Yöntem makalesi

İnsan Nöromüsküler Kavşağının Optogenetik Modelinin Mühendisliği ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/63759

⸱

14 Nisan 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Medicine, Columbia University, 3Gladstone Institutes, 4College of Dental Medicine, Columbia University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan mühendisliği iskelet kası dokusu ve optogenetik motonöronlar kullanarak nöromüsküler kavşak fonksiyonunu karakterize etmek için tekrarlanabilir, otomatik ve tarafsız bir görüntüleme sistemi tanımladık. Bu sistem, zaman içinde nöromüsküler bağlantının fonksiyonel olarak ölçülmesine izin verir ve nörotoksinlerin ve myastenia gravis hasta serumunun neden olduğu azalmış nöromüsküler fonksiyonu tespit eder.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myastenia gravis (MG) gibi birçok nöromüsküler hastalık, hayvanlar ve insanlar arasındaki fizyolojik farklılıklar nedeniyle hayvan modellerinde karakterize edilmesi zor olan nöromüsküler kavşağın (NMJ) işlev bozukluğu ile ilişkilidir. Doku mühendisliği, NMJ patolojilerini teşhis etmek ve araştırmak ve potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek fonksiyonel insan NMJ'lerinin in vitro modellerini sağlama fırsatları sunar. Optogenetik proteinleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) dahil ederek, ışığın belirli dalga boylarıyla uyarılabilen nöronlar ürettik. NMJ sağlıklı ve işlevsel ise, motonörondan gelen nörokimyasal bir sinyal kas kasılmasıyla sonuçlanır. Optogenetik ve mikrofabrikasyonun doku mühendisliği ile entegrasyonu sayesinde, video analizi kullanarak NMJ fonksiyonunu karakterize etmek için tarafsız ve otomatik bir metodoloji oluşturduk. NMJ oluşumu, eşzamanlı video kaydı ile optik stimülasyon ve doku kontraktilitesinin video analizi için standartlaştırılmış bir protokol geliştirilmiştir. İskelet kası kasılmalarını indüklemek için optogenetik motonöronların ışıkla uyarılması, insan NMJ fizyolojisini özetler ve zaman içinde ve çeşitli girdilere yanıt olarak NMJ'nin tekrarlanan fonksiyonel ölçümlerine izin verir. Bu platformun zaman içinde nöromüsküler bağlantıda fonksiyonel iyileşmeler gösterme yeteneğini gösteriyoruz ve hasta MG antikorlarının veya nörotoksinlerin NMJ fonksiyonu üzerindeki zararlı etkilerini karakterize ediyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöromüsküler kavşak (NMJ), kas kasılmasına izin veren motonöronlar (MN'ler) ve iskelet kası hücreleri (SkM) arasındaki kimyasal sinapstır. Nörotoksin α-bungarotoksin (BTX) gibi toksinler veya myastenia gravis (MG) gibi nöromüsküler hastalıklar (NMD) NMJ'nin dejenerasyonuna ve kas kontrolünde azalmaya neden olabilir1. Biyomühendislik ürünü insan doku modelleri, insan NMJ'lerinin fonksiyonel ve fizyolojik mekanizmalarını daha iyi özetler ve hayvan modellerinden daha fazla translasyonel potansiyel sunar.

Hayvan modelleri, NMJ'nin oluşumu ve işlevinin anlaşılmasını ilerletirken, insan ve hayvan sinapsları arasında, sonuçların insanlara çevirisini sınırlayan ve NMJ'nin in vivo karakterizasyonunuzorlaştıran önemli farklılıklar vardır. 2,3,4. Fareler, insan NMJ'leri4 ile karşılaştırıldığında daha büyük NMJ'lere ve daha küçük aktif bölge yoğunluklarına sahiptir. Ek olarak, hayvan modellerinde yapılan ilaç çalışmaları her zaman insan klinik çalışmalarında bulunan etkileri yansıtmamaktadır. Tasarlanmış insan doku modelleri, NMJ'nin sağlıklı gelişimini ve nöromüsküler hastalıkların patolojisini inceleme fırsatı sunar ve ilaç taramalarına izin verir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler)5, iskelet kası hücreleri6,7 ve motonöronlar 8,9 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine ayrılabilir. hiPSC'ler hasta hücrelerinden kolayca üretilebilir, bu da hastaya özgü doku modelleri aracılığıyla daha iyi hastalıkmodellemesi 10 ve ilaç taraması 11,12 sağlar.

