Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Olgun Hava Yolu Organoidleri Üretmek için İnsan Akciğer Organoidlerinin ve Proksimal Farklılaşmasının Kurulması

9.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63684

⸱

23 Mart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Centre for Virology, Vaccinology and Therapeutics, Hong Kong Science and Technology Park, 3State Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, The University of Hong Kong

Bu makalede

Özet

Protokol, insan akciğer organoidlerini birincil akciğer dokularından türetmek, akciğer organoidlerini genişletmek ve insan hava yolu epitelini sadık bir şekilde fenotoskopik eden 3D ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşmayı indüklemek için bir yöntem sunar.

Özet

İnsan solunum epitelinin sağlam bir in vitro modelinin olmaması, solunum sisteminin biyolojisinin ve patolojisinin anlaşılmasını engellemektedir. İnsan akciğer organoidlerini akciğer dokusundaki yetişkin kök hücrelerden türetmek ve olgun hava yolu organoidleri oluşturmak için proksimal farklılaşmayı indüklemek için tanımlanmış bir protokol tanımladık. Akciğer organoidleri daha sonra yüksek stabilite ile 1 yıldan fazla bir süre boyunca ardışık olarak genişletilirken, farklılaşmış hava yolu organoidleri morfolojik ve fonksiyonel olarak insan hava yolu epitelini fizyolojik bir seviyeye yakın bir seviyeye kadar simüle etmek için kullanılır. Böylece, insan hava yolu epitelinin sağlam bir organoid modelini oluşturuyoruz. Akciğer organoidlerinin ve farklılaşmış hava yolu organoidlerinin uzun süreli genişlemesi, bilim adamlarının kültür yemeklerinde insan hava yolu epitel hücrelerini yeniden yapılandırmalarını ve genişletmelerini sağlayan istikrarlı ve yenilenebilir bir kaynak oluşturur. İnsan akciğer organoid sistemi, virüs-konakçı etkileşimi, ilaç testi ve hastalık modellemesinin incelenmesi de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için benzersiz ve fizyolojik olarak aktif bir in vitro model sağlar.

Giriş

Organoidler, organ gelişiminin in vitro modellenmesi ve biyoloji ve hastalıkların incelenmesi için sağlam ve evrensel bir araç haline gelmiştir. Büyüme faktörü tanımlı bir kültür ortamında kültürlendiğinde, çeşitli organlardan gelen yetişkin kök hücreler (ASC) 3 boyutlu (3B) olarak genişletilebilir ve organoidler olarak adlandırılan çoklu hücre tiplerinden oluşan organ benzeri hücresel kümelere kendiliğinden monte edilebilir. Clevers'in laboratuvarı, 2009 yılında ilk ASC türevi organoid, insan bağırsak organoidinin türetildiğini bildirdi 1,2. Daha sonra, prostat 3,4, karaciğer 5,6, mide 7,8,9, pankreas 10, meme bezi 11 ve akciğer 12,13 dahil olmak üzere çeşitli insan organları ve dokuları için ASC türevi organoidler kurulmuştur. . Bu ASC türevi organoidler, doğal organın kritik hücresel, yapısal ve fonksiyonel özelliklerini korumuş ve uzun süreli genişleme kültüründe genetik ve fenotipik stabiliteyi korumuştur14,15.

Organoidler ayrıca embriyonik kök (ES) hücreler ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücre16 dahil olmak üzere pluripotent kök hücreden (PSC) türetilebilir. PSC türevi organoidler, kuruluşları için organ gelişim mekanizmalarından yararlanırken, ASC'ler, fizyolojik doku kendini yenileme veya doku onarımı sırasında kök hücre nişini taklit eden koşulları yeniden inşa ederek organoidler oluşturmaya zorlanabilir. PSC türevi organoidler, ASC türevi organoidlerin karşılaştırılabilir olgunlaşma seviyesine ulaşamasalar da, gelişim ve organogenezi araştırmak için elverişli modellerdir. PSC türevi organoidlerin fetal benzeri olgunlaşma durumu ve bu organoidlerin kurulmasının karmaşıklığı, olgun dokularda biyoloji ve patolojiyi incelemek için geniş uygulamalarını büyük ölçüde engellemektedir.

