Method Article

Doku Temizliğinden Sonra 3D Rekonstrüksiyon Yaklaşımı Kullanılarak Fare Kesici Dişlerinde Etiket Tutan Hücrelerin Tespiti ve Kantitasyonu

DOI:

10.3791/63721

⸱

June 10th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Texas A&M School of Dentistry

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare kesicisi, kök hücre nişinde değerli etiket tutucu hücreler içerir. Etiket tutucu hücreleri tarafsız bir şekilde tespit etmek ve ölçmek için yeni bir yolumuz var; Çalışmamızda EdU etiketleme ve PEGASOS dokusunun mandibuladan temizlenmesinden sonra 3D rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murin kesici, farenin ömrü boyunca sürekli büyüyen bir organdır. Kesici dişlerin proksimal dokularında bulunan epitel ve mezenkimal kök hücreler, ameloblastlara, odontoblastlara ve pulpa fibroblastlarına farklılaşacak döllere yol açar. Bu hücreler, kesici dokuların sürekli cirosunu desteklemede çok önemlidir, bu da murin kesicisini yetişkin kök hücrelerin homeostazını incelemek için mükemmel bir model haline getirir. Kök hücrelerin, 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) gibi nükleotid analogları ile etiketlenebilen uzun ömürlü sessiz hücreler içerdiğine inanılmaktadır. Hücreler zaman içinde bu etiketi korur ve buna göre etiket tutma hücreleri (LRC'ler) olarak adlandırılır. LRC'leri in vivo görselleştirmeye yönelik yaklaşımlar, kök hücre homeostazını izlemek için sağlam bir araç sağlar. Bu çalışmada, LRC'leri görselleştirmek ve analiz etmek için bir yöntem tanımladık. Yenilikçi yaklaşımımız, doku temizleme ve tam montajlı EdU boyama işleminden sonra fare kesici dişlerinde LRC'leri, ardından konfokal mikroskopiyi ve görüntüleme yazılımı ile 3 boyutlu (3D) bir rekonstrüksiyonu içerir. Bu yöntem, kesitli slaytlar üzerindeki geleneksel LRC analizine kıyasla 3D görüntüleme elde etmeyi ve önyargısız kantitasyonu mümkün kılar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sürekli büyüyen fare kesici ucu, yetişkin kök hücreleri incelemek için mükemmel bir modeldir1. Kesici dişin proksimal tarafında bulunan epitel (labial ve lingual servikal loop) ve mezenkimal kök hücreler (labial ve lingual servikal loop arasında) ameloblastlara, odontoblastlara ve diş pulpası hücrelerine farklılaşır. Bu eşsiz süreç, doku kaybının ve cironun telafisi için bir hücre kaynağı sağlar2. Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1 gibi birkaç kök hücre belirteci olmasına rağmen. fare kesici dişlerinde yetişkin kök hücrelerin alt kümeleri için in vivo olarak tanımlanmıştır, tek başına kullanıldığında kök hücre popülasyonlarını temsil etmede yetersizdir 1,3,4,5. Uzun ömürlü sessiz hücrelerin nükleotid analog DNA etiketleme ve retansiyonu ile görselleştirilmesi, yetişkin kök hücrelerin çoğu alt kümesi için tarafsız tespit sağlayabilir6. Ayrıca, bu yaklaşım birçok kök hücre tanımlama yöntemiarasında yararlıdır 7 hücre davranışını ve diş kök hücre popülasyonlarının homeostazını anlamak için 3,8. Bölünen kök hücreler kayda değer bir kovalamacadan sonra DNA etiketlerini kaybederken, varsayılan sessiz kök hücreler DNA etiketlerini korur ve onları etiket tutucu hücreler (LRC'ler) olarak kabul eder6. Bölünmeyen kök hücreler tarafından DNA etiketlemesi ve tutulması, varsayılan yetişkin kök hücreleri nişlerinde işaretleyecek ve bulacaktır.

