Yöntem makalesi

İnsan pankreas dokularından N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için spin-tip zenginleştirme stratejisi

DOI:

10.3791/63735

⸱

4 Mayıs 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Post-translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) protein yapılarını ve fonksiyonlarını değiştirir. Birden fazla PTM tipinin aynı anda zenginleştirilmesi yöntemleri, analizlerde kapsama alanını en üst düzeye çıkarabilir. Çift fonksiyonlu Ti(IV)-immobilize metal afinite kromatografisini ve ardından pankreas dokularında protein N-glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı zenginleştirilmesi ve analizi için kütle spektrometresini kullanan bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi, translasyonel modifikasyonların (PTM'ler) derin kapsamını sağlayabilir, ancak bu modifikasyonların karmaşık biyolojik matrislerden zenginleştirilmesi, modifiye edilmemiş analitlere kıyasla düşük stokiyometrileri nedeniyle sıklıkla gereklidir. Elde edilen peptitler analiz edilmeden önce proteinlerin enzimatik olarak sindirildiği aşağıdan yukarıya proteomik iş akışlarında peptitler üzerindeki PTM'lerin çoğu zenginleştirme iş akışı, yalnızca bir tür modifikasyonu zenginleştirir. Bununla birlikte, biyolojik fonksiyonlara yol açan PTM'lerin tüm tamamlayıcısıdır ve tek bir PTM tipinin zenginleştirilmesi, PTM'lerin bu tür çapraz konuşmasını kaçırabilir. PTM çapraz konuşması, protein glikozilasyonu ve fosforilasyon, insan proteinlerindeki en yaygın iki PTM ve ayrıca kütle spektrometrisi iş akışlarını kullanan en çok çalışılan iki PTM arasında gözlenmiştir. Burada açıklanan eşzamanlı zenginleştirme stratejisi kullanılarak, her iki PTM de karmaşık bir biyolojik matris olan ölüm sonrası insan pankreas dokusundan zenginleştirilmiştir. Çift fonksiyonlu Ti(IV)-immobilize metal afinite kromatografisi, uygun bir spin ucu tabanlı yöntemle çoklu fraksiyonlarda aynı anda çeşitli glikozilasyon ve fosforilasyon formlarını ayırmak için kullanılır ve potansiyel PTM çapraz konuşma etkileşimlerinin aşağı akış analizlerine izin verir. Gliko ve fosfopeptitler için bu zenginleştirme iş akışı, birden fazla PTM'nin derin profilini çıkarmak ve gelecekteki çalışmalar için potansiyel hedef molekülleri tanımlamak için çeşitli numune tiplerine uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein post-translasyonel modifikasyonları (PTM'ler), protein yapılarının ve dolayısıyla işlevlerinin ve aşağı akış biyolojik süreçlerinin modüle edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. İnsan proteomunun çeşitliliği, çeşitli PTM'lerin sağladığı kombinatoryal değişkenlik nedeniyle katlanarak artar. Genom tarafından tahmin edildiği gibi kanonik dizilerinden farklı protein varyantları proteoformlar olarak bilinir ve birçok proteoform PTM'lerden kaynaklanır1. Sağlık ve hastalıkta proteoform çeşitliliğinin incelenmesi son yıllarda büyük ilgi gören bir araştırma alanı haline gelmiştir 2,3.

Proteoformların ve daha spesifik olarak büyük derinliğe sahip PTM'lerin incelenmesi, kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik yöntemlerin geliştirilmesiyle daha kolay hale gelmiştir. MS kullanılarak, analitler iyonize edilir, parçalanır ve fragmanların m / z'sine göre tanımlanır. Zenginleştirme yöntemleri, PTM'lerin modifiye edilmemiş protein formlarına kıyasla düşük göreceli bolluğu nedeniyle sıklıkla gereklidir. Bozulmamış proteinlerin ve yukarıdan aşağıya analizler olarak adlandırılan PTM'lerinin analizi daha rutin hale gelmiş olsa da, proteinlerin enzimatik sindirimi ve aşağıdan yukarıya analizlerde bileşen peptitlerinin analizi hala PTM analizi için en yaygın kullanılan yoldur. En çok çalışılan iki PTM ve in vivo olarak en yaygın iki PTM, glikozilasyon ve fosforilasyon4'tür. Bu iki PTM, hücre sinyalizasyonu ve tanınmasında önemli rol oynar ve bu nedenle hastalık araştırmalarında karakterize etmek için önemli modifikasyonlardır.