Burundan terminal bronşiyolele kadar insan solunum yolu, dört ana hücre tipinden, yani siliye hücre, kadeh hücresi, bazal hücre ve kulüp hücresinden oluşan psödostratifiye siliyer epitel olarak da adlandırılan hava yolu epiteli ile kaplıdır. ASC türevi insan akciğer organoidini, Clevers'in laboratuvarı12,13 ile işbirliği içinde insan akciğer dokularından kurduk. Bu akciğer organoidleri, bir yıldan fazla bir süredir genişleme ortamında ardışık olarak genişletilir; kesin süre, farklı donörlerden elde edilen farklı organoid çizgiler arasında değişir. Bununla birlikte, doğal hava yolu epiteli ile karşılaştırıldığında, bu uzun süreli genişleyen akciğer organoidleri, insan hava yolundaki ana hücre popülasyonu olan siliyer hücreler bu akciğer organoidlerinde yeterince temsil edilmediğinden, yeterince olgun değildir. Bu nedenle, proksimal bir farklılaşma protokolü geliştirdik ve hava yolu epitelini morfolojik ve fonksiyonel olarak fizyolojik bir seviyeye yakın bir seviyeye kopyalayan 3D ve 2D hava yolu organoidleri ürettik.

Burada, birincil akciğer dokularından insan akciğer organoidlerini türetmek, akciğer organoidlerini genişletmek ve 3D ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşmayı indüklemek için bir video protokolü sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan insan dokularını kullanan tüm deneyler, Hong Kong Üniversitesi / Hastane Otoritesi Hong Kong Batı Kümesi (UW13-364 ve UW21-695) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Doku toplanmasından önce hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.

1. İnsan akciğer organoidinin türetilmesi

  1. Deney materyallerinin hazırlanması
    1. Gelişmiş DMEM / F12 ortamını 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile destekleyerek bazal ortam hazırlayın.
    2. Bazal besiyeri% 10 R-spondin 1 şartlı ortam,% 10 Noggin şartlı ortam,% 10 Noggin şartlı ortam, 1x B27 takviyesi, 1.25 mM N-asetilsistein, 10 mM nikotinamidin, 5 μM Y-27632, 500 nM A-83-01, 1 μM SB202190, 5 ng / mL fibroblst büyüme faktörü (FGF)-7, 20 ng / mL FGF-10 ve 100 μg / mL primosin ile takviye ederek insan akciğer organoid genişleme ortamı hazırlayın (bkz.
      NOT: R-spondin 1 ve Noggin şartlandırılmış ortam, ticari rekombinant R-spondin 1 (500 ng / mL) ve Noggin (100 ng / mL) ile değiştirilebilir.
    3. Bir hücre kültürü inkübatöründe 24 kuyucuklu bir süspansiyon kültür plakasını önceden ısıtın. % 5 CO2 ve 37 ° C'de nemlendirilmiş atmosfere sahip standart bir hücre kültürü inkübatörü kullanın. Bodrum matrisini 4 °C buzdolabında çözün. Deney sırasında bodrum matrisini ve kültür ortamını buz üzerinde tutun.
  2. 3D organoid kültür için insan akciğer dokularından hücre izolasyonu
    1. Çeşitli hastalıklar nedeniyle cerrahi rezeksiyon yapılan hastalardan yaklaşık 0,5 cm büyüklüğünde taze rezeke edilmiş insan akciğer dokuları temin edilir. Akciğer dokularını oda sıcaklığında 30 mL bazal ortamda taşıyın ve bir biyogüvenlik başlığı içinde mümkün olduğunca çabuk işleyin.
