İnsan pankreas dokularından N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için spin-tip zenginleştirme stratejisi

Protein post-translasyonel modifikasyonları (PTM'ler), protein yapılarının ve dolayısıyla işlevlerinin ve aşağı akış biyolojik süreçlerinin modüle edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. İnsan proteomunun çeşitliliği, çeşitli PTM'lerin sağladığı kombinatoryal değişkenlik nedeniyle katlanarak artar. Genom tarafından tahmin edildiği gibi kanonik dizilerinden farklı protein varyantları proteoformlar olarak bilinir ve birçok proteoform PTM'lerden kaynaklanır¹. Sağlık ve hastalıkta proteoform çeşitliliğinin incelenmesi son yıllarda büyük ilgi gören bir araştırma alanı haline gelmiştir ^2,3.

Proteoformların ve daha spesifik olarak büyük derinliğe sahip PTM'lerin incelenmesi, kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik yöntemlerin geliştirilmesiyle daha kolay hale gelmiştir. MS kullanılarak, analitler iyonize edilir, parçalanır ve fragmanların m / z'sine göre tanımlanır. Zenginleştirme yöntemleri, PTM'lerin modifiye edilmemiş protein formlarına kıyasla düşük göreceli bolluğu nedeniyle sıklıkla gereklidir. Bozulmamış proteinlerin ve yukarıdan aşağıya analizler olarak adlandırılan PTM'lerinin analizi daha rutin hale gelmiş olsa da, proteinlerin enzimatik sindirimi ve aşağıdan yukarıya analizlerde bileşen peptitlerinin analizi hala PTM analizi için en yaygın kullanılan yoldur. En çok çalışılan iki PTM ve in vivo olarak en yaygın iki PTM, glikozilasyon ve fosforilasyon^4'tür. Bu iki PTM, hücre sinyalizasyonu ve tanınmasında önemli rol oynar ve bu nedenle hastalık araştırmalarında karakterize etmek için önemli modifikasyonlardır.

Çeşitli PTM'lerin kimyasal özellikleri genellikle analizden önce protein ve peptit seviyelerinde bu PTM'lerin zenginleştirilmesine yönelik yollar sağlar. Glikozilasyon, her monosakkarit üzerindeki hidroksil gruplarının bolluğu nedeniyle hidrofilik bir PTM'dir. Bu özellik, hidrofilik etkileşim kromatografisinde (HILIC) glikopeptidleri zenginleştirmek için kullanılabilir, bu da daha fazla hidrofilik glikopeptidi hidrofobik modifiye edilmemiş peptitlerden ayırabilir⁵. Fosforilasyon, asidik pH dışında negatif yüklü olan fosfat moiety'yi ekler. Bu yük nedeniyle, fosforile edilmemiş türler yıkanırken, fosforeptitleri çekmek ve bağlamak için titanyum da dahil olmak üzere çeşitli metal katyonlar kullanılabilir. Bu, immobilize metal afinite kromatografisinin (IMAC) prensibidir. Glikozilasyon ve fosforilasyon için bu ve diğer zenginleştirme stratejileri hakkında daha fazla tartışma son derlemelerde bulunabilir ^6,7.

PTM'lerin peptitler üzerindeki düşük stokiyometrisi nedeniyle zenginleştirme protokolleri için nispeten büyük miktarlarda başlangıç peptid materyaline (0.5 mg veya daha fazla) sıklıkla ihtiyaç duyulur. Tümör çekirdek biyopsisi veya beyin omurilik sıvısı analizleri gibi bu miktarda numunenin kolayca elde edilemeyeceği senaryolarda, maksimum biyomoleküler bilgi ile sonuçlanan kolay iş akışları kullanmak faydalıdır. Laboratuvarımız ve diğerleri tarafından geliştirilen son stratejiler, aynı PTM zenginleştirme iş akışı 8,9,10,11,12 kullanılarak glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı ve paralel analizini vurgulamıştır. Bu iki PTM'nin kimyasal özellikleri farklı olsa da, bu PTM'ler yenilikçi ayırma teknikleri ve kullanılan malzemeler nedeniyle birden fazla adımda analiz edilebilir. Örneğin, elektrostatik itme-hidrofilik etkileşim kromatografisi (ERLIC), analitler ve mobil faz arasındaki hidrofilik etkileşimlere dayanan ayrımları, analitler ve sabit faz malzemesi^13,14,15,16 arasındaki yük-yük etkileşimleri ile kaplar. Asidik pH'da, fosforile peptitlerin sabit faza çekilmesi, modifiye edilmemiş peptitlerden tutulmalarını ve ayrılmalarını artırabilir. Hidrofilik mikrosferler üzerinde hareketsiz hale getirilmiş Ti(IV)'den oluşan malzeme, fosfopeptitleri ve nötr, asidik ve mannoz-6-fosforile glikopeptidleri ayırmak için HILIC ve IMAC bazlı elüsyon için kullanılabilir^17,18. Bu strateji çift işlevli Ti(IV)-IMAC olarak bilinir. Birden fazla PTM'yi tek bir iş akışında zenginleştirmek için bu stratejileri kullanmak, potansiyel PTM çapraz konuşma etkileşimlerinin analizlerini daha erişilebilir hale getirebilir. Ek olarak, toplam numune miktarı ve zaman gereksinimleri, paralel olarak gerçekleştirildiğinde geleneksel zenginleştirme yöntemlerinden daha azdır (yani, ayrı numune alikotlarında HILIC ve IMAC).

