Memeli beynindeki uyarıcı sinapslarda, presinaptik olarak salınan glutamat, postsinaptik membran 1,2'ye gömülü reseptörleri aktive eder. Bu sinaptik bağlantıların gücü, çeşitli öğrenme ve hafıza biçimlerine izin veren bir özellik olan deneyime bağlı plastisiteye uğrar 3,4,5,6,7,8,9. Sinaps sayılarındaki ve sinyal özelliklerindeki patolojik değişiklikler, çok sayıda nörolojik ve psikiyatrik bozuklukta 10,11,12 görüntülenen değişmiş devre aktivitesine ve bilgi işlemeye yol açar. Bu nedenle, sinirsel bağlantıyı ve sinaptik bağlantıların gücünü yöneten altta yatan mekanizmaları anlamak için kritik bir ihtiyaç vardır.
Uyarıcı sinapslar, dendritik dikenlerde, iskele proteinleri, reseptörler, sinyal faktörleri, hücre iskeleti proteinleri ve kaçakçılık organelleri 1,2,13,14,15,16 içeren küçük postsinaptik çıkıntılar üzerinde oluşur. Bu mikron boyutundaki sinyal bölmeleri, sinaps bazında sinaps bazında sinaptik gücün kontrolüne izin verir13,16. Dendritik omurga morfolojisi, nöronal dendritlerin uzunluğu boyunca değişir ve omurga şekilleri tipik olarak ince, filopodial, güdük, mantar veya dallı13 olarak tanımlanır. Daha da önemlisi, omurga şekli sinaptik fonksiyon ve stabilite ile ilişkilidir. Örneğin, daha büyük dikenler artan sayıda reseptöre ve daha fazla sinaptik güce sahiptir 16,17,18. İnce dikenlerin aksine, daha büyük dikenler in vivo olarak aylarca kalabilir, bu da kararlı sinaptik bağlantılara ve uzun süreli bellek depolamaya izin verebilecek bir özelliktir19,20.
Bir dendrit boyunca omurga morfolojisi ve yoğunluğu, hem normal hem de hastalık durumlarında belirli bir beyin bölgesindeki nöral bağlantı derecesini ve uyarıcı sinapsların özelliklerini araştırmak için yaygın olarak izlenir13. Standart ışık ve floresan mikroskobunun yanı sıra süper çözünürlüklü ve elektron mikroskobu (EM)21 kullanılarak farklı doku preparatlarında ve model sistemlerinde omurga morfolojisini görselleştirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu güçlü görüntüleme teknikleri, beyin organizasyonu, işlevi ve hastalığı hakkındaki mevcut anlayışımız hakkında muazzam bir fikir vermiştir. Bu yöntem koleksiyonu, dendritlerin ve dikenlerin morfolojik karmaşıklığını izlemek için önemli görüntüleme tekniklerinin yanı sıra dendritlerde ve tek dikenlerde nöral aktiviteyi aktive etmek ve ölçmek için optogenetik araçları içerir.
Pekarek ve ark.22 , sağlam sinir dokusunun derinliklerindeki nöronal dendritlerin yapısını görüntülemek ve ölçmek için nispeten hızlı, yüksek verimli bir protokol sunmaktadır. Yazarlar, lipitleri beyin dokusundan uzaklaştıran ve sonraki görüntüleme sırasında ışık saçılımını en aza indirmeye yardımcı olan bir doku temizleme tekniği olan Clear Lipid ile değiştirilmiş Akrilamid-hibritleştirilmiş Rigid Imaging/immün boyama/in situ hibridizasyon uyumlu Tissue-hYdrogel (CLARITY) gerçekleştirirler23. Temizlendikten sonra, floresan proteinleri eksprese eden nöronların Z-yığınları, konfokal veya iki foton mikroskobu ile toplandı. Görüntü analizi ve otomatik niceleme, omurga yoğunluğu ve şeklinin yanı sıra dendritik ağaç karmaşıklığının hassas ölçümlerine olanak sağladı. Bu protokol, tek dikenlerden dendritik ağaçlara kadar değişen yapıların aynı anda görüntülenmesine olanak tanır ve ince kesitli kesimin zaman alıcı ve potansiyel olarak zarar verici adımını ortadan kaldırır. Bu teknik, ilgilenilen gen(ler)in eklenmesini veya çıkarılmasını takiben omurga morfolojisindeki değişiklikleri ve bozulmamış beyin dokularındaki dendritik karmaşıklığı ölçmek isteyen araştırmacılar için oldukça yararlı olacaktır.