Son yıllarda, timidin analog 5-bromo-2′-deoksiüridin (BrdU) etiketlemesi, hücre proliferasyon testleri 6,9 için hantal, zaman alıcı ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi uyumsuz 3H-timidin DNA etiketleme yönteminin yerini almıştır. Son yıllarda, 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) etiketleme tekniği BrdU üzerinde giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu model birkaç nedenden dolayı ortaya çıkmıştır. İlk olarak, BrdU yöntemi yavaş ve emek yoğundur. Kullanıcı koşulları değişkendir ve örneklerdeki ultrayapıyı koruyamaz (DNA denatürasyonu nedeniyle). Benzer şekilde, BrdU yöntemi hücrelerin antijenitesini kaybeder, böylece ko-lokalizasyon deneyleri ve in vivo kök hücrenakli 3,7,9,10,11,12 gibi aşağı akış fonksiyonel analizleri ve tahlilleri için verimsiz hale getirir. BrdU ayrıca embriyonik gelişim6'da LRC'leri etiketlemek için uygun olmayan bir teratojendir. Ayrıca, BrdU yöntemi tüm montajlı numunelerde kullanıldığında verimsizdir. Dezavantajları, numunelerin derin kısmında antikorların düşük penetrasyonu veya derin penetrasyon için uzun bir antikor inkübasyon süresinin gerekliliğidir13. EdU etiketleme, numunelerin denatüre edilmesi adımlarından kaçar, böylece ultra yapıyı korur. Bu özellik, ko-lokalizasyon deneyleri ve kök hücre nakli gibi aşağı akış fonksiyonel analizleri için avantajlıdır11,12. Ayrıca, EdU etiketleme son derece hassas ve hızlıdır; EdU etiketlerini Cu(I)-katalizli [3 + 2] sikloekleme reaksiyonu ("tıklama" kimyası)14 yoluyla tespit etmek için hızla emilen ve daha küçük boyutlu floresan azidlerin kullanılması nedeniyle numune penetrasyonu yüksektir.

Giderek daha fazla uygulanan bir diğer DNA etiketleme yöntemi, mühendislik ürünü transgenik farelerin kullanılmasıdır. Bu fareler, tetrasikline duyarlı bir düzenleyici element 5,14 tarafından kontrol edilen histon 2B yeşil floresan proteinini (H2B-GFP) eksprese eder. Fareleri 4 haftalık ila 4 aylık bir kovalama süresi boyunca tetrasiklin chow / su ile besledikten sonra, GFP floresansı döngü hücrelerinde azalacak ve sadece LRC'ler floresan6'yı koruyacaktır. Bu yöntemin avantajı, etiketli LRC'lerin izole edilebilmesi ve hücre kültürü veya aşağı akış fonksiyonel analizleri için uygun kalmasıdır 6,7. Bazı çalışmalar, uzun süreli kullanım için kovalandığında sessiz kök hücrelerin yanlış etiketlendiğini bildirmiştir. Bu sonuç, H2B-GFP suşundan sızan bir arka plan ifadesinden kaynaklanıyordu ve uygun tetrasiklin tarafından düzenlenmiş yanıttankaynaklanmıyordu15.

Dahası, geçmişte çoğu literatür LRC'lerin tespitini esas olarak iki boyutlu olan ve LRC'lerin doğru yerini ve sayısını göstermede genellikle hatalı bir şekilde önyargılı olan kesitli slaytlarda kullanmıştır. Yaklaşım, karmaşık doku yapılarının kesitleri için yanlış açılar gösterdi16. Diğer yöntem ise seri kesitlerden 3D görüntüler elde etmek ve görüntü sonrası rekonstrüksiyonlar yapmaktı. Bu adımlar, sıkıştırılmış veya gerilmiş bölümler nedeniyle her seri bölümdeki varyasyonlardan kaynaklanan görüntü bozulması nedeniyle yanlıştı ve eksik bilgilere neden oldu16,17,18. Yöntem aynı zamanda zahmetli ve zaman alıcıydı.