Çeşitli PTM'lerin kimyasal özellikleri genellikle analizden önce protein ve peptit seviyelerinde bu PTM'lerin zenginleştirilmesine yönelik yollar sağlar. Glikozilasyon, her monosakkarit üzerindeki hidroksil gruplarının bolluğu nedeniyle hidrofilik bir PTM'dir. Bu özellik, hidrofilik etkileşim kromatografisinde (HILIC) glikopeptidleri zenginleştirmek için kullanılabilir, bu da daha fazla hidrofilik glikopeptidi hidrofobik modifiye edilmemiş peptitlerden ayırabilir5. Fosforilasyon, asidik pH dışında negatif yüklü olan fosfat moiety'yi ekler. Bu yük nedeniyle, fosforile edilmemiş türler yıkanırken, fosforeptitleri çekmek ve bağlamak için titanyum da dahil olmak üzere çeşitli metal katyonlar kullanılabilir. Bu, immobilize metal afinite kromatografisinin (IMAC) prensibidir. Glikozilasyon ve fosforilasyon için bu ve diğer zenginleştirme stratejileri hakkında daha fazla tartışma son derlemelerde bulunabilir 6,7.

PTM'lerin peptitler üzerindeki düşük stokiyometrisi nedeniyle zenginleştirme protokolleri için nispeten büyük miktarlarda başlangıç peptid materyaline (0.5 mg veya daha fazla) sıklıkla ihtiyaç duyulur. Tümör çekirdek biyopsisi veya beyin omurilik sıvısı analizleri gibi bu miktarda numunenin kolayca elde edilemeyeceği senaryolarda, maksimum biyomoleküler bilgi ile sonuçlanan kolay iş akışları kullanmak faydalıdır. Laboratuvarımız ve diğerleri tarafından geliştirilen son stratejiler, aynı PTM zenginleştirme iş akışı 8,9,10,11,12 kullanılarak glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı ve paralel analizini vurgulamıştır. Bu iki PTM'nin kimyasal özellikleri farklı olsa da, bu PTM'ler yenilikçi ayırma teknikleri ve kullanılan malzemeler nedeniyle birden fazla adımda analiz edilebilir. Örneğin, elektrostatik itme-hidrofilik etkileşim kromatografisi (ERLIC), analitler ve mobil faz arasındaki hidrofilik etkileşimlere dayanan ayrımları, analitler ve sabit faz malzemesi13,14,15,16 arasındaki yük-yük etkileşimleri ile kaplar. Asidik pH'da, fosforile peptitlerin sabit faza çekilmesi, modifiye edilmemiş peptitlerden tutulmalarını ve ayrılmalarını artırabilir. Hidrofilik mikrosferler üzerinde hareketsiz hale getirilmiş Ti(IV)'den oluşan malzeme, fosfopeptitleri ve nötr, asidik ve mannoz-6-fosforile glikopeptidleri ayırmak için HILIC ve IMAC bazlı elüsyon için kullanılabilir17,18. Bu strateji çift işlevli Ti(IV)-IMAC olarak bilinir. Birden fazla PTM'yi tek bir iş akışında zenginleştirmek için bu stratejileri kullanmak, potansiyel PTM çapraz konuşma etkileşimlerinin analizlerini daha erişilebilir hale getirebilir. Ek olarak, toplam numune miktarı ve zaman gereksinimleri, paralel olarak gerçekleştirildiğinde geleneksel zenginleştirme yöntemlerinden daha azdır (yani, ayrı numune alikotlarında HILIC ve IMAC).

Protein glikozilasyonu ve fosforilasyonun eşzamanlı analizi için çift fonksiyonlu Ti (IV) -IMAC stratejisini göstermek için, ölüm sonrası insan pankreas dokularını analiz etmek için uyguladık. Pankreas hem sindirim enzimleri hem de insülin ve glukagon dahil olmak üzere düzenleyici hormonlar üretir. Pankreas hastalığında pankreas fonksiyonu bozulur. Diyabette, kan şekerinin düzenlenmesi etkilenir ve kanda daha yüksek glikoz seviyelerine yol açar. Pankreatitte, inflamasyon organın otomatik sindiriminden kaynaklanır3. Glikozilasyon ve fosforilasyon dahil olmak üzere PTM profillerindeki değişiklikler, sıklıkla olduğu gibi, diğer hastalıklarda da ortaya çıkabilir.

Burada, pankreas dokusundan ekstrakte edilen proteinlerden türetilen N-glikopeptitler ve fosfopeptitler için çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC stratejisine dayanan spin-tip tabanlı eşzamanlı zenginleştirme yöntemi için bir protokol tarif ediyoruz. Protokol, Şekil 1'de görülebileceği gibi, protein ekstraksiyonu ve sindirimi, zenginleştirme, MS veri toplama ve veri işlemeyi içerir. Bu çalışmadan elde edilen temsili veriler, PXD033065 tanımlayıcılı ProteomeXchange Konsorsiyumu aracılığıyla edinilebilir.