    2. Akciğer dokularını 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında steril bir neşterle küçük parçalara (0.5-1 mm) doğrayın. Doku parçalarını 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 mL soğuk bazal ortam ile yıkayın, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın.
    3. Süpernatantı atın ve peleti, 2 mg / mL'lik son konsantrasyonda kollajenaz ile desteklenmiş 8 mL bazal ortamda yeniden askıya alın. Tüpü 120 rpm'de 37 ° C'de 30-40 dakika çalkalayarak doku parçalarını sindirin.
    4. 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak sindirilen doku parçalarını kesmek için 20x yukarı ve aşağı pipetleyin. 100 μm'lik bir süzgeci 50 mL'lik bir santrifüj tüpü üzerine istifleyin ve süspansiyonu filtreleyin.
    5. Süzgeçteki doku parçalarını bazal ortamla geri kazanın ve bunları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, ardından ikinci bir kesme ve filtreleme turu izleyin. Daha fazla hücreyi izole etmek için ek kesme filtreleme 1x-2x yapılabilir, özellikle küçük bir doku parçası (örneğin, <0,5 cm) tedarik edildiğinde.
    6. Sindirimi sonlandırmak için akışa %2'lik son konsantrasyonla FBS ekleyin, ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın.
    7. Hücre peletini 10 mL bazal ortamda yeniden askıya alın, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın. Süper natantı atın.
    8. (İsteğe bağlı) Pelette birçok eritrosit, pelet görülürse (peletin rengine göre tahmin edilir), hücre peletini 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden askıya alın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, tüpe 10 mL bazal ortam ekleyin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleme yapın. Süper natantı atın.
    9. Pelet'i soğuk bodrum matrisinde yeniden askıya alın ve buz üzerinde tutun. Yaklaşık 0,5 cm büyüklüğünde bir akciğer dokusundan kurtarılan hücreler için 80-160 μL bodrum matrisi ekleyin; miktar 2-4 damlacık tohumlamak için yeterlidir.
    10. Önceden ısıtılmış 24 delikli süspansiyon kültür plakasının her bir kuyucuğuna 40 μL süspansiyon dağıtın. Kültür plakasını 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bodrum matrisinin bir damlacık oluşturmak için katılaşmasına izin verin.
    11. Her bir kuyucuğa 5 nM Heregulin beta-1 ile desteklenmiş 500 μL insan akciğer organoidi genişleme ortamı ekleyin ve plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
    12. Ortamı her 3 günde bir yenileyin. Damlacığı sağlam tutarken eski ortamı çıkarın ve dikkatli bir şekilde taze ortam ekleyin. Organoidleri inkübasyondan sonra 10-14 gün boyunca geçirin. Heregulin beta-1'i sadece ilk geçişten önceki ilk kültürde kullanın.
    13. Organoidlerin çok yüksek bir hücre yoğunluğu ile gömülmediğinden emin olmak için organoidleri mikroskop altında gözlemleyin. Bir damlacık aşırı yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle parçalanırsa, daha düşük ve arzu edilen bir hücre yoğunluğuna sahip daha fazla damlacık yapmak için organoidleri ve hücreleri daha yüksek hacimli bir bodrum matrisi ile geri kazanın ve yeniden gömün.