LRC'lerin tam montajlı görüntülemesini kolaylaştırmak için, floresan iyi korunurken numunelerin netleştirilmesi gerekir. Güncel doku temizleme teknikleri üç ana kategoriye ayrılabilir: organik solvent bazlı doku temizleme teknikleri, sulu reaktif bazlı doku temizleme teknikleri ve hidrojel bazlı doku temizleme teknikleri17,19. Polietilen glikol (PEG) ile ilişkili çözücü sistemi (PEGASOS) yakın zamanda geliştirilmiştir. Bu yaklaşım neredeyse tüm doku tiplerini şeffaf hale getirir ve kemik ve dişler gibi sert dokular da dahil olmak üzere endojen floresanı korur20. PEGASOS yönteminin özellikle diş ve kemik materyallerinin temizlenmesinde diğer doku temizleme yöntemlerine göre avantajları vardır. Diğer yöntemlerin çoğu sert dokuları yalnızca kısmen temizleyebilir, uzun işlem sürelerine sahip olabilir veya maliyetli reaktifler gerektirebilir21. Ayrıca, PEGASOS yöntemi endojen floresanı diğer yöntemlere göre etkili bir şekilde koruyabilir.

Bu literatür bizi hücre çalışması için yeni bir yöntem oluşturmaya yönlendirdi. EdU etiketlemenin LRC'lerin algılama avantajlarını, dokudan arındırılmış numunelerin en üstün 3D tam montajlı görüntülemesiyle birleştirdik; Numuneler gelişmiş polietilen glikol (PEG) ile ilişkili solvent sistemi (PEGASOS) doku temizleme tekniği15 ile işlenmiştir. Sert doku saydamlığı, LRC'lerin floresansının 3D sinyalini dişleri veya mandibulayı kırmadan in vivo olarak yeniden yapılandırmamızı sağladı ve LRC'leri görselleştirmek ve ölçmek için daha doğru bir yol yarattı.

Bu çalışmada, fare kesici dişindeki LRC'leri görselleştirmek için yenilikçi bir kılavuz sunuyoruz. LRC'lerin fare kesici kök hücre nişi içindeki yerini ve miktarını belirlemek için 3D görsel bir yaklaşım yaptık. Bu projede EdU etiketleme, PEGASOS doku temizleme teknikleri ve konfokal mikroskopi kullanılmıştır. LRC'leri tüm montajlı doku üzerinde etiketleme ve temizlenmiş ve şeffaf bir numunenin kullanılması yöntemimiz, hem geleneksel kesitli slaytların hem de diğer dezavantajlı DNA etiketleme yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelir. Bu nedenle tekniğimiz, özellikle sert dokularda LRC tespiti gerektiren kök hücre homeostazı çalışmaları için uygun olacaktır. Protokol, diğer doku ve organlardaki kök hücre homeostazına odaklananlar için eşit derecede avantajlı olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm yöntemler, Texas A&M Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi için Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. EdU etiketleme kokteylinin hazırlanması

  1. Kokteyl stok çözümlerini Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
  2. EdU etiketleme kokteylini Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.

2. Farelerin ve EdU çözeltisinin hazırlanması

  1. EdU çözümünü hazırlayın. EdU'yu DMSO'da 20 mg / mL'de çözün ve -20 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
    DİKKAT: EdU bir mutajendir. Kullanıcılar bu maddeyi kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giymelidir.
  2. 5 günlük C57BL/6J farelere, hazırlanan EdU solüsyonunu intraperitoneal olarak 3 μL/g vücut ağırlığında enjekte edin. Fareler, çözeltiyi art arda 7 gün boyunca günde bir kez almalıdır. Daha sonra, analiz için hasat edilmeden önce 6 hafta boyunca bir kovalamaca süresine tabi tutulurlar (Şekil 1).
    DİKKAT: EdU'yu farelere enjekte ederken iğne batmasını önlemeye dikkat edin. EdU'yu art arda 7 gün boyunca enjekte ettikten sonra, fareleri yeni bir kafese yerleştirin. Fareler yeni evlerine girdikten sonra, uygun biyolojik tehlike kurallarını kullanarak yatakları eski kafese atın.

3. Transkardiyak perfüzyon ile numune hazırlama (6 haftalık kovalamaca döneminden sonra doğum sonrası 53 günlük fareler)

NOT: Başarılı transkardiyak perfüzyondan sonra fare karaciğeri soluklaşmalıdır.

