Method Article

Mutant Metiyonin tRNA Sentetaz Fare Hattı Kullanılarak Hücre Tipi Özgül Protein Saflaştırma ve Kompleks Dokulardan Tanımlama

DOI:

10.3791/63713

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mutant L274G-Metiyonin tRNA sentetazı (MetRS*) ifade eden bir fare çizgisi kullanılarak azidonorlösin (ANL) ile hücre tipine özgü protein etiketlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini ve etiketli hücre tipine özgü proteinlerin izolasyonu için gerekli adımları açıklar. Canlı farelerde (1) içme suyu ve (2) intraperitoneal enjeksiyonlarla iki olası ANL uygulama yolunu özetliyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein homeostazını in vivo olarak anlamak, hücrelerin hem fizyolojik hem de hastalık koşullarında nasıl çalıştığını bilmenin anahtarıdır. Mevcut protokol, protein etiketlemesini belirli hücresel popülasyonlara yönlendirmek için tasarlanmış bir fare hattı kullanarak yeni sentezlenmiş proteinlerin in vivo etiketlemesini ve ardından saflaştırılmasını açıklamaktadır. L274G-Metiyonin tRNA sentetazın (MetRS*) Cre rekombinaz ekspresyonu ile indüklenebilir bir çizgidir ve azidonorlösin (ANL) proteinlere dahil olmasını sağlar, aksi takdirde gerçekleşmeyecektir. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, in vivo etiketli hücre tipine özgü proteomları saflaştırmak ve numune karmaşıklığının azaltılması nedeniyle protein içeriğindeki ince değişiklikleri tespit etmek mümkündür.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anormal protein homeostazı, protein sentezi ve bozunmasındaki dengesizlikten kaynaklanır. Çeşitli hastalıklar protein homeostazındaki değişikliklerle ilişkilidir. Bazı hastalıkların ayırt edici özelliği, farklı hücre altı yerlerde ve beyin bölgelerinde agregaların varlığıdır. Protein homeostazı sadece hastalıkta önemli değil, aynı zamanda normal organ ve hücresel fonksiyonda da önemli bir rol oynar1. Örneğin, protein sentezi, protein sentezini bloke eden kimyasal inhibitörlerin kullanımı ile belirlenen birçok nöronal plastisite 2,3 formu içingereklidir 4. Bununla....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarla yapılan tüm deneyler, Almanya'daki (RP Darmstadt; protokoller: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) veya İspanya'daki (UCM'deki Hayvan Deneyleri Komitesi ve Comunidad de Madrid Çevre Danışmanlığı, protokol numarası: PROEX 005.0/21) yerel yönetim ofislerinin izniyle gerçekleştirilmiştir ve Max Planck Derneği kurallarına ve İspanyol düzenlemelerine uygundur ve hayvan refahı için AB yönergelerine uygundur.

1. ANL ile in vivo metabolik etiketleme

  1. İçme suyu:
    1. ANL ve maltozu farelerin düzenli içme suyunda çözün. Önerilen maltoz konsantrasyonu% 0.7'dir (wt / vol). İçme suyuna eklenen m....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanımlanan protokolü takiben (Şekil 1'de özetlenmiştir), ANL farelere 7 gün boyunca günlük intraperitoneal enjeksiyonlarla (400 mM ANL 10 mL / kg, Nex-Cre::MetRS*) veya 21 gün boyunca içme suyu (% 0.7 Maltoz,% 1 ANL, CamkII-Cre: : MetRS *) yoluyla uygulandı. Etiketlemeden sonra, karşılık gelen beyin bölgeleri disseke edildi, lize edildi, alkillendi ve tıklandı. Tıklama reaksiyonları SDS-PAGE ve Western Immunoblot ile analiz edildi. Deneylerin temsili görüntüleri, I.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün kritik yönleri şunlardır; negatif kontrollerin dahil edilmesi, yeterli biyolojik replikasyona sahip olması, ANL uygulama yolu, miktarı ve süresi, numunelerin alkilasyonu, alkin konsantrasyonu ve DST-alkinen kullanıldığında β-merkaptoetanol eliminasyonu.