Protein glikozilasyonu ve fosforilasyonun eşzamanlı analizi için çift fonksiyonlu Ti (IV) -IMAC stratejisini göstermek için, ölüm sonrası insan pankreas dokularını analiz etmek için uyguladık. Pankreas hem sindirim enzimleri hem de insülin ve glukagon dahil olmak üzere düzenleyici hormonlar üretir. Pankreas hastalığında pankreas fonksiyonu bozulur. Diyabette, kan şekerinin düzenlenmesi etkilenir ve kanda daha yüksek glikoz seviyelerine yol açar. Pankreatitte, inflamasyon organın otomatik sindiriminden kaynaklanır³. Glikozilasyon ve fosforilasyon dahil olmak üzere PTM profillerindeki değişiklikler, sıklıkla olduğu gibi, diğer hastalıklarda da ortaya çıkabilir.

Burada, pankreas dokusundan ekstrakte edilen proteinlerden türetilen N-glikopeptitler ve fosfopeptitler için çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC stratejisine dayanan spin-tip tabanlı eşzamanlı zenginleştirme yöntemi için bir protokol tarif ediyoruz. Protokol, Şekil 1'de görülebileceği gibi, protein ekstraksiyonu ve sindirimi, zenginleştirme, MS veri toplama ve veri işlemeyi içerir. Bu çalışmadan elde edilen temsili veriler, PXD033065 tanımlayıcılı ProteomeXchange Konsorsiyumu aracılığıyla edinilebilir.

Şekil 1: İnsan pankreas dokularından N-glikopeptidlerin ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için iş akışı. Dokular, deterjan sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılarak protein ekstraksiyonundan önce ince bir toz haline getirilerek kriyo-toz haline getirilir. Proteinler daha sonra enzimatik sindirime tabi tutulur. Elde edilen peptitler, çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC kullanılarak zenginleştirmeden önce aliquoted edilir. Ham veriler, nano ölçekli ters fazlı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (nRPLC-MS) kullanılarak toplanır ve veritabanı arama yazılımı kullanılarak analiz edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokol, PTM analizlerini daha erişilebilir hale getirmeyi ve aynı iş akışındaki birden fazla PTM'nin daha yaygın analizini sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol, hücreler ve biyoakışkanlar dahil olmak üzere diğer karmaşık biyolojik matrislere uygulanabilir.

Pankreas dokularının araştırma için ölen kişinin akrabasından araştırma için onay alınmış ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Sağlık Bilimleri Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından izin alınmıştır. IRB gözetimi gerekli değildir, çünkü 45 CFR 46.102 (f) tarafından tanınan insan denekleri içermez.

DİKKAT: Bu protokolde kullanılan asitler (formik, asetik, trifloroasetik), bazlar (amonyum hidroksit) ve kriyojenler (sıvı azot) içeren reaktifler kullanılırken dikkatli olunmalıdır. İlgili tehlikelere ve gerekli önlemlere aşina olmak için kullanılan reaktifler için güvenlik bilgi formlarını okuyun. Yüzdeler kullanılarak belirtilen konsantrasyonlar hacim / toplam hacimdir (v / v) ve su ile seyreltilir.