figure-introduction-1
Şekil 1: İnsan pankreas dokularından N-glikopeptidlerin ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için iş akışı. Dokular, deterjan sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılarak protein ekstraksiyonundan önce ince bir toz haline getirilerek kriyo-toz haline getirilir. Proteinler daha sonra enzimatik sindirime tabi tutulur. Elde edilen peptitler, çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC kullanılarak zenginleştirmeden önce aliquoted edilir. Ham veriler, nano ölçekli ters fazlı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (nRPLC-MS) kullanılarak toplanır ve veritabanı arama yazılımı kullanılarak analiz edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokol, PTM analizlerini daha erişilebilir hale getirmeyi ve aynı iş akışındaki birden fazla PTM'nin daha yaygın analizini sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol, hücreler ve biyoakışkanlar dahil olmak üzere diğer karmaşık biyolojik matrislere uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas dokularının araştırma için ölen kişinin akrabasından araştırma için onay alınmış ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Sağlık Bilimleri Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından izin alınmıştır. IRB gözetimi gerekli değildir, çünkü 45 CFR 46.102 (f) tarafından tanınan insan denekleri içermez.

DİKKAT: Bu protokolde kullanılan asitler (formik, asetik, trifloroasetik), bazlar (amonyum hidroksit) ve kriyojenler (sıvı azot) içeren reaktifler kullanılırken dikkatli olunmalıdır. İlgili tehlikelere ve gerekli önlemlere aşina olmak için kullanılan reaktifler için güvenlik bilgi formlarını okuyun. Yüzdeler kullanılarak belirtilen konsantrasyonlar hacim / toplam hacimdir (v / v) ve su ile seyreltilir.

1. Doku kriyo-pulverizasyonu, lizis ve protein ekstraksiyonu

  1. Bir dewar'ı sıvı azotla doldurun. Pankreas dokularıyla temas edecek doku öğütücüsünün parçalarını, yani odacığı, pulverizörü ve geri kazanım kaşığını bir polistiren kapta önceden soğutun.
  2. Dondurulmuş doku parçalarını önceden soğutulmuş numune tutucuya aktarın ve dokuya bir kaşık sıvı azot ekleyin.
  3. Öğütücüyü odaya yerleştirin ve numuneyi ezmek için beş ila on kez tokmak kullanarak vurun. Öğütücüyü odadan çıkarın ve yapışkan doku tozunu ve parçalarını kazıyın.
  4. Dokular erimeye başlarsa odaya bir kaşık sıvı azot ekleyin. Numune büyük doku parçaları olmadan ince bir toz haline gelene kadar pulverizasyon işlemini tekrarlayın. Numuneleri yaklaşık 100 mg alikotlara önceden soğutulmuş tüplere bölün.
  5. % 4 sodyum dodesil sülfat (SDS), 150 mM NaCl ve 25 mM Tris (pH = 7.4) içeren lizis tamponu hazırlayın. Her biri 20x stok için proteaz ve fosfataz inhibitörünün her biri için bir tableti 500 μL suda çözün. Son 1x konsantrasyon için her bir inhibitörün gerekli hacim 20x stoğunu lizis tamponuna ekleyin.
  6. Tüpe 100 mg doku başına 600 μL lizis tamponu ekleyin ve 800 rpm'de çalkalayarak 10 dakika boyunca bir ısıtma bloğunda 95 ° C'de inkübe edin. Numuneleri ısıtma bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
  7. Örnekleri 60 W enerjide (20 kHz) 45 s için 15 s darbeler kullanarak 30 s dinlenme ile sonikleştirin. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 3.000 x g'de toplayın.
  8. Süpernatantı 5x çökeltme çözücüsüne, 300 μL lizis tamponunu, %50 aseton, %49,9 etanol ve %0,1 asetik asit içeren 1,5 mL çökeltme çözücüsüne ekleyin. Gece boyunca -20 °C'de soğutun.
  9. Numuneleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca 3.000 x g'de tekrar pelet edin ve süpernatanı çıkarın. Peleti bir spatula ile parçalayarak ve aynı miktarda çökeltme çözücüsü ile karıştırarak yıkayın. Pelet tekrar, yıkama adımını 2x tekrarlayarak.
  10. Numuneyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 16.000 x g'de pelet edin. Numune peletini bir davlumbazda 15 dakika boyunca hava ile kurutun ve ilerlemeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