SkM'lerin ve MN'lerin iki boyutlu (2B) tek katmanlı ortak kültürleri, fizyolojik NMJ'lerin morfolojisi, fenotipi, organizasyonu ve fonksiyonel davranışından yoksundur. NMJ'ler, analiz için motor birimlerin izolasyonunu engelleyen, doğru fonksiyonel ölçümleri sınırlayan ve tekrarlanan, sistematik deneyler için kullanımlarını önleyen 2D kültürde rastgeleoluşur13 . NMJ'lerin üç boyutlu (3D) doku modelleri, fizyolojik NMJ'lerin 7,14,15,16,17'nin morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini özetleyerek bu sınırlamaların çoğunun üstesinden gelir. Bu modeli kullanarak, iki doku tipi ayrı ayrı geliştirilir ve daha sonra aksonal büyümeyi yönlendirerek entegre edilir ve 2D kültür sistemlerine kıyasla daha organize NMJ'lerin gelişmesine izin verilir.

Önceki çalışmamız, optogenetiğin doku mühendisliği ile birleştirilmesinin doğru non-invaziv stimülasyona ve NMJ fonksiyonunun değerlendirilmesine izin verebileceğini göstermiştir18,19. Genetik mühendisliği sayesinde, ışığa duyarlı proteinler hiPSC'lerin genomuna entegre edilebilir. Mavi ışığa tepki olarak açılan bir iyon kanalı olan channelrhodopsin-2'yi (ChR2), nöronlar gibi uyarılabilir hücrelerin zarına entegre etmek, hücre aktivasyonu20,21,22 üzerinde temassız mekansal zamansal kontrol sağlar. ChR2 taşıyan hiPSC'ler, mavi ışığa duyarlı optogenetik motonöronlara ayrılabilir, nöronları uyaran tipik invaziv elektrotlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve kas hücrelerinin elektrotlar tarafından istenmeyen şekilde uyarılmasını önler23. Bu sistem, optogenetik olmayan iskelet kası hücrelerinde kasılmaları uyarmak için optogenetik motonöronları kullanır. Video yakalama ve kontrollü mavi ışık aydınlatmasını birleştirmek, ko-kültürlü dokuların aynı anda uyarılmasını ve NMJ işlevi için kaydedilmesini sağlar.

MG, nikotinik asetilkolin reseptörlerini (AChR) hedef alan otoantikorlardan kaynaklanır ve bu da NMJ fonksiyonunun azalmasına ve kas güçsüzlüğüne neden olur24. Sunulan semptomlara, elektro tanıya ve serolojik kan testleri ile otoantikorların saptanmasına dayanarak teşhis edilir. Bununla birlikte, MG'de rol oynayan tüm otoantikorlar tanımlanmamıştır ve bazı seronegatif hastalara MG tanısı konmuştur, ancak tanınmış antikorları yoktur25,26. Sistemimiz, MG hastalarından serum eklenmesinden önce ve sonra NMJ'nin tekrarlanan fonksiyonel değerlendirmesine izin vererek, MG antikorlarının neden olduğu fonksiyonel ve biyokimyasal değişiklikler hakkında paha biçilmez bir fikir verir18. Protokolümüz, NMJ patolojilerini teşhis etmek ve araştırmak ve potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek fonksiyonel insan NMJ'nin 3D in vitro modellerinin nasıl üretileceğini göstermektedir. Sistemin çok yönlülüğünü iki platformda, bir mikroakışkan cihazda ve daha büyük bir açık kuyulu biyoreaktör platformunda gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için tüm hücre hatları, Columbia Üniversitesi, NY, ABD'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak oluşturulmuş ve kullanılmıştır.