1. Doku kriyo-pulverizasyonu, lizis ve protein ekstraksiyonu

1. Bir dewar'ı sıvı azotla doldurun. Pankreas dokularıyla temas edecek doku öğütücüsünün parçalarını, yani odacığı, pulverizörü ve geri kazanım kaşığını bir polistiren kapta önceden soğutun.
2. Dondurulmuş doku parçalarını önceden soğutulmuş numune tutucuya aktarın ve dokuya bir kaşık sıvı azot ekleyin.
3. Öğütücüyü odaya yerleştirin ve numuneyi ezmek için beş ila on kez tokmak kullanarak vurun. Öğütücüyü odadan çıkarın ve yapışkan doku tozunu ve parçalarını kazıyın.
4. Dokular erimeye başlarsa odaya bir kaşık sıvı azot ekleyin. Numune büyük doku parçaları olmadan ince bir toz haline gelene kadar pulverizasyon işlemini tekrarlayın. Numuneleri yaklaşık 100 mg alikotlara önceden soğutulmuş tüplere bölün.
5. % 4 sodyum dodesil sülfat (SDS), 150 mM NaCl ve 25 mM Tris (pH = 7.4) içeren lizis tamponu hazırlayın. Her biri 20x stok için proteaz ve fosfataz inhibitörünün her biri için bir tableti 500 μL suda çözün. Son 1x konsantrasyon için her bir inhibitörün gerekli hacim 20x stoğunu lizis tamponuna ekleyin.
6. Tüpe 100 mg doku başına 600 μL lizis tamponu ekleyin ve 800 rpm'de çalkalayarak 10 dakika boyunca bir ısıtma bloğunda 95 ° C'de inkübe edin. Numuneleri ısıtma bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
7. Örnekleri 60 W enerjide (20 kHz) 45 s için 15 s darbeler kullanarak 30 s dinlenme ile sonikleştirin. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 3.000 x g'de toplayın.
8. Süpernatantı 5x çökeltme çözücüsüne, 300 μL lizis tamponunu, %50 aseton, %49,9 etanol ve %0,1 asetik asit içeren 1,5 mL çökeltme çözücüsüne ekleyin. Gece boyunca -20 °C'de soğutun.
9. Numuneleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3.000 x g'de tekrar pelet edin ve süpernatanı çıkarın. Peleti bir spatula ile parçalayarak ve aynı miktarda çökeltme çözücüsü ile karıştırarak yıkayın. Pelet tekrar, yıkama adımını 2x tekrarlayarak.
10. Numuneyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 16.000 x g'de pelet edin. Numune peletini bir davlumbazda 15 dakika boyunca hava ile kurutun ve ilerlemeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

2. Protein sindirimi ve tuzdan arındırma

1. Protein peletini, 50 mM trietilammonyum bikarbonat (TEAB) ve 8 M üre içeren 300 μL taze yapılmış sindirim tamponunda yeniden askıya alın.
2. Üreticinin protokolüne göre bir protein testi kullanarak çözeltinin protein konsantrasyonunu tahmin edin.
3. Çözeltideki proteine, 5 mM'lik son konsantrasyona ditiyotreitol (DTT) ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 1 saat azaltın. Daha sonra, karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında 15 mM'lik son konsantrasyona iyodoasetamid (IAA) ekleyin, karıştırın ve alkilat ekleyin. DTT ilavesini öncekiyle aynı hacimde tekrarlayarak alkilasyonu söndürün ve karıştırın.
4. 1:100 enzim:protein oranında LysC / tripsin ekleyin ve 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, 1 M'< için kullanılan 8 M üreyi seyreltmek için 50 mM TEAB ekleyin 1:100 enzim: protein oranında tripsin ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
5. Trifloroasetik asit (TFA) ilavesiyle% 0.3 v / v'ye kadar sindirimi söndürün. Her 1 mg başlangıç proteini için, 1 mL asetonitril (ACN) ve 1 mL% 0.1 TFA ile 3x içeren bir tuzdan arındırma kartuşu (1 cc, 10 mg) şartlandırın.
6. Sindirilmiş karışımı tuz alma kartuşuna yükleyin. Karışımı 1 mL% 0.1 TFA kullanarak 3x yıkayın. Elüsyon yavaşsa, pozitif basınç uygulayın, ancak saniyede bir damla > bir akış hızından kaçının.
7. 1 mL% 60 ACN ve% 0.1 formik asit (FA) çözeltisi kullanan elute peptidler. Çözücü tamamen buharlaşana kadar santrifüjlü bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak yaklaşık 35 ° C'de salınımlı peptitleri kurutun.
8. Peptitleri 300 μL suda yeniden askıya alın ve üreticinin protokolüne göre bir peptid testi kullanarak peptid konsantrasyonlarını tahmin edin. Peptitleri 500 μg alikotlara bölün ve tamamen kurutun.

3. ERLIC N-glikopeptid zenginleştirme

NOT: Tam santrifüj hızları ve süreleri numunelere göre farklılık gösterebilir ve optimize edilmelidir. Genel olarak, malzemenin şartlandırılması ve yıkanması için 2 dakika boyunca 300 x g ve salınım için 5 dakika boyunca 100 x g uygundur.