2. Protein sindirimi ve tuzdan arındırma

  1. Protein peletini, 50 mM trietilammonyum bikarbonat (TEAB) ve 8 M üre içeren 300 μL taze yapılmış sindirim tamponunda yeniden askıya alın.
  2. Üreticinin protokolüne göre bir protein testi kullanarak çözeltinin protein konsantrasyonunu tahmin edin.
  3. Çözeltideki proteine, 5 mM'lik son konsantrasyona ditiyotreitol (DTT) ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 1 saat azaltın. Daha sonra, karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında 15 mM'lik son konsantrasyona iyodoasetamid (IAA) ekleyin, karıştırın ve alkilat ekleyin. DTT ilavesini öncekiyle aynı hacimde tekrarlayarak alkilasyonu söndürün ve karıştırın.
  4. 1:100 enzim:protein oranında LysC / tripsin ekleyin ve 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, 1 M'< için kullanılan 8 M üreyi seyreltmek için 50 mM TEAB ekleyin 1:100 enzim: protein oranında tripsin ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Trifloroasetik asit (TFA) ilavesiyle% 0.3 v / v'ye kadar sindirimi söndürün. Her 1 mg başlangıç proteini için, 1 mL asetonitril (ACN) ve 1 mL% 0.1 TFA ile 3x içeren bir tuzdan arındırma kartuşu (1 cc, 10 mg) şartlandırın.
  6. Sindirilmiş karışımı tuz alma kartuşuna yükleyin. Karışımı 1 mL% 0.1 TFA kullanarak 3x yıkayın. Elüsyon yavaşsa, pozitif basınç uygulayın, ancak saniyede bir damla > bir akış hızından kaçının.
  7. 1 mL% 60 ACN ve% 0.1 formik asit (FA) çözeltisi kullanan elute peptidler. Çözücü tamamen buharlaşana kadar santrifüjlü bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak yaklaşık 35 ° C'de salınımlı peptitleri kurutun.
  8. Peptitleri 300 μL suda yeniden askıya alın ve üreticinin protokolüne göre bir peptid testi kullanarak peptid konsantrasyonlarını tahmin edin. Peptitleri 500 μg alikotlara bölün ve tamamen kurutun.

3. ERLIC N-glikopeptid zenginleştirme

NOT: Tam santrifüj hızları ve süreleri numunelere göre farklılık gösterebilir ve optimize edilmelidir. Genel olarak, malzemenin şartlandırılması ve yıkanması için 2 dakika boyunca 300 x g ve salınım için 5 dakika boyunca 100 x g uygundur.

  1. Yaklaşık 3 mg pamuk yünü tartın ve boş bir 200 μL pipet ucuna koyun (spin-tip; bkz.
  2. Güçlü anyon değişim zenginleştirme malzemesini bir tüpe aktarın ve 10 mg malzeme başına 200 μL% 0.1 TFA ekleyin. 500 μg peptitlerin zenginleştirilmesi için, 15 mg malzeme kullanın. Malzemeyi 15 dakika sallayarak etkinleştirin.
  3. Bir tüp adaptörü kullanarak, spin-ucunu 2 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin ve uca 15 mg malzeme için yeterli bulamaç ekleyin. Masaüstü santrifüjde döndürerek sıvıyı çıkarın.
  4. 200 μL ACN ile 3 kat santrifüj yaparak malzemeyi koşullandırın. 100 mM amonyum asetat (NH4Ac), %1 TFA ve %80 ACN/%0,1 TFA (yükleme tamponu) kullanarak üçlü koşullandırmayı tekrarlayın.
  5. 500 μg peptid numunelerini yaklaşık 200 μL yükleme tamponunda yeniden askıya alın ve spin ucundan geçirin. Tam bağlama sağlamak için akış akışını 2 kat yeniden yükleyin.
  6. 200 μL %80 ACN/%0,1 TFA kullanarak 5x'i ve ardından %80 ACN/%0,1 FA'lık 200 μL kullanarak 2x'i santrifüj yaparak malzemeyi yıkayın.
  7. Peptitleri, aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile santrifüj yaparak etkisiz hale getirin: %50 ACN/%0,1 FA (E1); %0,1 FA (E2); %0,1 TFA (E3); 300 mM KH2PO4, %10 ACN (E4).
  8. Malzemeyi, 200 μL %80 ACN/%5 NH4OH ile 2 kat santrifüj yaparak yıkayın. Kalan peptitleri 200 μL% 10 NH4OH (E5) ile süzün.
  9. Yaklaşık 35 °C'de santrifüjlü bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tüm salınımları tamamen kurutun.
  10. Üreticinin protokolüne göre bir tuzdan arındırma ucu kullanarak temel elüsyonun (E5) tuzdan arındırılmasını gerçekleştirin.
  11. Tuzdan arındırma ucundan gelen elüsyonu, yaklaşık 35 °C'de bir santrifüjlü vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tamlığa kavuşturun.

4. Ti(IV)-IMAC fosfopeptid zenginleştirme

NOT: Tam santrifüj hızları ve süreleri numunelere göre farklılık gösterebilir ve optimize edilmelidir. Genel olarak, malzemenin şartlandırılması ve yıkanması için 2 dakika boyunca 300 x g ve salınım için 5 dakika boyunca 100 x g uygundur.