1. Biyoreaktör hazırlığı

  1. Biyoreaktör kalıpları yapın
    1. Ek CAD Dosyasından bir biyoreaktör CAD dosyası indirin veya özel bir tasarım oluşturun.
    2. CAM yazılımını kullanarak 3B modelden bir CNC takım yolu oluşturun.
    3. CNC freze makinesi kullanarak asetal kalıpları işleyin.
  2. Biyoreaktörlerin imalatı
    1. Polidimetilsiloksanın kürleyici ajan karışımına 10: 1'lik bir baz karıştırın (PDMS, 4 platform / kalıp başına 77 g karışım).
    2. Karışımı bir vakum odasına yerleştirin, tüm vanaları kapatın, vakumu açın ve hava kabarcıkları kalmayana kadar karışımı en az 30 dakika boyunca gazdan arındırın. Karışımı kalıplara dökün ve kalıpları vakum odasında 1 saat boyunca gazdan arındırın.
    3. Kalıpları, kalıbın üst yarısı doğru yönde olacak şekilde kapatın. Merkeze çelik altıgen bir çubuk yerleştirin ve her iki tarafa da kelepçeleyin.
    4. Üst kısmı PDMS ile doldurun.
    5. Kalıpları 65 °C fırında en az 4 saat kürleyin.
    6. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra platformları kalıplardan çıkarın.
    7. Ultrasonik bir banyodaki cihazları 1 saatlik bulaşık sabunu döngüsü, 400 mL% 100 izopropanol ve damıtılmış su kullanarak temizleyin.
    8. 65 °C'de gece boyunca kurutun.
    9. Cam kapakları 30 dakika boyunca% 1 iyonik olmayan yüzey aktif madde polyoluna batırın ve örtülerin istiflenmediğinden emin olun, böylece hepsi düzgün bir şekilde kaplanır.
    10. Damıtılmış suyla iyice durulayın ve 65 ° C'de gece kurutun.
    11. Tedavi cam kapaklarına ve PDMS platformuna 1-2 dakika boyunca 6 L / dak oksijen içeren yüksek bir plazma temizleyici kullanın. Tedavi edildikten sonra, PDMS'yi en az 30 saniye boyunca kapak kapağına bastırarak ikisini birbirine bağlayın.
    12. Hücre eklemeden önce bağlı cihazları otoklav yapın.

2. Optik stimülasyon kurulumu oluşturma

  1. 30 mm'lik bir kafes küp sistemi kullanarak, merkeze 573 nm dikroik ayna takın. Kırmızı bir 627 nm LED'i 594 nm uzun geçişli uyarma filtresi ile birleştirin ve LED aynaya bakacak şekilde küpün üst tarafına takın. Ardından, küpün bitişik tarafına 546 nm kısa geçişli uyarma filtreli mavi bir 488 nm LED takın ve LED, Şekil 3A'daki şemada gösterildiği gibi aynaya bakar.
  2. Aydınlatılmış alanın boyutunu kontrol etmek için kafes küpünün altına halka tahrikli bir iris diyaframı takın.
  3. Her LED'e bir T-Cube LED sürücüsü ile güç verin ve bir Arduino Uno Rev3 kartı ile kontrol edin. LED sürücüsünün yan girişini bir güç kaynağı fişine bağlayın, orta çıkışı Arduino'ya bağlayın ve yan çıkışı doğrudan LED'lere bağlayın.
  4. Arduino Uno'yu bir USB kablosuyla bir PC'ye bağlayın.
  5. GitHub bağlantısından dosya indirin (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. GitHub klasöründen "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" dosyasını açın.
  7. Başlangıç parametrelerini ayarlayın: Adımlar = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
  8. Pin çıkışı 4'ün Mavi LED sürücüsüne, pin çıkışının 2'nin Kırmızı LED sürücüsüne atandığından emin olun. LED sürücüsünün orta kablolarının toprağa ve ilgili pim çıkışına bağlı olduğunu kontrol edin.
  9. "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" programını Arduino'ya derleyin ve yükleyin.
  10. Her LED sürücüsünü karşılık gelen kanala bağlayın.