  1. Fareleri intraperitoneal enjeksiyonla uyuşturun. Ksilazin ve ketamin anesteziklerinin bir kombinasyonu verilmelidir (Ksilazin 10-12.5 mg / kg; Ketamin, 80-100 mg/kg vücut ağırlığı).
  2. Fare artık ağrılı uyaranlara (pençe sıkıştırma refleksleri gibi) yanıt vermeyene kadar ~ 10 dakika bekleyin.
  3. Fareleri, her pençede iğnelerle strafor destek üzerine stabilize edilmiş sırtüstü bir pozisyona yerleştirin.
  4. Cımbız ve diseksiyon makası kullanarak üstteki cildi açarak göğüs boşluğunu açığa çıkarın.
  5. Keskin makas kullanarak diyaframı kesin. Kalbi delmemeye dikkat edin.
  6. Göğüs kafesini kesin, kalbi açığa çıkarmak için sternumun tabanını kelepçe makası ile tutun.
  7. Fareyi bir duman davlumbazındaki sirkülasyon pompasının yakınındaki perfüzyon aşamasına aktarın.
  8. 25 G iğnesini (fosfat tamponlu salin (PBS)/% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile doldurulmuş tüpten) sol ventrikülün tepesine yerleştirin. İğnenin ucunu ventrikülün lümeninde tutmaya dikkat edin.
    DİKKAT: PFA orta derecede toksiktir ve olası bir kanserojendir. PFA'yı işlemek ve çözeltiyi kimyasal bir duman davlumbazının altında hazırlamak için KKD kullanın. Atık PFA, kurum yönergelerine göre uygun şekilde bertaraf edilmesini gerektirir.
  9. İğneyi sol ventriküle yerleştirdikten hemen sonra keskin bir makas kullanarak sağ ventrikülü kesin. Bu adım, kanın fareden dışarı akmasını ve toplama kabına akmasını sağlar.
  10. Numuneleri 7 mL/dak akış hızında 50 mL PBS çözeltisi ile perfüze edin.
  11. PBS perfüzyonundan sonra, aynı akış hızı 5 mL/dak'da 20 mL'lik %4 PFA çözeltisi akışına izin vermek için stopcock'u değiştirin.
  12. Sirkülasyon pompası hala açıkken, iğneyi sol ventrikülden çıkarın.
    NOT: Fare artık doku toplama için sabitlenmiştir. Floresanı korumak için, tüm protokol boyunca mümkün olduğunca ışığa maruz kalmaktan kaçınılmalıdır. Doku işlenirken, doku örneklerinin bulunduğu 50 mL'lik konik tüp alüminyum folyo ile kaplanabilir.

4. PEGASOS tekniği kullanılarak mandibulanın doku temizliği

NOT: Her adımda numuneleri tedaviye hazır tutmak için doku hacmine göre 15 mL veya 50 mL konik tüp kullanılabilir. Numuneler, 4,2 ila 4,7 arasındaki adımlarda 37 °C çalkalayıcılarda (~ 100 rpm) işlenir. Plastiğin erimesini önlemek için organik çözücülere dayanıklı polipropilen bazlı plastik kaplar kullanın. Alternatif olarak, cam eşyalar kullanılabilir.

DİKKAT: PEGASOS doku temizleme tekniğinde Quadrol, polietilen glikol (PEG), benzil benzoat (BB), MMA500 gibi toksik çözeltiler kullanılır. Potansiyel maruziyetleri önlemek için uygun KKD gereklidir.