  1. Yaklaşık 3 mg pamuk yünü tartın ve boş bir 200 μL pipet ucuna (spin-tip) koyun.
  2. Ti-IMAC fosfopeptid zenginleştirme malzemesini bir tüpe aktarın ve 10 mg malzeme başına 200 μL% 0.1 TFA ekleyin. 500 μg peptitlerin zenginleştirilmesi için 10 mg malzeme kullanın.
  3. Bir tüp adaptörü kullanarak, spin ucunu 2 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin ve uca 10 mg malzeme için yeterli bulamaç ekleyin. Masaüstü santrifüjde döndürerek sıvıyı çıkarın.
  4. Yukarıda açıklandığı gibi aynı santrifüj ayarlarını kullanarak malzemeyi 200 μL %40 ACN/%3 TFA ile koşullandırın. Peptit numunelerini 200 μL'de %40 ACN/%3 TFA'da yeniden askıya alın ve spin ucundan akın. Daha eksiksiz bağlama sağlamak için akışı iki kez yeniden yükleyin.
  5. Malzemeyi 200 μL %50 ACN, %6 TFA ve 200 mM NaCl çözeltisi ile santrifüj yaparak yıkayın, ardından 200 μL'de 2x'i %30 ACN ve %0,1 TFA çözeltisi ile yıkayın.
  6. 200 μL% 10 NH4OH olan elute peptidler. Elüsyonu tamamen vakum altında kurulayın. Üreticinin protokolüne göre bir tuzdan arındırma ucu kullanarak tuzdan arındırma işlemini gerçekleştirin. Tuzdan arındırma ucundaki elüsyonu vakum altında tamlığa kadar kurutun.

5. Çift fonksiyonlu Ti (IV) eşzamanlı zenginleştirme

NOT: Tam santrifüj hızları ve süreleri numunelere göre farklılık gösterebilir ve optimize edilmelidir. Genel olarak, malzemenin şartlandırılması ve yıkanması için 2 dakika boyunca 300 x g ve salınım için 5 dakika boyunca 100 x g uygundur.

  1. Yaklaşık 3 mg pamuk yünü tartın ve boş bir spin-ucu içine paketleyin.
  2. Yaklaşık 1 g Ti(IV)-IMAC malzemesini bir tüpe aktarın. Bilinen bir malzeme konsantrasyonuna, örneğin 20 mg / 200 μL'ye% 0.1 TFA ekleyin (malzeme bu süspansiyonda 4 ° C'de saklanabilir).
  3. 500 μg peptitlerden zenginleştirme için, 20 mg malzeme aktarmak için bir spin ucuna yeterli bulamaç ekleyin. Spin ucunu 200 μL% 0,1 TFA ile santrifüj yaparak yıkayın.
  4. Numuneleri 200 μL yükleme/yıkama çözücüsü (%80 ACN ve %3 TFA) içinde yeniden askıya alın ve sıkma ucundan akın. Akış akışını 2 kat yeniden yükleyin.
  5. Spin ucunu 6x, 200 μL yükleme/yıkama çözücüsü ile santrifüj yaparak yıkayın. Spin ucunu 200 μL %80 ACN/%0,1 FA çözeltisi ile yıkayın.
  6. Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 60 ACN / % 0.1 FA (E1) ve% 40 ACN /% 0.1 FA (E2). Her elüsyonu ayrı ayrı analiz edin.
  7. Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 20 ACN /% 0.1 FA ve% 0.1 FA. İki salınımı birleştirin ve tek bir örnek (E3) olarak analiz edin.
  8. Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 40 ACN / % 3 TFA; %50 ACN/%6 TFA, 200 mM NaCl; ve% 30 ACN / % 0.1 TFA. Bu salınımları birleştirin ve paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırdıktan sonra bir (E4) olarak analiz edin.
  9. 3x için 200 μL %90 ACN/%2,5 NH4OH kullanarak malzemeyi temel pH'a koşullandırın. Bu yıkamaları atın.
  10. Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 60 ACN / % 10 NH 4 OH (E5) ve% 40 ACN / % 10 NH4OH (E6). Paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırmadan sonra bu salınımları ayrı ayrı analiz edin.
  11. Peptitleri aşağıdakilerin her birinden 200 μL ile süzün:% 20 ACN / % 10 NH4OH; %10 ACN/%10 NH4OH; ve% 10 NH4OH. Bu salınımları birleştirin ve paketlenmiş bir uç kullanarak tuzdan arındırdıktan sonra bir (E7) olarak analiz edin.
  12. Tüm salınımları tamamen vakum altında kurutun.

6. Nano akışlı ters fazlı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (nRPLC-MS)

NOT: MS veri toplama ve analiz yöntemleri çeşitlidir ve bu nedenle aşağıdaki adımlarda yalnızca bir önerilen LC-MS işlem hattı (ve ilişkili parametreleri) burada açıklanmaktadır. Daha önce özetlenen numune hazırlama ve zenginleştirme adımları kullanılarak oluşturulan numuneler, yeterli veri kalitesi göz önüne alındığında, ticari olarak temin edilebilen kromatografik sütunların kullanılması da dahil olmak üzere diğer enstrümantal kurulumlar kullanılarak analiz edilebilir.