3. Hücre kültürü kurulumu (gün -21-0)

  1. Birincil iskelet kası hücreleri
    1. Miyotonik büyüme ortamı (+ takviyesi) kullanılarak maksimum altı pasaj için birincil iskelet miyoblastlarını (Cook Miyozit'ten elde edilen) çözün ve genişletin. Hücreleri 37 ° C'ye ve% 5 CO2'ye ayarlanmış bir inkübatörde tutun.
    2. Medyayı her 2 günde bir değiştirin.
    3. Hücreler yaklaşık% 60 birleştiğinde,% 0.05 Tripsin-EDTA (1x, 37 ° C'de 5 dakika boyunca) kullanarak bunları geçirin. Ayrışmış hücreleri toplayın ve tripsini nötralize etmek için taze medya ekleyin.
    4. Hücreleri 300 x g'da döndürün ve süpernatantı hücre peletinin üzerine aspire edin.
    5. MGM ve tohum 1: 3 ile hücreleri üç katmanlı şişe başına 60 mL ile yeniden askıya alın.
  2. ChR2-hiPSC
    NOT: Bu çalışma için tüm hücre hatları, Columbia Üniversitesi, NY, ABD'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak oluşturulmuş ve kullanılmıştır. Bu protokolde, ChR2 eksprese eden hiPSC'ler, daha önce tarif edilen yöntemler18 kullanılarak CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi yoluyla üretildi, ancak herhangi bir kararlı optogenetik hücre hattı (lentiviral, piggyBac, vb.) aynı şekilde kullanılabilir. Hem iPSC'lerde hem de motonöronlarda eksprese edilen kurucu promotörler seçildi (CAG). Hücrelerin, önceki yayınlarda belirtildiği gibi sağlıklı karyotipe sahip olduğu bulundu18,19.
    1. 6 delikli plakaları DMEM/F12'de (1:80) seyreltilmiş 1 mL/kuyucuk çözünür bazal membran matrisi ile kaplayın ve plakaları oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    2. 2 mL besleyicisiz hücre kültürü ortamına (iPSC medya) sahip kaplamalı 6 delikli plakalar üzerinde tohum iPSC'leri, her gün 2 mL ortam alışverişi yapar ve her 5-7 günde bir geçer. Hücreleri 37 ° C'ye ve% 5 CO 2'ye ayarlanmış bir inkübatörde tutun.
    3. Pasaj
      1. 1 mL enzimsiz kök hücre salgılayıcı reaktif ile 4 dakika boyunca inkübe ederek ve geniş uçlu P1000 pipetle mekanik olarak keserek kök hücreleri ayırın.
      2. Kaplanmış 6 delikli plakalar üzerine 2 mL/kuyucuk içinde 2 μM Y-27632 dihidroklorür ile iPSC ortamında 1:24 veya 1:48 oranında tohum hücreleri.

4. İskelet kası dokusu tohumlaması (gün -3)

  1. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak 30 x 106 miyoblastı izole edin ve sayın.
  2. Miyoblastları 4:1 karışım 3 mg/mL kollajen I ve çözünür bazal membran matrisinde (800 μL kollajen karışımı + 200 μL bazal membran matrisi 1 mL'lik son hacme ulaşmak için) yeniden askıya alın. Kollajen bileşeni için, beraberindeki nötralize edici maddeyi (nötralize edici maddeye 9: 1 kollajen karışımı) ekleyin ve 800 μL'lik bir hacim elde etmek için karışımı 1x PBS ile seyreltin.
  3. Biyoreaktörün her kas odasına 15 μL hücre-kollajen süspansiyonu ekleyin ve pipet ucunu kullanarak süspansiyonu her iki direğe de yaydığınızdan emin olun (Şekil 2).
  4. Hücre-jel karışımının 30 dakika boyunca 37 ° C'de polimerize olmasına izin verin ve ardından her bir biyoreaktörü 450 μL Miyotonik büyüme ortamı ile iyice doldurun.
  5. 3 gün sonra (jel sıkıştırıldıktan sonra), miyotüp farklılaşmasına başlayın.