  1. Mandibulaları disseke edin ve numuneleri% 4 PFA'da daha fazla sabitleyin. Gece boyunca oda sıcaklığında saklayın.
  2. Kasları mandibulalardan çıkarın ve 4 gün boyunca kireçten arındırmak için 0.5 M EDTA çözeltisine (pH 8.0) batırın. Bu süre zarfında, 37 ° C'lik bir çalkalayıcıda günlük bir ortam değişimi gerçekleştirin.
    NOT: Kasların numuneden mümkün olduğunca çıkarılması arzu edilir. Bu önlem görüntüleme işlemini basitleştirecek ve kaslardan gelen otofloresanı azaltacaktır.
  3. Kalan kan hemesini çıkarmak için mandibulaları bir gün boyunca 37 ° C'lik bir çalkalayıcıda% 25'lik bir Quadrol çözeltisi (H2O'da v / v) ile renklendirin.
  4. Tüm montaj EdU boyama işlemini tamamlayın.
    1. Tablo 1'e göre taze bir EdU etiketleme kokteyli hazırlayın.
      NOT: EdU etiketleme kokteylinin, optimum EdU etiketleme sonuçları elde etmek için taze hazırlanmış askorbat çözeltisi eklenerek her seferinde taze hale getirilmesi gerekir.
    2. Mandibulaları PBST ile 37 °C çalkalayıcıda 30 dakika durulayın.
    3. Mandibulaları PBS ile her seferinde 3 dakika boyunca üç kez durulayın.
    4. Mandibulaları gece boyunca 37 ° C'lik bir çalkalayıcıda taze yapılmış bir EdU etiketleme kokteylinde inkübe edin.
    5. Mandibulaları PBS ile her seferinde 3 dakika boyunca üç kez durulayın.
  5. Aşağıdaki çözeltilerin her birinde 37 °C'de 6 saat boyunca seri de-lipidasyon gerçekleştirin:
    %30 tert-bütanol (tB) çözeltisi: %75 v/v H2O, %22 v/v tB ve %3 v/v Quadrol.
    %50 tB çözüm: %50 v/v H2O, %47 v/v tB ve %3 v/v Quadrol.
    %70 tB çözüm: %30 v/v H2O, %67 v/v tB ve %3 v/v Quadrol
    NOT: Lipidasyon giderme adımı kritiktir. De-lipidasyon, %30 ve %50 tB çözeltide 4-6 saat arasında, %70 tB çözeltide ise 1 gün süreyle yapılabilir.
  6. Aşağıdaki günlük ortam değişimi ile tB-PEG çözeltisindeki mandibulaları 2 gün boyunca dehidrate edin: %75 tB, %22 v/v polietilen glikol metil-eter metakrilat ortalama MMA500 ve 37 °C'de %3 v/v Quadrol.
  7. Kırılma indisi eşleşmesi elde etmek için benzil benzoat (BB)-PEG temizleme ortamındaki mandibulayı temizleyin: şeffaflık sağlanana kadar% 75 v / v BB,% 22 v / v PEG-MMA500 ve% 3 Dörtlük.
    NOT: Kırılma indisi eşleştirmesi hakkında bilgimiz var. Su, lipitler, proteinler, mineraller, organeller gibi dokulardaki inorganik ve organik bileşenler. 1,33 ila 1,55 aralığında farklı bir kırılma indisine (RI) sahiptir. Doku bileşenleri arasındaki bu RI uyumsuzluğu görüntüleme işlemini engeller. Şeffaflık, doku içindeki RI uyumsuzluğunu ortadan kaldırarak sağlanabilir. Dokudan arındırılmış numunelerin BB-PEG temizleme ortamına daldırılması önerilir. Bu adım, tüm numuneye ~ 1.54 (RI eşleştirme olarak adlandırılır) üniform iç RI'yı verecek ve görüntüleme işlemini kolaylaştıracaktır.
  8. Mandibulaları depolama ve görüntüleme için BB-PEG doku temizleme ortamında oda sıcaklığında saklayın.
    NOT: Floresan muhabirlerin kademeli olarak kaybolmasını önlemek için görüntülemeyi mümkün olan en kısa sürede tamamlamak iyidir. Bununla birlikte, PEGASOS yöntemi, floresan muhabirlerini birkaç haftalık depolamadan sonra bile iyi korunmuş halde tutacaktır20,21. Uzun süreli depolama için, numuneler 4 ° C'de de saklanabilir.

