oluşur. Ek olarak, proksimal ve distal hava yollarını kaplayan hava yolu epiteli, proksimal-distal eksen boyunca değişken bir hücresel kompozisyon gösterir. Proksimal hava yolu epiteli, bol miktarda siliyer hücrelerden ve mukus salgılayan goblet hücrelerinden oluşan psödotabakatize edilir; distal hava yolu epiteli ise daha az bazal ve goblet hücresine sahip tek bir küboidal siliyer ve kulüp hücresi tabakasıdır19. Akciğer organoidlerinin türetilmesinde kullanılan insan akciğer dokuları, çeşitli hastalıklar nedeniyle cerrahi rezeksiyon yapılan hastalardan temin edilmiştir. Organoid kültür için hastalıklı dokulara bitişik normal akciğer dokularını kullanıyoruz. Bu akciğer dokuları tipik olarak alveoler keselerle çevrili değişken büyüklükte bronşiyoller içerir. İlk kültür sırasında, akciğer dokularındaki hava yolu epitel kök hücreleri veya hava yolu progenitör hücreleri, genişleme ortamındaki niş faktörler nedeniyle hayatta kalır ve çoğalır. Genleşme ortamı, organoidleri olgunlaşmamış bir duruma yönlendirerek akciğer organoidlerinin ilk türetilmesini ve uzun süreli genişlemesini sağlarken, hava yolu farklılaşma protokolü, doğal hava yolu epitelini morfolojik ve fonksiyonel olarak fenokopyalayan hava yolu organoidleri üretir. Akciğer organoidlerinin türetilmesi, genişlemesi ve farklılaştırılmasını içeren model sistemi Şekil 4'te özetlenmiştir. Proksimal ve distal hava yolu epitelindeki hücresel kompozisyon da Şekil 4'te gösterilmiştir.

Şekil 1: İnsan akciğer organoidlerinin türetilmesi, genişlemesi ve karakterizasyonu . (A) Temsili bir mikrofotoğraf, 0. günde akciğer dokularından izole edildikten sonra bodrum matrisine gömülü tek hücreleri göstermektedir (solda). 5. günde, kistik organoidler büyüyor (sağda). Ölçek çubuğu 0,5 mm'dir. (B) Akciğer organoidlerinin dördüncü geçiş günü ve geçişten sonraki 5. günde temsili bir mikrofotoğrafı. Ölçek çubuğu 0,5 mm'dir. P1 ve P4 birinci ve dördüncü pasajları temsil eder. Görüntüler 10x büyütmede çekildi. (C) İnsan akciğer organoidlerinde dört hava yolu epitel hücre tipinin konfokal görüntüleri. ACCUB + ve FOXJ 1 + siliyer hücreler, P63 + bazal hücreler, CC10 + kulüp hücreleri ve MUC5AC + kadeh hücreleri dahil olmak üzere akciğer organoidlerinde dört hava yolu epitel hücresi soyu bulunur. Çekirdekler ve hücresel aktin filamentleri sırasıyla DAPI (mavi) ve Phalloidin-647 (mor) ile karşı boyanır. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu rakam13'ten itibaren benimsenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İnsan akciğer organoidlerinin proksimal farklılaşması. (A) İnsan akciğer organoidleri 16 gün boyunca paralel olarak PD ortamında veya genişleme (Exp) ortamında kültürlendi. Belirtilen günlerde organoidlerin parlak alan mikro fotoğrafları gösterilir. Ölçek çubuğu 0,4 mm'dir. (B) Kirpiklerde diferansiye hava yolu organoidleri gösterilmiştir (siyah ok). Ölçek çubuğu 20 μm'dir. (C) FACS analizi ile tespit edilen PD ortamında (üstte) ve genleşme ortamında (altta) inkübe edilen organoidlerdeki bireysel hücre tiplerinin yüzdeleri. Bir organoid hattın temsili histogramları gösterilmiştir. Deney üç farklı organoid hattında gerçekleştirildi. Bu rakam13'ten itibaren benimsenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 2D farklılaştırılmış hava yolu organoidlerinin üretimi. (A) Trans-epitelyal elektronik direnç (TEER), PD ortamında inkübasyondan sonraki belirtilen günde ölçüldü. Veriler, 10 kesici uçta 2B tek katmanların ortalama ± standart sapmasını (SD) göstermektedir. (B) Geçirgen destek plakalarında kültürden sonraki 10. günde, floresein izotiyosiyanat-dekstran ilave edildi ve üst ve alt odalardaki ortamlar 4 saat sonra floresan testi için toplandı. Dextran blokaj indeksi, üst odadaki ortamın alt odadaki floresan yoğunluğunu ifade eder. Deneyimizde kullanılan geçirgen destek uçlarının çapı 0,4 μm'dir. Herhangi bir hücreyi tohumlamadan, dekstran normal 2D eklere serbestçe nüfuz edebilir. Bu nedenle, normal bir 2D'nin (Boş ile etiketlenmiş çubuk) dekstran tıkanıklık indeksi 1 olmalıdır. Veriler, 2D hava yolu organoidleri (2D organoid) ve iki boş kesici uçta (boş) tohumlanmış 10 kesici ucun ortalama ± SD'sini temsil etmektedir. (C) 2D hava yolu organoidlerinde bol miktarda ACCTUB + siliyer hücrelerin (yeşil) konfokal görüntüleri. Hücresel aktin filamentleri Phalloidin-647 (mor) ile karşı boyanır. Ölçek çubuğu 20 μm'dir. Bu rakam13'ten itibaren benimsenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İnsan akciğer organoidlerinin türetilmesi, genişlemesi ve farklılaşmasının şematik gösterimi. İnsan akciğer dokularından izole edilen tek hücreler doğrudan bodrum matrisine gömülür ve akciğer organoid genişleme ortamında inkübe edilir. Türetilmiş insan akciğer organoidleri, yüksek stabilite ile uzun süreli genişletilebilir ve kriyokorunmuş stoklardan kolayca geri kazanılabilir. Farklılaşma üzerine, üretilen hava yolu organoidleri, insan hava yolu epitelini sadık bir şekilde simüle edebilir. Çeşitli deneysel manipülasyonlar için 2D ve 3D hava yolu organoidleri geliştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1. Senkron olarak dövülen kirpikler, hücre kalıntılarını farklılaşmış hava yolu organoidlerinde tek yönlü olarak dönmeye yönlendirir13. Bu video13'ten itibaren benimsenmiştir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

J. Z., C.L. ve M.C.C., hava yolu organoidlerinin patentinde mucit olarak listelenmiştir (yayın No: US-2021-0207081-A1). Diğer yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.