1. Yaklaşık 3 mg pamuk yünü tartın ve boş bir 200 μL pipet ucuna koyun (spin-tip; bkz.
2. Güçlü anyon değişim zenginleştirme malzemesini bir tüpe aktarın ve 10 mg malzeme başına 200 μL% 0.1 TFA ekleyin. 500 μg peptitlerin zenginleştirilmesi için, 15 mg malzeme kullanın. Malzemeyi 15 dakika sallayarak etkinleştirin.
3. Bir tüp adaptörü kullanarak, spin-ucunu 2 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin ve uca 15 mg malzeme için yeterli bulamaç ekleyin. Masaüstü santrifüjde döndürerek sıvıyı çıkarın.
4. 200 μL ACN ile 3 kat santrifüj yaparak malzemeyi koşullandırın. 100 mM amonyum asetat (NH₄Ac), %1 TFA ve %80 ACN/%0,1 TFA (yükleme tamponu) kullanarak üçlü koşullandırmayı tekrarlayın.
5. 500 μg peptid numunelerini yaklaşık 200 μL yükleme tamponunda yeniden askıya alın ve spin ucundan geçirin. Tam bağlama sağlamak için akış akışını 2 kat yeniden yükleyin.
6. 200 μL %80 ACN/%0,1 TFA kullanarak 5x'i ve ardından %80 ACN/%0,1 FA'lık 200 μL kullanarak 2x'i santrifüj yaparak malzemeyi yıkayın.
7. Peptitleri, aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile santrifüj yaparak etkisiz hale getirin: %50 ACN/%0,1 FA (E1); %0,1 FA (E2); %0,1 TFA (E3); 300 mM KH₂PO₄, %10 ACN (E4).
8. Malzemeyi, 200 μL %80 ACN/%5 NH₄OH ile 2 kat santrifüj yaparak yıkayın. Kalan peptitleri 200 μL% 10 NH₄OH (E5) ile süzün.
9. Yaklaşık 35 °C'de santrifüjlü bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tüm salınımları tamamen kurutun.
10. Üreticinin protokolüne göre bir tuzdan arındırma ucu kullanarak temel elüsyonun (E5) tuzdan arındırılmasını gerçekleştirin.
11. Tuzdan arındırma ucundan gelen elüsyonu, yaklaşık 35 °C'de bir santrifüjlü vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tamlığa kavuşturun.

4. Ti(IV)-IMAC fosfopeptid zenginleştirme

NOT: Tam santrifüj hızları ve süreleri numunelere göre farklılık gösterebilir ve optimize edilmelidir. Genel olarak, malzemenin şartlandırılması ve yıkanması için 2 dakika boyunca 300 x g ve salınım için 5 dakika boyunca 100 x g uygundur.

1. Yaklaşık 3 mg pamuk yünü tartın ve boş bir 200 μL pipet ucuna (spin-tip) koyun.
2. Ti-IMAC fosfopeptid zenginleştirme malzemesini bir tüpe aktarın ve 10 mg malzeme başına 200 μL% 0.1 TFA ekleyin. 500 μg peptitlerin zenginleştirilmesi için 10 mg malzeme kullanın.
3. Bir tüp adaptörü kullanarak, spin ucunu 2 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin ve uca 10 mg malzeme için yeterli bulamaç ekleyin. Masaüstü santrifüjde döndürerek sıvıyı çıkarın.
4. Yukarıda açıklandığı gibi aynı santrifüj ayarlarını kullanarak malzemeyi 200 μL %40 ACN/%3 TFA ile koşullandırın. Peptit numunelerini 200 μL'de %40 ACN/%3 TFA'da yeniden askıya alın ve spin ucundan akın. Daha eksiksiz bağlama sağlamak için akışı iki kez yeniden yükleyin.
5. Malzemeyi 200 μL %50 ACN, %6 TFA ve 200 mM NaCl çözeltisi ile santrifüj yaparak yıkayın, ardından 200 μL'de 2x'i %30 ACN ve %0,1 TFA çözeltisi ile yıkayın.
6. 200 μL% 10 NH₄OH olan elute peptidler. Elüsyonu tamamen vakum altında kurulayın. Üreticinin protokolüne göre bir tuzdan arındırma ucu kullanarak tuzdan arındırma işlemini gerçekleştirin. Tuzdan arındırma ucundaki elüsyonu vakum altında tamlığa kadar kurutun.

5. Çift fonksiyonlu Ti (IV) eşzamanlı zenginleştirme

NOT: Tam santrifüj hızları ve süreleri numunelere göre farklılık gösterebilir ve optimize edilmelidir. Genel olarak, malzemenin şartlandırılması ve yıkanması için 2 dakika boyunca 300 x g ve salınım için 5 dakika boyunca 100 x g uygundur.