2. İnsan akciğer organoidlerinin genişlemesi

  1. Açıklığı 1,5 mm'den yaklaşık 1,0 mm çapa daraltmak için Pasteur pipetinin ucunu Bunsen brülör gibi bir alev üzerine yakarak bir Pasteur pipeti hazırlayın. Pipetleri soğutun, ardından sterilize etmek için otoklavlama yapın. Mekanik kesme sırasında hücre yapışmasını ve kaybını önlemek için pipetleri bazal ortamla ıslatın.
  2. Mekanik kesme ile akciğer organoidleri geçişi
    1. Yukarıda elde edilen damlacıkları kırmak için 1 mL'lik bir uç ve pipet yukarı ve aşağı kullanın. Daha sonra, organoidleri ortamla birlikte 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve soğuk bazal ortam ile hacmi 10 mL'ye ayarlayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın
    2. Organoidleri bir kez daha 10 mL soğuk bazal ortam ile yıkayın. Organoidleri 2 mL soğuk bazal ortamda yeniden askıya alın. Organoidleri bir Pasteur pipet ile küçük parçalara ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
    3. Bazal orta ile toplam 10 mL hacme kadar takviye edin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme yapın. Organoid fragmanları, 1:3 ila 1:5 genişlemeyi sağlamak için yeterli soğuk bodrum matrisi ile yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun.
    4. Önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 μL organoid süspansiyon yerleştirin. Kültür plakasını 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bodrum matrisinin katılaşmasına izin verin.
    5. Her bir oyuğa 500 μL akciğer organoid genleşme ortamı ekleyin ve bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Ortamı her 3 günde bir yenileyin. Organoidleri her 2 haftada bir 1: 3 ila 1: 5 oranında geçirin.
  3. Akciğer organoidlerinin tripsinizasyon ile geçişi
    NOT: Tripsinizasyon, akciğer organoidini bir Pasteur pipet kullanarak küçük parçalara ayırmak zor olduğunda veya organoidlerin boyutu oldukça değişken olduğunda veya sonraki deneyler daha düzgün boyutta organoidler gerektirdiğinde tercih edilir.
    1. Akciğer organoidlerini adım 2.2.1'de gösterildiği gibi toplayın. Organoidi 1 mL ayrışma enziminde yeniden askıya alın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Tüpe 1 mL bazal ortam ekleyin. Bir Pasteur pipet kullanarak organoidleri yukarı ve aşağı küçük parçalara ayırarak organoidleri mekanik olarak kesin. Organoid parçaların boyutunu mikroskop altında 4x büyütmede kontrol edin. Ardından, sindirimi sonlandırmak için 40 μL FBS ekleyin.
      NOT: Deneysel düzenlemeye göre mikroskop altında organoid fragmanlarının boyutunu belirleyin. Bir deney daha fazla organoide veya daha düzgün boyutta organoidlere ihtiyaç duyarsa, organoidleri daha küçük parçalara veya hatta tek hücrelere ayırın. Daha sonra, organoidlerin deneye hazır olması daha uzun bir zaman, muhtemelen 3 hafta sürer.
    3. Bazal orta ile 10 mL'lik son hacme kadar doldurun, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme yapın. Organoid parçaları soğuk bodrum matrisinde 1:5-1:10 oranında geçiş için yeterli hacimle yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun.
    4. Önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 40 μL organoid süspansiyon yerleştirin. Kültür plakasını 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bodrum matrisinin katılaşmasına izin verin.
    5. Kuyu başına 500 μL akciğer organoid genleşme ortamı ile takviye edin ve bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Genişletme ortamını her 3 günde bir yenileyin. Organoidleri 2-3 hafta sonra geçirin.
      NOT: Yaklaşık 100 organoid, 40 μL'lik bir bodrum matrisi damlacığı içine monte edilmiştir. Akciğer organoidleri normalde nispeten yüksek hücre yoğunluğu ile daha iyi büyür. Damlacıklar parçalanırsa veya aşırı yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle büyüyen organoidler birbirine bağlanırsa, organoidleri daha düşük hücre yoğunluğu ile yeniden gömün.