5. Miyotüp farklılaşması (gün 0-14)

  1. Dokuları 7 gün boyunca 450 μL füzyon indükleyici ortama (FS, Tablo 1) geçirerek ve medyayı her geçen gün değiştirerek miyotüp infüzyonuna başlayın.
    NOT: Her iki hücre tipinin farklılaşma programlarının sonunda motonöronları tohumlamak için hiPSC'lerden motonöron farklılaşması ile aynı gün miyotüp farklılaşmasına başlamaya çalışın.
  2. 7. günde ortamı 450 μL olgunlaşma ortamı Ia olarak değiştirin (MMIa, Tablo 1).
  3. 9. günde, 450 μL olgunlaşma ortamı Ib olarak değiştirin (MMIb, Tablo 1).
  4. 11. günde, medyayı 450 μL NbActiv4 olarak değiştirin. Motonöronlar tohumlanana kadar her 2 günde bir medyayı değiştirmeye devam edin (Adım 7).

6. Motonöron farklılaşması (gün 0-14)

NOT: Motonöron farklılaşma protokolümüz Maury ve ark.8'den uyarlanmıştır.

  1. 0. günde, 4 x 106 ChR2- hiPSC'leri, 15 mL motonöron süspansiyon kültürü ortamına sahip ultra düşük bağlantılı bir Petri kabına aktarın (MSCM, Tablo 1). 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrat ve 5 μM Y-27632 dihidroklorür ile MSCM takviyesi.
  2. 2. günde, nörosferleri (NS) 37 μM geri dönüşümlü süzgeç ile izole edin ve 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrat ve 0.1 μM retinoik asit ile 15 mL MSCM'de yeniden plakalayın. NS, 2. günden sonra mikroskop kullanmadan Petri kabında görünür olmalıdır.
  3. 4. günde, hücreleri ve medyayı 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve nörosferlerin dibe çökmesine izin verin (5 dakika). Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 0.5 μM SAG, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 ve 0.1 μM retinoik asit ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden askıya alın.
  4. 7. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak hücreleri 0.5 μM SAG ve 0.1μM retinoik asit ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden askıya alın.
  5. 9. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak 10 μM LAPT ile desteklenen 15 mL MSCM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
  6. 11. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak hücreleri 20 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden askıya alın.
  7. 14. günde, motonöronları platforma tohumlayın.

7. Biyoreaktörde motonöronların toplanması (14. gün)

  1. 2 mg / mL kollajen I ve Matrigel'den oluşan 4: 1 jel karışımı hazırlayın (1 mL'lik bir son hacme ulaşmak için 800 μL kollajen karışımı + 200 μL Matrigel). Kollajen bileşeni için, beraberindeki nötralize edici maddeyi (nötralize edici maddeye 9: 1 kollajen karışımı) ekleyin ve 800 μL'lik bir son hacim elde etmek için karışımı 1x PBS ile seyreltin.
  2. Büyük nörosferleri seçmek ve jel karışımında yeniden askıya almak için 400 nm hücre süzgeci kullanın.
  3. Rezervuardan ve dikkatlice nörosferden gelen ortamları aspire edin (Şekil 2).
  4. Nörosfer kanalına 15 μL jel karışımı ekleyin.
  5. 10 μL'lik bir pipeti 10 μL jel ile doldurun ve ardından bir nörosfer seçin.
  6. NS'yi nörosfer kanalına yatırın ve NS'nin odada olduğundan emin olun. NS biriktikten sonra kalan jeli serbest bırakırken pipeti yavaşça kaldırın. NS'nin doğru şekilde yatırıldığından emin değilseniz, bir mikroskop kullanarak yerini kontrol edin.
  7. Jelin 37 °C'de 30 dakika polimerize olmasına izin verin.
  8. Rezervuarlara 20 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenmiş 450 μL NbActiv4 ekleyin.
  9. NS'den kas dokusuna aksonal büyümeye izin vermek için medyayı her geçen gün değiştirin.