1. Yaklaşık 3 mg pamuk yünü tartın ve boş bir spin-ucu içine paketleyin.
2. Yaklaşık 1 g Ti(IV)-IMAC malzemesini bir tüpe aktarın. Bilinen bir malzeme konsantrasyonuna, örneğin 20 mg / 200 μL'ye% 0.1 TFA ekleyin (malzeme bu süspansiyonda 4 ° C'de saklanabilir).
3. 500 μg peptitlerden zenginleştirme için, 20 mg malzeme aktarmak için bir spin ucuna yeterli bulamaç ekleyin. Spin ucunu 200 μL% 0,1 TFA ile santrifüj yaparak yıkayın.
4. Numuneleri 200 μL yükleme/yıkama çözücüsü (%80 ACN ve %3 TFA) içinde yeniden askıya alın ve sıkma ucundan akın. Akış akışını 2 kat yeniden yükleyin.
5. Spin ucunu 6x, 200 μL yükleme/yıkama çözücüsü ile santrifüj yaparak yıkayın. Spin ucunu 200 μL %80 ACN/%0,1 FA çözeltisi ile yıkayın.
6. Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 60 ACN / % 0.1 FA (E1) ve% 40 ACN /% 0.1 FA (E2). Her elüsyonu ayrı ayrı analiz edin.
7. Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 20 ACN /% 0.1 FA ve% 0.1 FA. İki salınımı birleştirin ve tek bir örnek (E3) olarak analiz edin.
8. Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 40 ACN / % 3 TFA; %50 ACN/%6 TFA, 200 mM NaCl; ve% 30 ACN / % 0.1 TFA. Bu salınımları birleştirin ve paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırdıktan sonra bir (E4) olarak analiz edin.
9. 3x için 200 μL %90 ACN/%2,5 NH₄OH kullanarak malzemeyi temel pH'a koşullandırın. Bu yıkamaları atın.
10. Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 60 ACN / % 10 NH 4 OH (E5) ve% 40 ACN / % 10 NH₄OH (E6). Paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırmadan sonra bu salınımları ayrı ayrı analiz edin.
11. Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 20 ACN / % 10 NH₄OH; %10 ACN/%10 NH₄OH; ve% 10 NH₄OH. Bu salınımları birleştirin ve paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırdıktan sonra bir (E7) olarak analiz edin.
12. Tüm salınımları tamamen vakum altında kurutun.

6. Nano akışlı ters fazlı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (nRPLC-MS)

NOT: MS veri toplama ve analiz yöntemleri çeşitlidir ve bu nedenle aşağıdaki adımlarda yalnızca bir önerilen LC-MS işlem hattı (ve ilişkili parametreleri) burada açıklanmaktadır. Daha önce özetlenen numune hazırlama ve zenginleştirme adımları kullanılarak oluşturulan numuneler, yeterli veri kalitesi göz önüne alındığında, ticari olarak temin edilebilen kromatografik sütunların kullanılması da dahil olmak üzere diğer enstrümantal kurulumlar kullanılarak analiz edilebilir.

1. ^19'da açıklandığı gibi C18 malzemesi kullanarak 15 cm uzunluğunda bir kılcal damarı (75 μm iç çap) çekin ve paketleyin. Mobil faz A (suda% 0.1 FA) ve mobil faz B (ACN'de% 0.1 FA) hazırlayın.
2. Zenginleştirilmiş peptit numunelerini% 3 mobil faz B'nin 15 μL'sinde yeniden oluşturun. numunenin 2 μL'sini (~% 13 numune hacmi) doğrudan kolona yükleyin. Her örneği teknik kopyada analiz edin.
3. Elute peptidler, 0.3 μL / dak akış hızında 90 dakika boyunca% 3 ila% 30 mobil faz B arasında bir gradyan kullanarak. Kolonu 8 dakika boyunca% 75 B'yi, ardından 8 dakika boyunca% 95 B kullanarak yıkayın, yöntemi 12 dakika boyunca% 3 B'de denge ile bitirin.
4. Aşağıdaki parametrelerle en üstteki 20 pikin veriye bağlı olarak elde edilmesini kullanarak kütle spektrometresini pozitif iyon modunda çalıştırın: püskürtme voltajı 2 kV; LC/MS'de 120.000 çözünürlükte 400-2.000 m/z'den MS 1 algılama, 2E5 otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi,¹⁰⁰ ms maksimum enjeksiyon süresi, %30 RF lens, 1,6 m/z pencereli dörtlü izolasyon, şarj durumları için 2-8 ve belirlenmemiş ve 30 s dinamik dışlama; LC/MS'de MS 2 tespiti, %22, %30 ve %38'de kademeli HCD parçalanması, 30.000 çözünürlükte sabit ilk kütle 120 m/z, 5E4 AGC hedefi ve 2,5E4 minimum yoğunluk gereksinimi kullanılarak tespit edilir.

7. MS veri analizi

NOT: Aynı veri kümesini analiz etmek için iki farklı yazılım kullanan bir veri analizi işlem hattı burada sunulmuştur. Fosforilasyon ve glikozilasyon, burada açıklandığı gibi iki ayrı yazılım yerine tek bir yazılım kullanılarak aynı anda aranabilir, ancak genel olarak, yazılım arama süresi arama alanıyla, yani dikkate alınan PTM sayısıyla orantılıdır. Bu nedenle glikopeptitler ve fosfopeptitlerin aranmasına paralel olarak iki farklı yazılım kullanılmaktadır.