  1. 19'da açıklandığı gibi C18 malzemesi kullanarak 15 cm uzunluğunda bir kılcal damarı (75 μm iç çap) çekin ve paketleyin. Mobil faz A (suda% 0.1 FA) ve mobil faz B (ACN'de% 0.1 FA) hazırlayın.
  2. Zenginleştirilmiş peptit numunelerini% 3 mobil faz B'nin 15 μL'sinde yeniden oluşturun. numunenin 2 μL'sini (~% 13 numune hacmi) doğrudan kolona yükleyin. Her örneği teknik kopyada analiz edin.
  3. Elute peptidler, 0.3 μL / dak akış hızında 90 dakika boyunca% 3 ila% 30 mobil faz B arasında bir gradyan kullanarak. Kolonu 8 dakika boyunca% 75 B'yi, ardından 8 dakika boyunca% 95 B kullanarak yıkayın, yöntemi 12 dakika boyunca% 3 B'de denge ile bitirin.
  4. Aşağıdaki parametrelerle en üstteki 20 pikin veriye bağlı olarak elde edilmesini kullanarak kütle spektrometresini pozitif iyon modunda çalıştırın: püskürtme voltajı 2 kV; LC/MS'de 120.000 çözünürlükte 400-2.000 m/z'den MS 1 algılama, 2E5 otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi,100 ms maksimum enjeksiyon süresi, %30 RF lens, 1,6 m/z pencereli dörtlü izolasyon, şarj durumları için 2-8 ve belirlenmemiş ve 30 s dinamik dışlama; LC/MS'de MS 2 tespiti, %22, %30 ve %38'de kademeli HCD parçalanması, 30.000 çözünürlükte sabit ilk kütle 120 m/z, 5E4 AGC hedefi ve 2,5E4 minimum yoğunluk gereksinimi kullanılarak tespit edilir.

7. MS veri analizi

NOT: Aynı veri kümesini analiz etmek için iki farklı yazılım kullanan bir veri analizi işlem hattı burada sunulmuştur. Fosforilasyon ve glikozilasyon, burada açıklandığı gibi iki ayrı yazılım yerine tek bir yazılım kullanılarak aynı anda aranabilir, ancak genel olarak, yazılım arama süresi arama alanıyla, yani dikkate alınan PTM sayısıyla orantılıdır. Bu nedenle glikopeptitler ve fosfopeptitlerin aranmasına paralel olarak iki farklı yazılım kullanılmaktadır.

  1. Ham veri dosyalarını uygun yazılımı kullanarak işleyin (bkz.
    1. UniProt insan (veya uygun türe özgü) veritabanına karşı spektrumları arayın. Cys'nin karbamidometilasyonunu sabit bir modifikasyon olarak ayarlayın. Maksimum kaçırılan enzimatik bölünme sayısını iki olarak ayarlayın.
  2. Ham veri dosyalarında, ticari bir yazılım kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu), analiz edilecek glikopeptitleri arayın20. 10 ppm öncü kütle toleransı ve minimum dört kalıntı peptid uzunluğu ile 0.01 Da parça kütle toleransı kullanın.
    1. Yazılıma gömülü N-glikan veritabanını kullanarak arama, HexNAc(2)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(3-4)Hex(4-9)Fosfo(1-2), HexNAc(2)Hex(3-4)Fosfo(1) ve HexNAc(3)Hex(3-4)Fosfo(1) dahil olmak üzere tipik mannoz-6-fosfat(M6P)glikanlarla genişletilmiştir.
    2. N-glikozilasyonu ortak bir modifikasyon olarak ayarlayın. Peptit spektral eşleşmesi (PSM) başına maksimum toplam modifikasyonları bir ortak ve iki nadir olarak ayarlayın.
    3. Aşağıdaki değişken modifikasyonları ayarlayın: Met oksidasyonu (nadir), Asn ve Gln'de deamidasyon (nadir) ve Ser, Thr ve Tyr'da fosforilasyon (ortak). Aşağıdaki tanımlama filtrelerini ayarlayın: skor kesme > 150, |log probu| > 1 ve delta mod skoru 10>.
    4. Arama sonuçlarını Proteinler ve Peptit Grubu sekmelerinde dışa aktarın ve analiz edin.
    5. M6P glikanları içeren tanımlamaları, MS / MS spektrumlarında FosfoHex oksonyum iyonunun (243 m / z) varlığı açısından manuel olarak tarayın ve bu tanısal iyonu içermeyen yanlış pozitif tanımlamaları kaldırın.
  3. Ham veri dosyalarında, açık kaynaklı bir yazılım kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), analiz edilecek fosfopeptitleri arayın21. 20 ppm ilk arama peptid toleransı ve 4.5 ppm ana arama peptid toleransı kullanın.
    1. Peptit başına maksimum değişiklik sayısını 5 olarak ayarlayın. PSM ve protein yanlış keşif oranını (FDR) %1'e ve minimum peptid uzunluğunu 7 kalıntıya ayarlayın.
    2. Met'te oksidasyon, N-terminal protein asetilasyonu ve Ser, Thr ve Tyr'da fosforilasyon olarak değişken modifikasyonlar ayarlayın. modificationSpecificPeptides dosyalarını kullanarak arama sonuçlarını analiz edin.
  4. PTM'lerin protein, peptit ve modifikasyon bölgesi seviyelerindeki tanımlama sayısını belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ham dosyalar ve arama sonuçları da dahil olmak üzere temsili kütle spektrometresi verileri, PXD03306522 veri kümesi tanımlayıcısı ile PRIDE iş ortağı deposu aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumu'na yatırılmıştır.