100 yılı aşkın bir süre öncegeliştirilen 24 Golgi boyama, sinir sistemi organizasyonunu ve nöronal morfolojiyi görselleştirmek için güçlü bir araç olmaya devam ediyor. Bu yöntemde, seyrek nöron popülasyonları, gümüş kromatın mikrokristalizasyonu ile boyanır ve aksonların, dendritik ağaçların ve dikenlerin25 görselleştirilmesine izin verir. Frankfurt ve Bowman26 , sıçan hipokampusu ve medial prefrontal korteksteki nöronları ve dendritik dikenleri görselleştirmek için hızlı bir Golgi emprenye protokolünü detaylandırıyor. Yazarlar, sonraki ışık mikroskobu için dokunun nasıl hazırlanacağını, boyanacağını ve görüntüleneceğini ve ayrıca dendritik ağaçlar boyunca omurga yoğunluğunun nasıl ölçüleceğini gösterir. Burada açıklanan protokol, nöronların tutarlı, güvenilir bir şekilde emprenye edilmesini sağlar ve toksik kimyasallara maruz kalmayı azaltır.
Işık ve floresan mikroskobu, dendritleri ve dikenleri görüntülemek için çok uygun olsa da, EM, sinaptik öncesi ve sonrası yapıların nanometre çözünürlüğünde görselleştirilmesine izin verir21. EM yaklaşımları tipik olarak, postsinaptik yoğunluğun boyutları ve ayrıca sinaptik veziküllerin21 sayıları ve boyutu dahil olmak üzere sinapsların ultrastrüktürel özelliklerini ölçmek için kullanılır. Bu koleksiyonda, Śliwińska ve ark.27, hipokampal fare dokusunda Serial Bkilit yüz taraması Electron Mikroskopisi (SBEM) ile üç boyutlu (3D) EM görüntüleri elde etmek için bir protokol sağlar28,29. Spesifik olarak, numunelerin nasıl hazırlanacağını, dokunun reçineye nasıl gömüleceğini, numunelerin nasıl monte edileceğini ve kırpılacağını, SBEM'in nasıl gerçekleştirileceğini ve 3D rekonstrüksiyonlar oluşturmak için görüntülerin nasıl analiz edileceğini açıklarlar. Bu protokol, iyi tanımlanmış membranlarla yüksek kontrastlı görüntüler üretir ve çeşitli doku tiplerine uyarlanabilir.
Sinir sisteminin gelişimi sırasında, sinaptik bağlantılar nöral aktivite30,31 tarafından oluşturulup rafine edildiğinden, nöronlar dramatik morfolojik değişikliklere uğrar. Gelişmekte olan serebellumdaki nöronal olgunlaşmayı izlemek için Chan ve ark.32, gelişmekte olan granül nöronların in vivo postnatal elektroporasyonu için bir protokol sağlamıştır. Burada araştırmacılar, seyrek bir nöron popülasyonunu floresan proteinlerle transfekte etmek için doğum sonrası fare yavrularının arka beynine DNA enjekte etti ve elektroporasyon yaptı. Yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ve 3D görüntüleme, araştırmacıların doğum sonrası gelişimin çeşitli aşamalarında dendritlerin ve dendritik pençelerin morfolojisini karakterize etmelerine olanak sağladı. Daha da önemlisi, bu yaklaşım, granül hücre olgunlaşmasını ve işlevini etkileyebilecek genlerin eklenmesine veya çıkarılmasına izin verebilir ve serebellar gelişim ve granül nöron olgunlaşmasını inceleyen araştırmacıların büyük ilgisini çekecektir.
Son olarak, Cuentas-Condori ve Miller33'ün protokolleri, nematoddaki GABAerjik nöronların aktivitesini incelemek için süper çözünürlüklü görüntüleme34, optogenetik35 ve kalsiyum dinamiklerinin36 canlı hücre görüntülemesini kullanır. Yazarlar, süper çözünürlüklü görüntüleme37 için donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak, farklı omurga şekillerinin sıklığını ölçmek için dendritlerdeki floresan proteinleri eksprese ederler. Ayrıca, yazarlar nöral fonksiyonu bir optogenetik proteinin presinaptik olarak ekspresyonu ve postsinaptik olarak bir kalsiyum göstergesinin ekspresyonu ile değerlendirirler. Terminallerin ışık aktivasyonunu takiben, bireysel dendritik dikenler içinde kalsiyum geçişleri gözlendi. Bu protokoller, son bulgular38 ile birlikte, C. elegans'ın omurga morfolojisini ve sinaptik aktiviteyi izlemek için güçlü bir model sistem olarak heyecan verici kullanımını vurgulamaktadır.
Birlikte ele alındığında, bu yöntem koleksiyonunda açıklanan protokoller, nöral yapıyı ve işlevi21 görselleştirmek için zaten zengin olan araç kutusuna eklenecektir. Bu yöntemlerin gelecekteki çalışmalarda uygulanması, muhtemelen öğrenmeyle ilgili sinaptik plastisiteyi yönlendiren süreçler ve hastalık durumlarının altında yatan hücresel mekanizmalar hakkında ek bilgiler sağlayacaktır.