1. Ham veri dosyalarını uygun yazılımı kullanarak işleyin (bkz.
   1. UniProt insan (veya uygun türe özgü) veritabanına karşı spektrumları arayın. Cys'nin karbamidometilasyonunu sabit bir modifikasyon olarak ayarlayın. Maksimum kaçırılan enzimatik bölünme sayısını iki olarak ayarlayın.
2. Ham veri dosyalarında, ticari bir yazılım kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu), analiz edilecek glikopeptitleri arayın²⁰. 10 ppm öncü kütle toleransı ve minimum dört kalıntı peptid uzunluğu ile 0.01 Da parça kütle toleransı kullanın.
   1. Yazılıma gömülü N-glikan veritabanını kullanarak arama, HexNAc(2)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Fosfo(1) ve HexNAc(3)Hex(3-4)Fosfo(1) dahil olmak üzere tipik mannoz-6-fosfat(M6P)glikanlarla genişletilmiştir.
   2. N-glikozilasyonu ortak bir modifikasyon olarak ayarlayın. Peptit spektral eşleşmesi (PSM) başına maksimum toplam modifikasyonları bir ortak ve iki nadir olarak ayarlayın.
   3. Aşağıdaki değişken modifikasyonları ayarlayın: Met oksidasyonu (nadir), Asn ve Gln'de deamidasyon (nadir) ve Ser, Thr ve Tyr'da fosforilasyon (ortak). Aşağıdaki tanımlama filtrelerini ayarlayın: skor kesme > 150, |log probu| > 1 ve delta mod skoru 10>.
   4. Arama sonuçlarını Proteinler ve Peptit Grubu sekmelerinde dışa aktarın ve analiz edin.
   5. M6P glikanları içeren tanımlamaları, MS / MS spektrumlarında FosfoHex oksonyum iyonunun (243 m / z) varlığı açısından manuel olarak tarayın ve bu tanısal iyonu içermeyen yanlış pozitif tanımlamaları kaldırın.
3. Ham veri dosyalarında, açık kaynaklı bir yazılım kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), analiz edilecek fosfopeptitleri arayın²¹. 20 ppm ilk arama peptid toleransı ve 4.5 ppm ana arama peptid toleransı kullanın.
   1. Peptit başına maksimum değişiklik sayısını 5 olarak ayarlayın. PSM ve protein yanlış keşif oranını (FDR) %1'e ve minimum peptid uzunluğunu 7 kalıntıya ayarlayın.
   2. Met'te oksidasyon, N-terminal protein asetilasyonu ve Ser, Thr ve Tyr'da fosforilasyon olarak değişken modifikasyonlar ayarlayın. modificationSpecificPeptides dosyalarını kullanarak arama sonuçlarını analiz edin.
4. PTM'lerin protein, peptit ve modifikasyon bölgesi seviyelerindeki tanımlama sayısını belirleyin.

Ham dosyalar ve arama sonuçları da dahil olmak üzere temsili kütle spektrometresi verileri, PXD03306522 veri kümesi tanımlayıcısı ile PRIDE iş ortağı deposu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumu'na yatırılmıştır.

Bu çalışmada, her zenginleştirme elüsyonu için çift enjeksiyon replikaları analiz edilmiştir. Her iki teknik replikasyondan yapılan tanımlamalar son analizde harmanlanmıştır. MS / MS parçalanması için peptid öncüllerinin toplanmasında veriye bağımlı edinimin yarı stokastik doğası nedeniyle, teknik kopyalar arasında yaklaşık% 70-80'lik bir tanımlama çakışması beklenmektedir. Bu yöntemlerin kullanıldığı uygulamalarda, en az iki teknik çoğaltma teşvik edilir. Aşağı akış istatistiksel analizleri için, farklı deney koşulları için biyolojik replikasyonlar dikkate alınmalıdır. Veri raporlaması için istenen sıkılığa bağlı olarak, tanımlamalar için filtreler ayarlamak yararlı olabilir, örneğin, raporlanacak en az x sayıda teknik veya biyolojik kopyada tanımlama.

Her zenginleştirmeden elde edilen her bir elüsyon için örnek bir toplam iyon kromatogramı (TIC), Ek Şekil S1, Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3'te görülebilir. Ham MS dosyalarının veritabanı araması sırasında katı filtrelerin kullanılması, MS / MS spektrumlarının PTM'lerle peptit dizilerine daha doğru ve daha güvenli bir şekilde tanımlanmasını sağlayabilir. Her elüsyon için TIC'lerde açıkça görüldüğü gibi, peptid örnekleri zenginleştirmeden fraksiyonasyondan sonra bile hala karmaşıktır. Yüksek çözünürlüklü, yüksek kütle doğruluğu ve hızlı taramalı kütle spektrometresi ile birleştirilen nanoflow kromatografisi, triptik bir sindirimden peptitler gibi karmaşık karışımların büyük hassasiyet ve derinlikle analiz edilmesine yardımcı olabilir. Glikozile ve fosforile spektrumlar için örnek MS/MS spektrumları Şekil 2'de görülebilir. Bunlar gibi iyi açıklamalı spektrumlar, veritabanı arama yazılımı tarafından atanan tanımlamaya olan güveni artıran öncüllerin zengin parçalanmasından kaynaklanır.