8. NMJ fonksiyonunun eşzamanlı optik stimülasyonu ve video kaydı (24+ gün)

  1. Görüntüleme için, bilimsel bir tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken (sCMOS) kameraya sahip ters çevrilmiş bir floresan mikroskop kullanın.
  2. Kamera yazılımı gruplamasını 2x2'ye, pozlamayı 20 ms'ye, panjuru AÇIK, okuma hızını 540 MHz'e, dinamik aralık: 12 bit ve kazanç 1'e ve sensör modu: üst üste binmeye ayarlayın.
  3. Mikrodokuları görüntülemek için mikroskopta 2x objektif kullanın.
  4. Mikroskop aşamasına bir canlı hücre odası (37 °C, % 5 CO2) takın.
  5. Dosya boyutunu ve işleme süresini en aza indirmek için innerve iskelet dokuları dokusunu içeren ilgili bölgeyi (ROI) seçin.
  6. Fotoğraf makinesinden gelen mavi ışık darbelerini filtrelemek için numune ile görüntüleme hedefi arasına 594 nm uzunluğunda bir emisyon filtresi yerleştirin.
  7. Canlı hücre odasına 4 biyoreaktör (24 doku) içeren dikdörtgen 4 delikli bir plaka yerleştirin.
  8. Live View'ı (Canlı Görünüm) tıklayın. Görüntüyü istediğiniz yatırım getirisi ile ortalayın ve odaklayın.
  9. Sahne alanı konumunu, Arduino panosunu ve video alımını denetlemek için GitHub klasöründen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) özel makro kodunu yükleyin.
  10. Çıkış filmini şu şekilde ayarlayın: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. Makro kodunu sahne alanında ayarlanmış istenen X,Y koordinatlarıyla çalıştırın ve 50 kare/sn'de 1700 kare ile hızlı bir zaman atlaması elde edin.
  12. Görüntülemeden sonra ortamı değiştirin ve numuneleri inkübatöre geri gönderin. Doku yorgunluğunu önlemek için görüntü yakalama oturumları arasında en az 24 saat bekleyin.

9. Toplu işleme ve analiz (24. gün)

  1. Film işleme
    1. Toplu analizde videoları işlemek için özel MATLAB kodunu kullanın. Dosyalar GitHub klasöründen indirilebilir (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). İşlevler Tablo 2'de listelenmiş ve açıklanmıştır.
      NOT: Kod .nd2 ve .czi biçimleriyle uyumludur. MATLAB'da paralel işlemenin etkinleştirilmesini gerektirir ve biyoformat paketine ihtiyaç duyar.
    2. Filmleri paralel işleme yoluyla analiz etmek için recursiveOSAnalysis komut dosyasını çalıştırın. Edinilen tüm videoları aynı klasörde bulundurun ve kodu çalıştırırken bu klasörü seçin.
    3. Analiz sonrası parametreleri gerektiği gibi ayarlayın.
      1. Kayıt başlangıcında kendiliğinden kasılma yakalanırsa taban çizgisini değiştirinTime (seçenek 1). Bu, 0'ın üzerinde bir ilk okuma yolu gösterecek ve telafi etmek için çerçevenin kaydırılmasını gerektirecektir.
      2. Kasılmalar kaydedilmiyorsa peakThreshold'i (seçenek 2) değiştirin. Kod, varsayılan olarak en yüksek tepe noktasının %25'inin üzerinde olan kasılmaları algılar, böylece bu değer değiştirilebilir.
      3. Her tepe noktasının başlangıcını algılarken hassasiyeti ayarlamak için minMinProminence ve minMinWidth değerlerini değiştirin.
    4. Video ve grafik çıktısı oluşturun.
      1. RecursiveOSMovie komutunu çalıştırarak her doku için kendi kontraktilitesi izine sahip bir video dosyası oluşturun.