3. Olgun hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşma

  1. Hava sıvı arayüzü bazal ortamını 1x hava sıvı arayüz takviyesi, 1x hava sıvı arayüzü bakım takviyesi, 4 μg / mL heparin, 1 μM hidrokortizon, 10 μM Y-27632 ve 10 μM DAPT ile destekleyerek proksimal farklılaşma ortamı (PD ortamı) hazırlayın (bkz.
  2. 3D hava yolu organoidleri
    1. Akciğer organoidlerini mekanik kesme yoluyla geçtikten sonra 7-10 gün boyunca genleşme ortamında inkübe edin. Genleşme ortamını PD ortamıyla değiştirin. Organoidleri PD ortamında bir hücre kültürü inkübatöründe 14 gün boyunca inkübe edin.
    2. PD ortamını her bir kuyucukta atın. RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR testi ile hücresel gen ekspresyonunun tespiti için farklılaşmış hava yolu organoidini toplamak için hücre lizat tamponu ekleyin.
    3. Alternatif olarak, organoidleri tek hücrelere ayırmak için 10 mM EDTA ilavesinden sonra organoidleri 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin, ardından hücre popülasyonlarını incelemek için akış sitometri analizi yapın. Organoidler çeşitli deneysel manipülasyonlar için hazırdır.
  3. 2D hava yolu organoidi
    1. 2D farklılaşma kültürü için yeterli 3D akciğer organoidleri hazırlayın. 24 delikli geçirgen destek kesici ucu ve 12 delikli geçirgen destek kesici ucu için sırasıyla toplam 1,3 x 105 ve 4,5 x 105 hücre gerekir.
    2. 3D akciğer organoidleri 2 hafta boyunca genişleme ortamında büyüdükten sonra, organoidleri tek hücrelere sindirir ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için 24 kuyucuklu ve 12 delikli eklere tohum atar.
    3. Ekleri bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca bazal ortamla önceden inkübe edin. 24 delikli bir plakanın üst ve alt odasına sırasıyla 250 μL ve 500 μL bazal ortam ekleyin. 12 delikli bir plaka için, üst ve alt odaya sırasıyla 500 μL ve 1.000 μL bazal ortam ekleyin.
    4. Adım 2.2.1'de açıklandığı gibi 3D akciğer organoidlerini hasat edin. Organoidleri 1 mL ayrışma enzimi ile yeniden askıya alın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
    5. Tüpe 1 mL bazal ortam ekleyin. Pipet, organoidleri bir Pasteur pipet ile tek hücrelere ayırmak ve hücreleri mikroskop altında kontrol etmek için yukarı ve aşağı doğru pişirin. Ardından, sindirimi sonlandırmak için 40 μL FBS ekleyin.
    6. Hücreleri 40 μm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne filtreleyin. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Bazal orta ile toplam 10 mL hacme kadar doldurun, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleme yapın.
    7. 24 damlacıktan (40 μL) toplanan peleti, damlacıklardaki hücre yoğunluğuna bağlı olarak 1-2.5 mL akciğer organoid genleşme ortamında yeniden askıya alın. Mikroskop altında bir hücre sayacı olan hücrelerin sayısını sayın. Hücre konsantrasyonunu 1,3 x 106/mL (24 delikli kesici uçlar için) veya 9 x 105/mL (12 delikli kesici uçlar için) olarak ayarlayın.
    8. Bazal ortamı üst ve alt odalardan çıkarın. 24 delikli kesici ucun ve 12 delikli kesici ucun alt haznesine sırasıyla 500 μL ve 1.000 μL genleşme ortamı ekleyin. 3.3.7 adımında hazırlanan tohum 100 μL ve 500 μL hücre süspansiyonu, sırasıyla 24 delikli kesici uç ve 12 delikli kesici ucun apikal odasına yerleştirilir.
    9. 2 gün boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Genleşme ortamını, plakaların hem apikal hem de alt haznesindeki PD ortamı ile değiştirin. Organoidleri hücre kültürü inkübatöründe 14 gün boyunca inkübe edin ve PD ortamını her 3 günde bir yenileyin.
      NOT: Mobil kirpikler, PD ortamında inkübasyondan sonraki 7. günden itibaren mikroskop altında 3D ve 2D organoidlerde ayırt edilebilir. PD ortamında 14 günlük farklılaşma kültüründen sonra, hava yolu organoidleri çeşitli deneysel manipülasyonlar için olgunlaşır.
    10. Trans-epitelyal elektrik direncini (TEER) her gün bir elektriksel direnç ölçüm sistemi kullanarakölçün, 17'de açıklanan standart bir protokole göre.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, insan akciğer organoidlerinin yüksek başarı oranıyla türetilmesini sağlar. Taze insan akciğer dokusu küçük parçalara ayrılır ve daha sonra kollajenaz ile ayrıştırılır. Elde edilen tek hücreler bodrum matriksine gömülür ve epitel kök hücrelerinin büyümesi için niş faktörlerin bir kokteyli ile desteklenen akciğer organoid genişleme ortamında inkübe edilir (adım 1.1.2). Şekil 1 , indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi Tip 2'ye gömülü yeni izole edilmiş akciğer hücrelerini...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İnsan hava yolları, psödostratifiye siliyer epitel olarak da bilinen hava yolu epiteli ile kaplıdır. Üst solunum yolu epitelinin ana hücre tipleri, apikal kirpiklerinin mukus ve solunan parçacıkları hava yollarından dışarı atmak için koordineli hareketini sağlayan siliye hücreler, mukus üreten ve salgılayan kadeh hücreleri ve bazal membranı kaplayan ve rejenerasyonda rol oynayan bazal hücrelerdir. Bronşiyoller gibi küçük hava yolunda, küboidal hava yolu epiteli, salgı kulübü hücreleri ve üst solunum yolu bölgelerine göre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