Şekil 3 , her bir elüsyon fraksiyonu üzerinde çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC spin-tip zenginleştirme yöntemi kullanılarak yapılan peptid tanımlamalarını göstermektedir. Glikopeptidlerin çoğunluğu ilk dört fraksiyonda süzülürken, fosfopeptidlerin çoğunluğu son üç fraksiyonda süzülür. Farklı PTM'lerin fraksiyonlar arasında bu şekilde ayrılması, salınımlar arasında yeterince ayrılmadıkları takdirde ortaya çıkabilecek iyonizasyondaki herhangi bir parazitin önlenmesine yardımcı olur.

Şekil 4 , ikili Ti yönteminden elde edilen glikoproteomik sonuçları, yalnızca ERLIC glikopeptid zenginleştirme ile karşılaştırmaktadır. Şekil 4A'da görülebileceği gibi, protein, glikoform, PTM ve modifikasyon bölgesi düzeylerindeki birçok tanımlama her iki yöntemde de ortaktır. Bununla birlikte, ERLIC, ikili Ti yöntemine kıyasla her seviyede daha benzersiz tanımlamalara sahiptir. Bu, yanlış pozitif tanımlamaları gidermek için verilerin ek manuel kürasyonunu gerektiren M6P (en az bir fosfat grubuna sahip yüksek mannoz glikanları) glikoformlarını içerir. Ayrıca, her iki yöntem kullanılarak tanımlanan glikan türleri benzerdir. Her bir glikan tipinin, bileşimlerine göre altı kategoriye bağlandıktan sonraki oranları, her iki yöntem arasında benzerdir16.

İkili Ti yönteminden elde edilen fosfoproteomik sonuçlar, Şekil 5'teki geleneksel IMAC fosfopeptid zenginleştirme ile karşılaştırılmıştır. Çift fonksiyonlu Ti(IV) zenginleştirme, protein, peptit ve PTM seviyelerinde önemli örtüşmelerle gösterildiği gibi geleneksel IMAC'ye benzer şekilde performans gösterir. Her iki yöntemi de kullanarak, fosforile amino asitlerin çoğunluğu serin ve treonindir, yaklaşık% 1 fosforile tirozin de tanımlanmıştır. Her iki yöntem de çoklu fosforile peptitleri tanımlamak için kullanılabilir.

Modifiye proteinlerin listeleri genlerle eşleştirilir ve Şekil 6 ve Şekil 7'de gösterildiği gibi gen ontolojisi (GO) zenginleştirmesi kullanılarak analiz edilir. ERLIC ve IMAC kullanılarak tanımlanan modifiye proteinler için GO analizleri Ek Şekil S4 ve Ek Şekil S5'te gösterilmiştir. Ücretsiz, çevrimiçi Metascape aracı zenginleştirmeyi gerçekleştirir ve zenginleştirilmiş yollara ve süreçlere dayanan ağlar oluşturur ve bunları benzerlikle birbirine bağlar23. Her GO analizi için düğüm terimleri Ek Tablo S1, Ek Tablo S2, Ek Tablo S3 ve Ek Tablo S4'te bulunabilir. Glikozilasyon, hücre dışı matrikste önemli bir protein PTM olduğundan, tanımlanan N-glikoproteinlerin listesi kullanılarak zenginleştirilmiş birkaç terimin hücre dışı matrisle ilişkili olması şaşırtıcı değildir. Fosforilasyon, hücre sinyalizasyonunda rol oynar ve bu, tanımlanan fosfoproteinlerin listesi kullanılarak bulunan birkaç zenginleştirilmiş terimde görülebilir.

