Konakçı sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit ile bağlanma afinitesini (KD) ölçmek için izotermal titrasyon kalorimetrisini kullanarak, viral giriş öncesi ve sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen anti-hepatit B virüsü (HBV) bileşiklerini taramak için bir protokol sunuyoruz. Antiviral etkinlik, viral yaşam döngüsü belirteçlerinin (cccDNA oluşumu, transkripsiyon ve viral montaj) baskılanması yoluyla belirlendi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Terapötik Hedef Olarak Polipeptitin Sodyum Taurokolat Kotransportasyonu Yoluyla Hepatit B Virüsü Girişini İnceleyen Yetkin Bir Hepatosit Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu hepatosellüler karsinom için çok önemli bir risk faktörü olarak kabul edilmiştir. Mevcut tedavi sadece viral yükü azaltabilir, ancak tam remisyon ile sonuçlanmaz. HBV enfeksiyonu için etkili bir hepatosit modeli, terapötik ajanların taranması için çok önemli olacak gerçek bir viral yaşam döngüsü sunacaktır. Mevcut anti-HBV ajanlarının çoğu, viral girişten sonraki yaşam döngüsü aşamalarını hedefler, ancak viral girişten önce değil. Bu protokol, viral giriş öncesi ve viral giriş sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen terapötik ajanları tarayabilen yetkin bir hepatosit modelinin oluşturulmasını detaylandırmaktadır. Bu, sodyum taurokolat kotransporting polipeptit (NTCP) bağlanmasının, cccDNA oluşumunun, transkripsiyonun ve konakçı hücreler olarak imHC veya HepaRG'ye dayalı viral montajın hedeflenmesini içerir. Burada, HBV giriş inhibisyon testi, HBV bağlama ve NTCP aracılığıyla taşıma işlevlerini inhibe etmek için kurkumin kullandı. İnhibitörler, termodinamik parametrelere dayalı HBV ilaç taraması için evrensel bir araç olan izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) kullanılarak NTCP ile bağlanma afinitesi (KD) açısından değerlendirildi.
Giriş
Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu tüm dünyada hayatı tehdit eden bir hastalık olarak kabul edilmektedir. Kronik HBV enfeksiyonu karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinom riski taşır1. Mevcut anti-HBV tedavisi çoğunlukla nükleos(t)ide analogları (NA'lar) ve interferon-alfa (IFN-α)2,3 kullanılarak viral giriş sonrası çalışmalara odaklanmaktadır. Bir HBV giriş inhibitörü olan Myrcludex B'nin keşfi, anti-HBV ajanları4 için yeni bir hedef belirlemiştir. Kronik HBV'de giriş inhibitörleri ve NA'ların kombinasyonu, tek başına viral replikasyonu hedefleyenlere kıyasla ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Aşağıdaki prosedürler Sınıf II biyolojik tehlike akış davlumbazında veya laminer akışlı davlumbazda gerçekleştirilmelidir. HBV'nin kullanımı IRB (MURA2020/1545) tarafından etik olarak onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm çözümler, reaktifler, ekipman ve hücre hatları hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Konakçı hücrelerin hazırlanması (olgun hepatositler)
- Kültür hepatositleri (3.75 × 105 hücreli HepaRG veya imHC) ve %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 L-glutamin, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş 10 mL DMEM/F12 ortamı içeren 75c....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Özellikle imHC'nin diferansiye aşamasında binüklee hücreler ve poligonal şekilli morfoloji (Şekil 1) dahil olmak üzere hepatik olgunlaşma özellikleri gözlenmiştir (Şekil 1A). NTCP ekspresyonunda büyük bir artış d-HepaRG ve d-imHC'de sırasıyla 7 kat ve 40 kat olarak ölçülmüştür (Şekil 1B). HBV girişine duyarlılık kazandırdığı varsayılan NTCP'nin yüksek glikozile formu, d-imHC'de d-HepaRG'ye göre daha fazla saptandı (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
HBV enfeksiyonu, hepatositler25 üzerindeki heparan sülfat proteoglikanlarına (HSPG'ler) düşük afiniteli bağlanma ile başlatılır, ardından endositoz26 yoluyla daha sonra içselleştirme ile NTCP'ye bağlanır. NTCP, HBV girişi için çok önemli bir reseptör olduğundan, HBV girişini hedeflemek, de novo enfeksiyonu, anneden çocuğa bulaşmayı (MTCT) ve karaciğer nakli sonrası nüksünü azaltmak için klinik olarak çevrilebilir. Viral girişin kesilmesi, kronik HBV enfeksiyonu içi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.