5. Dokudan arındırılmış mandibulanın konfokal görüntülenmesi

  1. Temizlenmiş mendilin tamamını BB-PEG temizleme ortamındaki marka boşluklu slaytlara monte edin ve cam kapak kızaklarıyla örtün. Herhangi bir kabarcıktan kaçının.
  2. Uygun bir lazer taramalı konfokal mikroskop ile görüntü yakalama gerçekleştirin. Al'ı seçin ve görüntü alma parametrelerini 512 x 512 piksel çözünürlükte ve 400 Hz alma hızında ayarlayın. Bu ayarlar, mikroskobu kontrol eden yazılımın edinme modu menüsünde bulunur.
  3. Floresan uyarım panelinde, floroforları en iyi şekilde uyarmak için gerekli lazeri (TRITC) etkinleştirin (LRC'lerin görselleştirilmesi için kullandığımız prob, 548 nm'de uyarma ve 563 nm lazer dalga boyunda emisyon ile Cy3 gibi floresan özelliklere sahiptir).
  4. Floresan algılama panelinde, ölçülecek dalga boylarını seçmek için kaydırıcıyı hareket ettirin (örneğin, Cy3 benzeri bir florofor için 555 ila 625 nm arasında).
  5. Beyaz ışık ve daha düşük bir büyütme hedefi (2-10x) kullanarak numuneyi görselleştirmek ve bulmak için monte edilmiş mandibulayı mikroskop aşamasına yerleştirin.
  6. Cam kapak kaymasının kırılma indisine ve hedefine uyması için kapak kapağının üzerine kırılma indisi 1,52 olan bir damla daldırma yağı ekleyin.
    NOT: Görüntü yakalama sırasında optik bozulmaların ortaya çıkmasını en aza indirmek için hedeflerin, görüntüleme ortamının ve dokunun kırılma indisini mümkün olduğunca yakından eşleştirin.
  7. Floresan lambaları açın ve ilgilendiğiniz bölgeleri görüntülemek için uygun bir büyütme hedefi seçin. 1,95 mm çalışma mesafesine sahip 0,9 sayısal diyafram açıklığına sahip 20x objektif lens kullandık. Konfokal mikroskopta daha büyük doku örneklerini görüntülerken daha uzun bir çalışma mesafesi lensi gerekebilir. Alternatif olarak, görüntüleme daha büyük doku örnekleri için bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak kolayca yapılabilir.
  8. Konfokal görüntüleme yazılımında, canlı tarama modunu başlatmak için Canlı düğmesine basın. Görüntülerin dinamik aralığını en üst düzeye çıkarmak ve piksel doygunluğunu önlemek için, seçilen kanalın kazancını ve lazer yoğunluğunu ayarlayın.
  9. X ve Y boyutlarında mandibulanın tüm bölgesini görselleştirmek için görüş alanını tanımlayın. Fare kesici dişindeki kök hücre nişinin hacmini doğru bir şekilde kaplayan üst ve alt Z aşaması edinme parametrelerini ayarlayın. 2 μm'lik bir Z adımlı boyut kullanın veya gereksinimlerinize göre kullanın. Konfokal mikroskopların yeni versiyonları, çakışan çeşitli bölgelerin z-yığınlarını otomatik olarak elde edebilmelidir.
  10. Z-stack görüntü dosyalarını .lif biçiminde edinin ve kaydedin.
    NOT: .lif sinekleri .tiff dosyalarına dönüştürülebilir ve diğer 3D analiz yazılımları için kullanılabilir.

6. Görüntü işleme, 3D görüntü rekonstrüksiyonu ve bir yüzey oluşturarak etiket tutucu hücrelerin nicelleştirilmesi, İlgi Çekici Bölgenin (ROI) segmentasyonu, YG'nin maskelenmesi ve noktalar oluşturulması

NOT: Görüntü işleme ve 3D rekonstrüksiyon için Imaris (Bitplane 9.0.1) kullandık, ancak benzer görüntü işleme adımları diğer yazılım paketleri (örneğin, ImageJ / Fiji, 3D dilimleyici, Avizo, Arivis, Amira, vb.) kullanılarak gerçekleştirilebilir.