Bu çalışmada, her zenginleştirme elüsyonu için çift enjeksiyon replikaları analiz edilmiştir. Her iki teknik replikasyondan yapılan tanımlamalar son analizde harmanlanmıştır. MS / MS parçalanması için peptid öncüllerinin toplanmasında veriye bağıml...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çift fonksiyonlu Ti(IV)-IMAC stratejisi, tek bir numune hazırlama iş akışında aynı numuneden N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için kullanışlıdır. ERLIC tabanlı yöntemlerin PTM'lerin eşzamanlı zenginleştirilmesini de sağladığı gösterilmiştir. Her iki strateji de daha önce PTM analizlerinde derin kapsama alanı için kullanılmış14,18. İkili Ti yöntemini, spin uçlarını kullanarak numune inkübasyon süresini azaltmaya uyarlarken, bu protokolün daha...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma kısmen NIH'den (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 ve R21AG065728) ve Çocuk Diyabet Araştırma Vakfı'ndan (1-PNF-2016-250-S-B ve SRA-2016-168-S-B) hibe fonu ile desteklenmiştir. Burada sunulan veriler kısmen Wisconsin Üniversitesi Klinik ve Translasyonel Araştırma Enstitüsü aracılığıyla bir NIH / NCATS UL1TR002373 ödülünün desteğiyle elde edilmiştir. Orbitrap enstrümanları, NIH paylaşımlı enstrüman hibesi (NIH-NCRR S10RR029531) ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Araştırma ve Lisansüstü Eğitim Rektör Yardımcısı Ofisi desteği ile satın alındı. Ayrıca, araştırma için insan pankreası sağlayan Wisconsin Üniversitesi Organ ve Doku Bağışı Organizasyonu'nun cömert desteğine ve örnekleri laboratuvarımıza sağlamak için Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett ve Prof. Jon Odorico'nun yardımına teşekkür ederiz. Araştırma ekibimiz bu çalışma için doku bağışında bulunan ailelere özel teşekkürlerini sunar. L.L., Wisconsin Üniversitesi Karkemik Kanser Merkezi'nden (233-AAI9632) bir Pankreas Kanseri Pilot hibesi olan NIH hibesi S10OD025084'ün yanı sıra Wisconsin Mezunları Araştırma Vakfı ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Eczacılık Fakültesi tarafından sağlanan fonla Vilas Seçkin Başarı Profesörlüğü ve Charles Melbourne Johnson Seçkin Kürsü Profesörlüğünü kabul etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik Asit, Buzul (Sertifikalı ACS)Fisher ScientificA38S-500
Aseton (Sertifikalı ACS)Fisher ScientificA18-1
Asetonitril, Optima LC/MS SınıfıFisher ScientificA955-4
Amonyum Asetat (Kristal/Sertifikalı ACS)Fisher ScientificA637-500
Amonyum Hidroksit (Sertifikalı ACS Plus)Fisher ScientificA669-212
Byonic yazılımıProtein Metricsn/aGlikoproteomik analiz için kullanılan ticari yazılım (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH malzemesiSular186002353Kolondan çıkarılan ve nano kılcal damarları paketlemek için kullanılan malzeme (doğrudan cihaz girişi ile aynı hizada kullanılan ucu entegre etmek için çekilir)
CAE-Ti-IMAC, %100J& K Scientific2749380-1GÇift işlevli Ti(IV)-IMAC için kullanılan malzeme; konvansiyonel IMAC/konvansiyonel fosfopeptit zenginleştirme için de kullanılabilir
Hücre kırıcı kitiHücre kırıcın/aEkstraksiyondan önce doku numunelerini toz haline getirmek için kullanılır
Eppendorf 5424R MikrosantrifüjFisher Scientific05-401-205Sıcaklık kontrollü santrifüj için
cOmplete proteaz inhibitörü kokteyl tabletleriSigma11697498001
DTT, Moleküler Sınıf (DL-Dithiothreitol)PromegaV3151Protein indirgeyici ajan
Etanol, 200 kanıt (% 100), USPFisher22-032-601
Fisherbrand Analog Vorteks KarıştırıcıFisher Scientific02-215-414
Fisherbrand Düşük Tutmalı Mikrosantrifüj Tüpleri (1.5 mL)Fisher Scientific02-681-320
Fisherbrand Düşük Tutma Mikrosantrifüj Tüpleri (2 mL)Fisher Scientific02-681-321
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110Ultrasonication kullanarak numune lizisi için
Formik Asit, 99.0 +%, Optima LC / MS SınıfıFisher ScientificA117-50
Erimiş silika kılcal damar (75 μ m iç çap, 360 μ m dış çap)Polymicro Technologies LLC100 m TSP075375Entegre emitörlü şirket içi çekilmiş ve paketlenmiş kolonlar için
Hidroflorik asit (H2O'da ağırlıkça %48Sigma-Aldrich339261-100MLÇekilen kılcal kolonun yayıcısını açmak için kullanılır
İyodoasetamid, BioUltraSigmaI1149-5GProtein azaltıcı reaktif
MaxQuant yazılımın/an/aFosfoproteomik analiz için kullanılan ücretsiz yazılım (https://www.maxquant.org/)
Isıtma ve soğutmalı Multi-therm ShakerBenchmark ScientificH5000-HCIsıtma bloğu