Teşekkürler
Bu araştırma projesi, Mahidol Üniversitesi ve Tayland Bilim Araştırma ve İnovasyon (TSRI) tarafından ayrı ayrı A. Wongkajornsilp ve K. Sa-ngiamsuntorn'a verilen desteklenmektedir. Bu çalışma, Ulusal Yüksek Öğretim Bilim Araştırma ve İnovasyon Politikası Konseyi Ofisi tarafından Rekabet Edebilirlik Program Yönetim Birimi (hibe numarası C10F630093) aracılığıyla finansal olarak desteklenmiştir. A. Wongkajornsilp Mahidol Üniversitesi Siriraj Hastanesi Tıp Fakültesi Chalermprakiat hibesi sahibidir. Yazarlar, ITC tekniğindeki yardımları için Bayan Sawinee Seemakhan'a (Mahidol Üniversitesi Fen Fakültesi, İlaç Keşfi Mükemmel Merkezi) teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücre hatları< / güçlü > | |||
| HepaRG Hücreleri, Dondurularak Korunmuş | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2 / 2.2.15 İnsan Hepatoblastom Hücre | Hattı Merck | SCC249 | |
| Reaktifler< / güçlü> | |||
| % 4 Paraformadehit Fosfat Tampon Çözeltisi | FUJIFLIM Wako kimyasal | 163-20145 | |
| BD Perma / Yıkama tamponu | BD Biosciences | 554723 | Perma / Yıkama tamponu |
| Siklosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disülfat tuzu | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli EDTA içermeyen (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA izolasyon kitleri | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA İzolasyon Kiti | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Ters Transkripsiyon Sistemi | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR HIZLI qPCR Kiti | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Konsantratör | Takara bio | PT4421-2 | yoğunlaştırıcı |
| Luminata kreşendo Batı HRP substratı | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) | Evrensel Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA ekstraksiyon kiti | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Fosfat tamponlu tuzlu | su Merck | P3813 | |
| Polietilen glikol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Altın Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Rekombinant NTCP | Bulut Klonu | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lizis Tamponu (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kiti | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tripsin-EDTA | Gibco | 25200072 | % 0.125'e seyreltin |
| Antikorlar< / güçlü> | |||
| nbsp; Anti-NTCP1 antikoru | Abcam | ab131084 | 1:100 seyreltme |
| Anti-GAPDH antikoru | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200.000 seyreltme |
| HRP konjuge keçi anti-tavşan antikoru | Abcam | ab205718 | 1: 10.000 seyreltme |
| HRP keçi anti-fare ikincil antikoru | Abcam | ab97023 | 1: 10.000 seyreltme |
| Keçi anti-Tavşan IgG İkincil Antikoru, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 seyreltme |
| Reaktif bileşimi < / güçlü > | |||
| < güçlü > 1 deg; Antikor seyreltme tamponu | |||
| 1x TBST | |||
| % 3 BSA | Sigma | A7906-100G | Çalışma konsantrasyonu:% 3 |
| & nbsp; Sodyum azid | Sigma | 199931 | Çalışma konsantrasyonu:% 0.05 |
| < güçlü > Hepatosit Büyüme Ortamı< / güçlü > | |||
| nbsp; DME / F12 | Gibco | 12400-024 | |
| & nbsp; %10 FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| %1 Kalem/Strep | HyClon | SV30010 | |
| % 1 GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| hepatik olgunlaşma ortamı | |||
| Williams'ın E orta | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| %10 FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| %1 Kalem/Strep | HyClon | SV30010 | |
| % 1 GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 ve mikro; g/mL İnsülin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 ve mikro; M hidrokotizon | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| % 2 DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| < güçlü > IF Engelleme çözeltisi< / güçlü> | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| % 3 BSA | Sigma | A7906-100G | Çalışma konsantrasyonu:% 3 |
| & nbsp; % 0.2 Triton X-100 | Sigma | T8787 | Çalışma konsantrasyonu:% 0.2 |
| < güçlü > RIPA Lizis Tampon Çözeltisi < / güçlü > | Merck | 20-188 | Nihai konsantrasyon: 1X |
| & nbsp; Proteaz İnhibitörü Kokteyl | Thermo Scientific | 78425 | Nihai konsantrasyon: 1X |
| & nbsp; Na3VO4 | Nihai konsantrasyon: 1 mM | ||
| & nbsp; PMSF | Nihai konsantrasyon: 1 mM | ||
| & nbsp; NaF | Nihai konsantrasyon: 10 mM | ||
| < güçlü > Western blot reaktifi< / güçlü> | |||
| nbsp; 10x Tris-tamponlu salin (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Nihai konsantrasyon: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | %0.1 Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Test | Kiti Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Poliakrilamid jel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Amonyum Persülfat (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Nihai konsantrasyon:% 0.05 |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | İstifleyici jel: %0,1, Çözücü jel: %0,05 |
| 2x Laemmli Numune Tamponu | Bio-Rad | 161-0737 | Nihai konsantrasyon: 1X |
| Precision Plus Protein Çift Renk Standartları | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Engelleme çözümü/ 2&derece; Antikor seyreltme tamponu | |||
| 1x TBST | |||
| %5 Yağsız süt (yağsız kuru süt) | Bio-Rad | 170-6404 | Çalışma konsantrasyonu: %5 |
| 1x Çalışma tamponu 1 L | |||
| 10x Tris-tamponlu salin (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Nihai konsantrasyon: 1X |
| Glisin | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Çalışma konsantrasyonu:% 0.1 |
| < güçlü > Blot transfer tamponu 500 mL< / güçlü> | |||
| nbsp; 10x Tris-tamponlu salin (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Nihai konsantrasyon: 1X |
| Glisin | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Metanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Hafif sıyırma çözeltisi 1 L | pH'ı 2.2 | ||
| &2 'ye ayarlayın; Glisin | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Ekipmanlar | |||
| 15 mL santrifüj tüpü | Corning | 430052 | |
| 50 mL santrifüj tüpü | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biyolojik güvenlik kabini |
| CelCulture CO2 İnkübatör | Esco | 2170002 | Nemlendirilmiş doku kültürü inkübatörü |
| CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Dedektörü | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Akış Sitometresi | BD Biosciences | 651154 | |
| Dereceli pipetler (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | İzotermal titrasyon kalorimetreleri | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Elektroforez odası |
| Mini Trans-blot emici filtre kağıdı | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Görüntüleme Sistemi | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipet kontrol cihazı | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Güç kaynağı |
| PVDF membran | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 hücre kültürü şişesi | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Yarı Kuru Transfer Hücresi | Bio-Rad | 1703940 | Yarı kuru transfer hücresi |
| Ultrasonik işlemci (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Malzemeler | ||
| : Versati Masa Üstü Soğutmalı Santrifüj | Esco | T1000R, | sallanan kova döndürücü ile santrifüj |
Kaynaklar
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (20....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