  1. Görüntüleme yazılımında Arena düğmesini tıklayın, sonra Görüntü'yü seçin. Orijinal . lif dosyasını seçin ve birleştirilmiş dosyayı seçin, görüntüler görüntüleme yazılımına aktarılacaktır.
    NOT: Alternatif olarak, Z yığını görüntü dosyasını yazılımın yerel biçimli dosya türüne dönüştürmek için bir görüntüleme yazılımı dosya dönüştürücüsü kullanın. Örneğin: Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nü kullanarak .lif dosyalarını .ims dosyalarına dönüştürün ve .ims dosyalarını görüntüleme yazılımında açın. Verileri yazılımın yerel dosya formatına dönüştürmek, hızlı dosya dönüştürmeye izin verecek ve hataları en aza indirecektir.
  2. Görüntü veri kümesini açmak için içe aktarılan dosyaya çift tıklayın.
  3. Ekran Ayarı panelini ziyaret edin, kanalın adını tıklatın. Varsayılan modda genellikle Kırmızı olarak etiketlenir.
    1. Image Properties (Görüntü Özellikleri) penceresinde, Mapped Color (Eşlenen Renk) sekmesine tıklayın. Renk Tablosu Dosyası seçeneğinde, Yangın Akışı'nı seçin ve ardından Tamam'a tıklayın. Ekran rengi normalde arka plan floresansını ve pozitif floresansı numuneden ayırt etmek için seçilir.
  4. Sahne – Özellikler bölmesinde ekranın sol üst tarafında, Yeni Yüzey Ekle etiketli mavi simgeye tıklayın. Arka plan floresansının çoğunu kaldıracak olan Ses Seviyesi simgesinin seçimini kaldırın ve pozitif floresan belirgin bir şekilde görünür (bkz. Adım 6.4.2).
    1. İlgi alanının (YG) manuel olarak segmentasyonunu başlatma işlemini, Oluştur sekmesine tıklayıp Otomatik Oluşturmayı Atla, Manuel Olarak Düzenle sekmesini seçerek başlatın. Manuel yüzey oluşturma sihirbazında, YG'yi kolayca şekillendirmek için numunelere göre yönlendirmeyi (XY, YZ veya XZ) seçmek için Kontur sekmesine tıklayın. Burada XY yönünü seçiyoruz.
    2. Ardından, sağ köşedeki işaretçi menüsünün Seç modunda olduğundan emin olun. Dokudaki YG'yi bulmak için Dilim Konumunu ayarlayın. Arka plan floresansının çoğunun, Adım 6.4'te belirtildiği gibi farklı pozitif floresanlarla kaldırıldığını fark edeceksiniz. Çiz düğmesine tıklayın ve geçici bir ilgi alanı çizin. YG dışındaki diğer alanlardan kaynaklanan paraziti önlemek için Görünürlük seçeneğini hiçbiri olarak belirleyin.
    3. Adım 6.4.2'yi yineleyin. İlgilenilen bölgenin tamamını çizmek için dilim dilim dilimleyin.
    4. ROI çizimi tamamlandıktan sonra, ROI'nin 3B geometrisini almak için Yüzey Oluştur'a tıklayın.
    5. Manuel yüzey oluşturma sihirbazındaki Düzenle düğmesine tıklayın ve Tümünü Maskele'yi seçin.
    6. Açılan Maske Kanalı penceresinde, kanal seçim seçeneklerinde Kanal 1'i seçin. Daha sonra, Maskeyi Uygulamadan Önce Kanalı Çoğalt'ı seçin. Maske ayarlarında Sabit İç/Dış öğesini seçin ve voksel dış yüzeyini 0 olarak ayarlayın.
    7. Sahne Özellikleri bölmesinde, Yüzey Nesnesi'nin seçimini kaldırın ve Birim Nesnesi'ni seçin. Ekran Ayarı'nda, orijinal "Kırmızı" kanalın seçimini kaldırın ve Maskelenmiş Kırmızı kanalı seçin ve istenen 3B işlenmiş ve pozitif etiketli floresan YG'yi elde etmek için renk yoğunluklarını ayarlayın.
  5. Yeni bir spot nesnesi oluşturun. 3B olarak oluşturulmuş LRC'lerle karşılaştırılabilir şekilde örtüşen 3B noktalar oluşturarak 3B olarak oluşturulmuş LRC'leri ölçmek için Noktalara Ekle  simgesine tıklayarak başlayın.
    1. Nokta oluşturma sihirbazında, yazılımla otomatik olarak nokta oluşturmak için dört ardışık talimat adımı olacaktır. İlk adımda Yalnızca İlgi Çekici Bir Bölgeyi Segmentlere Ayır seçeneğinin seçili olduğundan emin olun. İleri simgesine tıklayın.
    2. İkinci adımda, bir "XYZ 3D kutusu" olacak. XYZ kutusunu, yatırım getirisini karşılayacak şekilde ayarlayın. İleri simgesine tıklayın.
    3. Üçüncü adımda, Kaynak Kanal seçeneklerine gidin. Maskelenmiş kırmızı kanalı seçin; Numune floresan noktalarına uyacak ve üst üste binecek şekilde karşılaştırılabilir tahmini XY nokta çapını girin. İleri simgesine tıklayın.
    4. Dördüncü adımda, "Kalite" filtre türünü ekleyin ve tanımlanabilir LRC'lerin çoğunluğu etiketlenene kadar kayan pencereyi 'Kalite' histogramı boyunca hareket ettirerek düşük yoğunluk eşiğini ayarlayın.