J. Z., C.L. ve M.C.C., hava yolu organoidlerinin patentinde mucit olarak listelenmiştir (yayın No: US-2021-0207081-A1). Diğer yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Hong Kong Üniversitesi PanorOmik Bilimler ve Elektron Mikroskobu Birimi Merkezi, Li Ka Shing Tıp Fakültesi'ne konfokal görüntüleme ve akış sitometrisindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Gıda ve Sağlık Bürosu'nun Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu'ndan (HMRF, 17161272 ve 19180392) gelen fonlarla desteklenmiştir; Araştırma Hibeleri Konseyi Genel Araştırma Fonu (GRF, 17105420); ve Health@InnoHK, İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu, Hong Kong Özel İdari Bölgesi Hükümeti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< Akciğer organoid kültürü için güçlü > reaktifler< / güçlü >
Gelişmiş DMEM / F12Invitrogen
12634010-A8301Tocris2939500nM
B27 takviyesiInvitrogen17504-0441x
Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Matrisi, Tip 2 (BME 2)Trevigen3533-010-0%70-80
FGF-10Peprotech100-2620 ng/mL
FGF-7Peprotech100-195 ng/mL
GlutaMAX (glutamin)İnvitrojen35050061 1x
HEPES 1Mİnvitrojen15630-05610 mM
Heregulin β-1Peprotech100-035 nM
N-AsetilsisteinSigma-AldrichA91651.25 mM
NikotinamidSigma-AldrichN063610 mM
Noggin (koşullu orta)evyapımı-10x
Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)İnvitrojen15140-1221x
PrimocinInvivogenant-pm-1100 ve mikro; g/mL
Rspondin1 (koşullu orta)evyapımı-10x
SB202190Sigma-AldrichS70671 & mikro; M
Y-27632Tocris12545 & M
Proksimal farklılaşma ortamı
DAPTTocris263410 & mikro; M
HeparinSolüsyonu Kök Hücre Teknolojisi79804 & g/mL
Hidrokortizon Stok ÇözeltisiKök Hücre Teknolojisi79251 & M
PneumaCult-ALI 10X Takviyesihava sıvı arayüz takviyesi
PneumaCult-ALI Bazal Orta KökHücre Teknolojisi05001hava sıvı arayüzü bazal ortam
PneumaCult-ALI Bakım Takviyesihava sıvı arayüzü bakım takviyesi
Y-27632Tocris125410 &mikro; M
Ekipman
Biyolojik güvenlik kabiniBaker1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 veya 800Zeisskonfokal mikroskop
CO2 İnkübatörüThermo Fisher Scientific42093483
Stereo-mikroskopOlympus CorporationCKX31SF
SantrifüjEppendorf5418BG040397
Serolojik pipetleyiciEppendorf
MikropipetEppendorf
ZEN siyah veya ZEN mavi yazılımZeissanaliz yazılımı
Sarf malzemeleri
12mm Trans-kuyuKök Hücre Teknolojisi# 38023
12 oyuklu hücre kültürü plakasıCellstar665970
15 ve 50 ml konik tüplerThermo Fisher ScientificL6BF5Z8118
24 oyuklu hücre kültürü plakasıCellstar662160
6.5mm Trans-kuyuKök Hücre Teknolojisi# 38024
Tıbbi Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 &; mikro; mSigma-AldrichSLGPR33RB
Mikrofüj tüpleriEppendorf
Mikropipet uçlarıThermo Fisher ScientificTFLR140-200-Q21190531
Pasteur pipet camıThermo Fisher Scientific22-378893
Serolojik pipetler (5ml, 10ml, 25ml)Thermo Fisher ScientificBA08003, 08004, 08005
Antikorlar< / güçlü >
Keçi Anti-Fare Alexa Fluor 594InvitrogenA11005
Keçi Anti-Fare, Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
Keçi Anti-Tavşan Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Keçi Anti-Tavşan Alexa Fluor 594InvitrogenA11037
Keçi Anti-Sıçan Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Fare Anti-Sitokeratin 5Abcamab128190
Fare Anti-FOX J1Invitrogen14-9965-82
Fare Anti-Müsin 5ACAbcamab3649
Fare Anti-β-tubulin 4SigmaT7941
Tavşan Anti-p63Abcamab124762
Sıçan Anti-Uteroglobin / CC-10R& D SistemleriMAB4218-SP
Diğer reaktif
TripLE Enzimi Seçin (10X)Thermo Fisher BilimselA1217701ayrışma enzimi

Kaynaklar

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  5. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  9. Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
  10. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  11. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  12. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  13. Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  16. Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
  17. Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
  18. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098(2015).
  19. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
  20. Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
  21. Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
  22. Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
  23. Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
  24. Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
  25. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
  26. Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
  27. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  28. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
  29. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  30. Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
  31. Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508(2021).
  32. Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  33. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  34. Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Organoid KültürüHava Yolu EpiteliKök Hücre İzolasyonuBazal Membran MatrisiOrganoid GenişletmeEpitel Hücre TipleriRT-qPCR Analizi
Olgun Hava Yolu Organoidleri Üretmek için İnsan Akciğer Organoidlerinin ve Proksimal Farklılaşmasının Kurulması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.