10. NMJ fonksiyonunun bozulması (24. gün+)

  1. 20 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenen NbActiv4 bazal ortama harici efektör ekleyerek tedavi ortamı hazırlayın.
    1. MG sera deneyi için, NbActiv4 + BDNF + GDNF'de% 20 MG hasta serumunu kullanın.
    2. BTX deneyi için NbActiv4 + BDNF + GDNF'de 5 μg/mL BTX kullanın.
  2. Adım 3.2'yi kullanarak uyarın/görüntüleyin. tıklayarak taban çizgisini kaydedin.
  3. Dokulardaki ortamı tedavi ortamı (450 μL/doku) ile değiştirin.
  4. İstenilen süre boyunca inkübe edin (hasta serumları için 48 saat, BTX için 20 dakika).
  5. Adım 3.2'yi kullanarak tekrar uyarın/görüntüleyin. tedaviden sonra fonksiyonu kaydetmek için.
  6. Tedavi ortamını çıkarın ve dokuların istenen süre dinlenmesine izin verin (serumların çıkarılmasından 48 saat sonra)
    NOT: Doku yorgunluğunu önlemek için stimülasyon ve görüntüleme arasında en az 24 saat bekleyin

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöromüsküler kavşaklar, optogenetik hiPSC türevi motonöronların optogenetik olmayan iskelet kası dokusu ile birlikte kültürlenmesiyle oluşturuldu. İnsan primer iskelet miyoblastları (SkM) platformlara tohumlandı ve 2 haftalık protokol kullanılarak çok çekirdekli miyotüplere farklılaştırıldı. Optogenetik motonöronlar ayrı ayrı, ancak miyotüp farklılaşmasına paralel olarak farklılaştırıldı ve daha sonra platforma tohumlandı (Şekil 1). Dokular, MN tohumlamasından 7-12 gün sonra mavi ışık stimül...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu sistem, NMJ fonksiyonunun otomatik ve tarafsız bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için optogenetik ve video işlemeyi birleştiren tasarlanmış bir 3D insan dokusu modelidir. Standartlaştırılmış bir protokol kullanarak, fizyolojik gelişim sırasında NMJ fonksiyonundaki değişiklikleri ölçme ve nörotoksin maruziyeti ve myastenia gravis hasta serumları gibi patolojilerin zararlı etkilerini karakterize etme yeteneğini gösterdik.