Oasis HLB 1 cc Vac Kartuş, Kartuş başına 10 mg Sorbent, 30 & m, 100/pkWaters186000383Triptik çürütmeler için daha büyük ölçekli kartuş tuzdan arındırma (her biri yaklaşık 1 mg'a kadar yükleme kapasitesi)
OMIX C18 pipet uçları, 100 ve mikro; L uç, 10 - 100 μ L elüsyon hacmi, 1 x 96 uçAgilentA57003100Zenginleştirme elutions için tuzdan arındırma için daha küçük ölçekli paketlenmiş pipet ucu
P-2000 Mikropipet ÇektirmeSutter Instrument Co.P-2000/F:için nano-kılcal kolonları çekmek için
Sigma4906845001
Pierce BCA Protein Test KitiThermo Fisher Scientific23225
Pierce Kantitatif Kolorimetrik Peptit TestiThermo Fisher Scientific23275
PolySAX LP (12 μ m, gözenek boyutu 300 å)PolyLCBMSX1203ERLIC/konvansiyonel glikopeptid zenginleştirmesi için kullanılan güçlü anyon değişim kromatografisi için malzeme
Potasyum Fosfat Monobazik (Kristal/Sertifikalı ACS)Fisher ScientificP285-500
Entegre manyetik karıştırma plakalı basınçlı enjeksiyon hücresiNext AdvancePC77-MAG2500 psi sınırına
kadar sabit fazlı nano kılcal kolonları paketlemek içinProteome Discoverer yazılımıThermo Fisher Scientificn/aProteomik analizi (entegre veritabanı arama yazılımı düğümleri ile) ve veri görselleştirme (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) için ticari yazılım
SpeedVac SC110 Vakum Konsantratörü Model SC110-120Numunelerin/aSantrifüj vakum konsantratörü (ısı altında)
SDS Çözeltisi, %10 Sodyum Dodesil Sülfat Çözeltisi, Moleküler Biyoloji/ElektroforezFisher ScientificBP2436200
Sıralama Sınıfı Modifiye TripsinPromegaV5111
Sodyum Klorür (Kristal/Sertifikalı ACS)Fisher ScientificS271-500
TopTip, Boş, 10-200 & L, 96 PaketiGlygen CorporationTT2EMT.96Zenginleştirmeler için kromatografik malzemeleri paketlemek için kullanılabilecek mikron boyutunda delikli boş pipet ucu, tüp adaptörleri ile birlikte
Trietilamonyum bikarbonat tamponu (TEAB, 1 M, pH 8.5 (uçucu))Sigma90360-100ML
Trifloroasetik asit, Reaktif Sınıfı, %99Fisher Scientific60-017-61
Tris Baz (Beyaz Kristaller veya Kristal Toz/Moleküler Biyoloji)Fisher ScientificBP152-500
Tripsin/Lys-C Karışımı, Kütle Spesifikasyon SınıfıPromegaV5071
Üre (Sertifikalı ACS)Fisher ScientificU15-500
Su, Optima LC/MS SınıfıFisher ScientificW64
) LC-MS PhosSTOP fosfataz inhibitör tabletleri kurutmak için Savant

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
  2. Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
  3. Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387(2021).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
  5. Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029(2020).
  7. Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
  8. Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
  9. Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
  10. Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
  11. Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
  12. Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
  13. Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
  14. Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
  15. Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
  16. Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
  17. Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
  18. Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
  19. Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380(2021).
  20. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
  21. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  22. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
  23. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).
  24. Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
  25. Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
  26. Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
  27. Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438(2017).
  28. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  29. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010(2021).
  30. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
  31. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129(2021).
  32. Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N Glikopeptid Zenginle tirmeFosfopeptid Zenginle tirmeSpin Tip Y ntemiTitanyum IMACK tle SpektrometrisiPankreas DokusuPost Translasyonel ModifikasyonlarGlikozilasyon FosforilasyonProtein SindirimiBiyobelirte Ke fi

İlgili makaleler