Cre sürücüsü olmayan ANL etiketli hayvanlardan gelen negatif kontrol örneklerini dahil etmek önemlidir ve bu nedenle MetRS* ifadesi yoktur. Bu numuneler, ANL etiketli Cre-indüklenmiş MetRS* farelerden alınan numunelere paralel olarak.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.A-C, İspanya Bilim ve İnovasyon Bakanlığı (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), Madrid Özerk Topluluğu (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057) ve MICINN (PID2020-113270RA-I00) hibeleri tarafından finanse edilmektedir. R.A-P, Madrid Özerk Topluluğu (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) tarafından finanse edilmektedir. E.M.S., Avrupa Araştırma Konseyi'nden (hibe 743216) bir İleri Araştırmacı ödülü olan Max Planck Society tarafından finanse edilmektedir, DFG CRC 1080: Nöral Homeostazın Moleküler ve Hücresel Mekanizmaları ve DFG CRC 902: RNA Tabanlı Düzenlemenin Moleküler İlkeleri. D.C Dieterich ve P. Landgraf'a teknik tavsiyeleri ve DST-Alkyne'nin sentezi için teşekkür....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
%12 Akrilamid jellerGenScriptSurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, %
beta;-MerkaptoetanolSigmaM6250Toksik; laboratuvar önlüğü, eldiven ve davlumbaz kullanın.
Amonyum bikarbonatSigma9830Toksik; laboratuvar önlüğü, eldiven ve davlumbaz kullanın
ANLAHA için daha önce tarif edildiği gibi sentezlenir (bkz. referans 5 ve 11)
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonazSigmaE1014
Biotin alkinThermo,B10185
Tavuk antikoru anti-GFPAves1020
Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitörüRoche4693132001Toksik; Laboratuvar önlüğü ve eldiven kullanın.
Bakır (I) bromürSigma254185%99,999 (ağırlık/ağırlıkça)
Disülfür etiketi (DST)-alkinReferans numarası 15'te bildirildiği gibi sentezlenmiştir ve burada prob 20
DMSOSigma276855
FiltreleriMerkSCGP00525
İyodo asetamid (IAA)SigmaI1149
IR anti tavuk 800LI-CORIRDye 800CWEşek anti-Tavuk İkincil Antikor
IR anti rabit 680LI-CORIRDye 680RDKeçi anti-Tavşan IgG İkincil Antikor
MaltozSigmaM9171
Manuel KarıştırıcıBioSpec Ürünler1083
NaClSigmaS9888
N-etilmaleimidSigma4259Zehirli; Laboratuvar önlüğü, eldiven ve çeker ocak kullanın.
NeutrAvidin boncuklarıPierce29200
Nitroselüloz membranBio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7.8Referans numarasında açıklanan preparat 5
PD SpinTrap G-25 sütunlarıGE HealthcareTampon değişimi
Pierce BCA Protein Test KitiTermo,23225Pierce BCA Protein Test Kitindeki Reaktifler sudaki yaşam için toksiktir.
Poliklonal tavşan anti-biyotin antikoruHücre Sinyalizasyonu5597
PVDF membranMillipore IPVH00010
SDS% 10Sigma71736
SDS-PAGE  Çalışan tampon MOPSGenScriptM00138
SYPRO Yakut lekeSigmaS4942
Masa otomatik VortexerEppendorfMixmate
Triazol ligandSigma678937
Triton X-100SigmaT9284
SuSigmaW4502Moleküler biyoloji sınıfı
12

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PurificationCell Type SpecificMethionine tRNA SynthetaseIn Vivo LabelingAzidonorleucine IncorporationClick ChemistryMass SpectrometryWestern BlotProtein HomeostasisProteome Analysis

Related Articles