      NOT: Segmentasyon ve dolayısıyla istatistiksel okumalar (örnek: hücre sayısı) büyük ölçüde yoğunluk eşik değerlerine bağlıdır. Uygun eşik değerlerini tam olarak ayarlamaya dikkat edin.
    5. Son düğmesine tıklayın ve İstatistik düğmesini seçin. Görüntüdeki toplam nokta sayısının değerini bulmak için Genel sekmesini seçin.
    6. Dosyaya Sekme Görüntüsü düğmesini tıklatarak istatistikleri dışa aktarın ve sonuçları bir .xls dosyasında alın.
    7. Niceleme sonuçlarını sunmak için uygun bir diyagram kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EdU etiketleme ve PEGASOS doku temizleme işleminden sonra (Şekil 2), görüntümüzde gösterildiği gibi şeffaf mandibula elde edildi (Şekil 3B). Modifiye edilmiş numuneyi, doku temizleme işlemi olmayan normal bir mandibula ile karşılaştırdık (Şekil 3A). EdU etiketli şeffaf mandibula (Şekil 3B) konfokal görüntülemeye tabi tutuldu. Kök hücre nişini gösteren kesici tepe noktasına odaklandık (Ek Şekil 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoklu enjeksiyon dozları (BrdU, EdU) genellikle çoğalan hücreleri mümkün olduğunca etiketlemek için büyüyen yenidoğan farelerde kullanılır 1,6,13. Kovalama süresi, dokuların yenilenme hızı açısından kritik bir adım olarak kabul edilir 6,13. Fare kesici ucu her ay kendini yeniler. Bu özellik, araştırmacıların kovalama süresini 4 haftaveya daha uzun...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meghann K. Holt'a makaleyi düzenlediği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH / NIDCR hibeleri DE026461 ve DE028345 ve Texas A &M Diş Hekimliği Fakültesi'nden Dr. Xiaofang Wang'a başlangıç fonu ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5 M EDTASigma AldrcihE9884
20 ve kez; Amaç/NA 0.9Leica507702
50 mL Falcon Santrifüj TüpleriFalcon352070
BD PrecisionGlide İğneBDREF 305111
Bezil benzoat (BB)Sigma Aldrcih409529
Bitplane 9.0.1Imaris
MARKA boşluklu kızaklarMillipore SigmaBR475505
C57BL/6J farelerJackson LaboratuvarSuşu #:000664
Sirkülasyon PompasıVWR23609-170
CuSO4Sigma Aldrcih451657
DMSOSigma AldrcihD8418
EdUCarboynthNE08701
HeparinMiilipore SigmaH3149
Görüntüleme SistemiOlympusDP27
LAS X YazılımıLeica
Olympus Stereo MikroskopOlympusSZX16
ParaformaldehyeSigma AldrichP6148
PBSSigma AldrichP4417
PEGMMA500Sigma Aldrich447943
QuadrolSigma Aldrich122262
Sodyum AskorbatSigma Aldrich11140
Sülfa-Siyanin 3 AzideLumiprobeD1330
TBS-10XHücre Sinyalleme Teknolojisi12498
TCS SP8 Konfokal MikroskopLeica
tert-bütanol (tB)Sigma Aldrich360538
Triton X-100Sigma AldrichX100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712(2017).
  2. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  3. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378(2018).
  4. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
  5. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  6. Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
  7. de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595(2021).
  8. Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
  9. Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
  10. Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345(2021).
  11. Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
  12. Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
  13. Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
  14. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  15. Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357(2008).
  16. Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
  17. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  18. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  19. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).
  20. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  22. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  23. Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Retaining CellsMouse IncisorsTissue Clearing3D ReconstructionStem Cell NicheEdU StainingConfocal MicroscopyMandible DecalcificationMesenchymal Stem CellsEpithelial Stem Cells

Related Articles