Kemik iliği stromal hücrelerinin (BMSC'ler) rutin bir kültürü, birçok hücrenin hematopoietik kökenli olduğu heterojen hücre popülasyonlarının izolasyonuna yol açar. Burada, murin BMSC kültürlerinde hematopoietik kirleticileri büyük ölçüde azaltmak için düşük oksijen gerilimi kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Murin Kemik İliği Stromal Hücre Kültürlerinde Hematopoetik Hücreleri Azaltmak için Düşük Oksijen Geriliminin Kullanılması
Bu makalede
Özet
Özet
Şu anda, homojen bir iskelet kök hücre (SSC) popülasyonunu prospektif olarak izole etmek için evrensel olarak kabul edilmiş belirteçlerin eksikliği devam etmektedir. Bu nedenle, hematopoezi destekleyen ve iskeletin tüm fonksiyonlarına katkıda bulunan BMSC'ler, multipotent mezenkimal progenitörleri (MMP'ler) incelemek ve SSC fonksiyonunu çıkarmak için yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir. Ayrıca, kas-iskelet sistemi hastalıklarını incelemek için kullanılan transgenik murin modellerinin genişliği göz önüne alındığında, BMSC'lerin kullanımı, MMP'leri ve SSC'leri düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için güçlü bir araç olarak da hizmet eder. Bununla birlikte, murin BMSC'leri için yaygın izolasyon prosedürleri, geri kazanılan hücrelerin %50'sinden fazlasının hematopoietik kökenli olmasına neden olur ve bu çalışmalar sırasında üretilen verilerin yorumlanmasını potansiyel olarak engeller. Burada, BMSC kültürlerinde CD45+ hücrelerinin seçici olarak elimine edilmesi için düşük oksijen gerilimi veya hipoksi kullanan bir yöntemi tarif ediyoruz. Daha da önemlisi, bu yöntem sadece hemopoietik kontaminantları azaltmak için değil, aynı zamanda BMSC kültürlerindeki MMP'lerin ve varsayılan SSC'lerin yüzdesini artırmak için de kolayca uygulanabilir.
Giriş
Hematopoietik kök hücrelere (HSC'ler) benzer şekilde, SSC'ler kemik mikroçevresi içinde barındırılır; bununla birlikte, HSC'lerden farklı olarak, şu anda SSC'leri 1,2,3 prospektif olarak tanımlamak için kullanılabilecek evrensel olarak kabul edilmiş hücre yüzeyi belirteçlerinin eksikliği vardır. Bununla birlikte, in vitro kültür sistemleri ve in vivo sulandırma deneyleri, BMSC'lerin bir kısmının hematopoezi destekleme kapasitesinin yanı sıra mezenkimal soyların tüm hücrelerine farklılaşma yeteneğine sahip olduğunu göstermekt....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Fare modelleri kullanılarak açıklanan tüm yöntemler, onaylanmış Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) protokollerine (A187-19-08) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Arka bacak kemiklerinin diseksiyonu
- 10-12 haftalık erkek veya dişi C57BL / 6 fareleri, 2-4 L / dk'lık bir akış hızı kullanarak CO2 boğulması ile ötenazi yapın ve ardından dekapitasyon ile ölümün doğrulanması ile ötenazi yapın. Bu testte dişi veya erkek fareler, sonuçlarda beklenen bir fark olmaksızın kullanılabilir. Kürkü %70 etanol ile püskürtün.
- Sternumun altındaki deride küçü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
7 günlük hücre izolasyonundan sonra,% 21 oksijende kültürlenen hücreler oldukça heterojendir. Spesifik olarak, daha büyük bipolar hücrelerin çoklu çıkıntılar içeren daha küçük hücrelerle iç içe geçtiği boyutta büyük bir varyasyon vardır (Şekil 1A). Buna karşılık, hipoksik koşullarda yetiştirilen hücreler oldukça homojendir. Koloniler içindeki hücreler boyut olarak nispeten benzerdir ve doku kültürü plastiği üzerinde yetiştirilen mezenkimal kökenli diğer hücrelere benzeyen bipolar bir görünüm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Gözlemlerimize dayanarak, BMSC'ler doku kültürü plastiğine makrofajlardan ve diğer hemopoietik kökenli hücrelerden daha erken yapışır11. Bu nedenle, plakaların kaplanmasından 3 saat sonra durulanması, daha sonraki zaman noktalarına bağlanma potansiyeline sahip yüzen hematopoietik hücreleri ortadan kaldırdığı için kritik bir adımdır. Ayrıca, bu durulamalar, özellikle henüz matrisi bırakmamış ve doku kültürü kaplarına yayılmamış gevşek bir şekilde tutturulmuş, yuvar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Duke Üniversitesi Ortopedik Cerrahi Anabilim Dalı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 100mm < sup>2 < / sup> doku kültürü kapları | Corning | 353003 | |
| 1x Fosfat Parlatılmış Salin (PBS) | Gibco | 100010-023 | |
| Parlak Çizgi hemositometre | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratuvarı | 664 | |
| HyClone Fetal Sığır Serumu (ABD), GE | Healthcare Life Karakterli Bilimler | SH30071.03 | |
| InvivO2 400 | Baker Ruskinn | https://bakerco.com | |
| MEM&alfa;, nükleositler | Gibco | 12571-063 | |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Kırmızı Kan Hücresi Parçalama Tamponu Hybri-Max | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| T-25cm2 doku kültürü şişeleri | Corning | 430168 | |
| Tripan Mavi Çözeltisi | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı | Gibco | 25200-056 |
Kaynaklar
- Chen, K. G., Johnson, K. R., Robey, P. G. Mouse genetic analysis of bone marrow stem cell niches: technological pitfalls, challenges, and translational considerations. Stem Cell Reports. 9 (5), 1343-1358 (2017).
- Baryawno, N., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