Önceki çalışmalar, MG hastası sera22 kul...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH [hibe numaraları EB025765 ve EB027062], DOD [ödül numarası W81XWH-18-1-0095] ve UCSF Mühendislik Yoluyla Sağlık İnovasyonu (HIVE Bursu) tarafından sağlanan finansman desteğini minnetle kabul ediyoruz. Columbia Üniversitesi Kök Hücre Çekirdeğine, hücre yeniden programlamadaki yardımları ve rehberlikleri için minnetle teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücreler< / güçlü >
SkMDCCook MiyozitP01059-14M
< güçlü > Medya ve Takviyeler< / güçlü >
DMEM / F12ThermoFisher Scientific12634-020
Sığır Serumu Albümin çözeltisiMillipore SigmaA9576-50ML
G-5 Takviyesi (100X)ThermoFisher Scientific17503-012
Genetik Seçici Antibiyotik (G418 Sülfat) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131-035
İnsülin, Rekombinant İnsanMillipor Sigma91077C-100MG
MatrigelCorning354277
mTeSR PlusKök Hücre Teknolojileri100-0276
MyoTonic Büyüme Medya KitiCook MyositeMK-4444
N-2 TakviyesiThermoFisher Scientific17502-048
NbActiv4 500 mLBrainBits LLCNb4-500
Nörobazal OrtaThermoFisher Scientific21103-049
Neurobazal-A OrtaThermoFisher ScientificA13710-01
Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSRKök Hücre Teknolojileri5872
Plastik
30 mm kafes küp sistemiThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 ve ER2-P4
37 &mikro; m Tersinir Süzgeç, büyükKök Hücre Teknolojileri27250
546 nm kısa geçişli uyarma filtresiSemrockFF01-546/SP-25
573 nm dikroik aynaSemrockFF573-Di01– 25x36
594 nm uzun geçiren emisyon filtresiSemrockBLP01-594R-25
594 nm uzun geçiren uyarma filtresiSemrockBLP01-594R-25
Mavi (470nm) SinkPAD-II 10mm Kare Taban üzerinde Asi LED - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° Buzlu 10 mm Dairesel Işın Optik - Entegre AyaklarLuxeonStarLEDs10413
Corning 60 mm Ultra Düşük Ataşman Kültür KabıCorning3261
Isı emiciLuxeonStarLEDsLPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 & mikro; m, 25'li paket, sterilPluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 & mikro; m, 25'li paket, sterilPluriSelect43-50500-03
Kırmızı (627nm) SinkPAD-II 10mm Kare Taban üzerinde Asi LED - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-R5
halka tahrikli iris diyaframıThorLabsSM1D12D
T-Cube LED sürücüleriThorLabsLEDD1B, KPS101
Molds
Dişi Dişli Altıgen Standoffs,  3 1/2" 10-32, Kısmen Dişli 1/2"McMaster91920A046
Düşük Profil  C-ClampMcMaster1705A12
Büyüme Faktörleri
Adenozin 3′,5′-döngüsel monofosfatMillipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021, 10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mg& D Sistemleri2634/10
İnsan CNTF, araştırma sınıfı, 5 & gMiltenyl Biotec130-096-336
İnsan Vitronektin Proteini, CF R& D Systems2349-VN-100
İnsan Vitronektin Proteini, CF R& D Sistemleri2349-VN-100
IGF1 Rekombinant İnsan ProteiniThermoFisher ScientificPHG0078
Laminin fare proteini, doğalThermoFisher Scientific23017015
Rekombinant İnsan Agrin ProteiniR& D Systems6624-AG-050
Rekombinant İnsan GDNF Proteini, CF 50ugAr-Ge D Systems212-GD-050 / CF
Rekombinant İnsan Nörotrofin 3  100 ugHücre BilimleriCRN500D
Rekombinant İnsan Nörotrofin-4Hücre BilimleriCRN501B
Rekombinant İnsan Sonic Kirpi/Shh (C24II) N-TerminusR& D Systems1845-SH-100
Rekombinant İnsan/Murin/Sıçan BDNF 50 ugPeprotech450-02
Retinoik Asit, 50 mgMillipore SigmaR2625-50
SAG Düzleştirilmiş AgonistMillipore Sigma566660
SB431542 10 mgKök Hücre Teknolojileri72234
StemMACS LDN-193189Miltenyl Biotec130-103-925
İnsan plazmasından VitronektinMillipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 dihidroklorürTocris1254
Antikorlar< / güçlü>
&alfa; -aktinin mAb (Fare IgG1)Abcamab9465
Kolin Asetiltransferaz (ChAT) (Keçi)MilliporeAB144P
Desmin mAb (Fare IgG1)DakoM076029-2
Miyozin Ağır Zincir (MHC) (Fare IgG2b)DSHBMF20
Ekipman
Arduino Uno R3ArduinoA000066
Otomatik aşamaUygulamalı bilimsel enstrümantasyonMS-2000 XYZ
Genişletilmiş plazma temizleyiciHarrick PlazmaPDC-001 ( 115V)
Invitrogen Kontes Otomatik Hücre SayacıMareşal ScientificI-CACC
IX-81 Ters floresan mikroskobuOlympusIX-ILL100LH
Serisi Sahne Üst İnkübatör SistemiTokai Hit STXTOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS KameraAndor TeknolojisiZYLA-4.2P-CL10
Yazılım
Arduino Yazılımı (IDE)ArduinoIDE 1.8.19
MastercamMastercamSolidworks
MatlabMatlabR2021b
NIS öğeleriNikonTemel Araştırma
Solidworks 3D CADSolidworks SolidworksStandardı
Gelişmiş R için Mastercam

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326(2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126(2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885(2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27(2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133(2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033(2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Optogenetic Neuromuscular JunctionHuman NMJ ModelTissue EngineeringInduced Pluripotent Stem CellsOptogenetic StimulationMuscle Contraction AnalysisMicrofabrication TechniquesVideo Contractility AnalysisMyasthenia Gravis ModelMotor Neuron Differentiation

İlgili makaleler