Şekil 2: N-glikozile ve fosforile peptitlerden açıklamalı yüksek güvenilirlikli MS/MS spektrumları. (A) Mannoz-6-fosforile peptid GSLSYLN(HexNAc(2)Hex(7)Fosfo(1))VTR, yedinci zenginleştirme elüsyonundan 53.08-53.33 dakika sonra tutma sürelerinden tanımlanmıştır. 243 m/z'de PhosphoHex oksonyum iyonunun varlığı, bu PTM görevlendirmesine olan güveni artırır. (B) Fosforile peptid VEEEQEADEEDVS(Fosfo)EEEAESK, altıncı zenginleştirme elüsyonundan itibaren 32.31-32.72 dakika retansiyon sürelerinden tioredoksin ile ilişkili transmembran protein 1'den (TMX1) elde edilir. Peptit fragman iyonları ve bunların fosforillenmiş varyantları (fragman ile gösterilir*) arasında -98 (-H3PO4) nötr kayıpların varlığı, bu PTM atamasına olan güveni arttırır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC zenginleştirmesinden peptid tanımlamalarının yedi salınımda karşılaştırılması. Tanımlamaların sayısı, iki teknik (enjeksiyon) replikasyondan en az birinde tanımlanan peptitleri içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC zenginleştirmesinden elde edilen glikoproteomik sonuçların geleneksel ERLIC glikopeptid zenginleştirmesi ile karşılaştırılması. (A) Zenginleştirme yöntemleri arasında glikoprotein, glikoform (protein, bölge, glikan), glikan bileşimi ve glikosit tanımlamalarının Venn diyagramları. (B) Zenginleştirme yöntemleri arasında peptid omurgaları üzerinde tanımlanan glikanların pasta çizelgeleri. Glikanlar, bileşimlerine göre altı gruba ayrılır16. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC zenginleştirmesinden elde edilen fosfoproteomik sonuçların konvansiyonel Ti(IV)-IMAC fosfopeptid zenginleştirmesi ile karşılaştırılması. (A) Zenginleştirme yöntemleri arasında fosfoprotein, fosfopeptid ve fosfosit tanımlamalarının Venn diyagramları. (B) Amino asit kalıntısı ile parçalanmış, güvenle lokalize edilmiş (u veya daha yüksek olasılıklı) foskozitlerin pasta grafikleri. (C) Bir dizi fosforile kalıntı ile bağlanmış tanımlanmış fosfopeptitlerin yığılmış çubuk grafiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC zenginleştirmesi kullanılarak tanımlanan N-glikoproteinlerin gen ontolojisi zenginleştirilmesi. N-glikoproteinler genlere geri eşlenir ve genomun tamamı arka plan olarak kullanılarak önemli ölçüde zenginleştirilmiş yollar ve süreç terimleri tanımlanır. Terim benzerliği ile bağlanan terim kümelerini etiketlemek için çeşitli renkler kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC zenginleştirmesi kullanılarak tanımlanan fosfoproteinlerin gen ontolojisi zenginleştirilmesi. Fosfoproteinler genlere geri eşlenir ve genomun tamamı arka plan olarak kullanılarak önemli ölçüde zenginleştirilmiş yollar ve süreç terimleri tanımlanır. Terim benzerliği ile birbirine bağlanan terim kümelerini etiketlemek için çeşitli renkler kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC (E1'den E7'ye, paneller A-G) zenginleştirmesinden elde edilen her bir elüsyondan örnek toplam iyon kromatogramları (TIC'ler). Toplam sinyal (iyon akımı) 117 dakikalık veri toplama süresi boyunca çizilir. Baz tepe noktasının yoğunluğu NL değeri ile verilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: ERLIC (E1 ila E5, paneller A-E) zenginleştirmesinden elde edilen her bir elüsyondan örnek toplam iyon kromatogramları (TIC'ler). Toplam sinyal (iyon akımı) 117 dakikalık veri toplama süresi boyunca çizilir. Baz tepe noktasının yoğunluğu NL değeri ile verilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S3: Ti-IMAC zenginleştirmesinden elde edilen elüsyondan örnek toplam iyon kromatogramı (TIC). Toplam sinyal (iyon akımı) 117 dakikalık veri toplama süresi boyunca çizilir. Baz tepe noktasının yoğunluğu NL değeri ile verilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S4: ERLIC ile konvansiyonel glikopeptid zenginleştirmesi kullanılarak tanımlanan N-glikoproteinlerin gen ontolojisi zenginleştirilmesi. N-glikoproteinler genlere geri eşlenir ve genomun tamamı arka plan olarak kullanılarak önemli ölçüde zenginleştirilmiş yollar ve süreç terimleri tanımlanır. Terim benzerliği ile birbirine bağlanan terim kümelerini etiketlemek için çeşitli renkler kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S5: Ti(IV)-IMAC ile konvansiyonel fosfopeptid zenginleştirmesi kullanılarak tanımlanan fosfoproteinlerin gen ontolojisi zenginleştirilmesi. Fosfoproteinler genlere geri eşlenir ve genomun tamamı arka plan olarak kullanılarak önemli ölçüde zenginleştirilmiş yollar ve süreç terimleri tanımlanır. Terim benzerliği ile birbirine bağlanan terim kümelerini etiketlemek için çeşitli renkler kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablolar S1-S4: Gen ontolojisi zenginleştirme analizleri için metascape düğüm bilgisi. Tablolar, çift Ti (Tablo S1 ve Tablo S2), ERLIC (Tablo S3) kullanan N-glikoproteinler ve IMAC (Tablo S4) kullanılarak tanımlanan N-glikoproteinler ve fosfoproteinlerin listeleri için düğüm bilgilerini içerir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.