İnsan Nötrofiller ve Staphylococcus aureus Biyofilmleri Arasındaki Etkileşimleri Görselleştirmek ve Ölçmek için Standartlaştırılmış In vitro Testler

Bir biyofilm, hücre dışı bir polimerik madde (EPS) ^1,2 içine yerleştirilmiş yüzeyle ilişkili mikropların veya bağlı olmayan agregaların bir topluluğudur. Bu topluluklar, antimikrobiyal ajanlara ve bağışıklık sistemine tolerans da dahil olmak üzere çevresel stres faktörlerinden korunan mikroorganizmaları korur³. Birkaç patojenik mikrobiyal tür, kronik enfeksiyonlarla ilişkili biyofilmler oluşturur⁴. Biyofilmlerin gelişimi, yüzeylere bağlanma, EPS üretimi, hücre proliferasyonu, biyofilm yapılandırması ve hücre ayrılması^5'i içeren karmaşık bir süreçtir. Hücreler bir biyofilm oluşturmak için dağıldıklarında, planktonik kalırlar veya yeni bir substrata dönüşürler ve biyofilm gelişimini yeniden başlatırlar⁶.

Fırsatçı bir patojen olan Staphylococcus aureus, bağlanma, proliferasyon, olgunlaşma ve dağılım⁷ dahil olmak üzere genel bir biyofilm gelişim şemasını izler. S. aureus biyofilmlerindeki bağlanma süreci, hidrofobik etkileşimler, teikoik asitler ve yapışkan matris moleküllerini (MSCRAMM'ler^{) tanıyan} mikrobiyal yüzey bileşenleri tarafından ^{belirlenir8,9}. S. aureus'un proliferasyonu başladığında, esas olarak polisakkaritler, proteinler, hücre dışı DNA ve teikoik asitlerden oluşan EPS^{üretilir 5}. EPS bileşenleri üretilirken, biyofilm 3 boyutlu yapıya katkıda bulunan ve ayrılmaya yardımcı olan çeşitli ekzoenzimler ve küçük moleküller de üretilir⁵. S. aureus, tıbbi cihazların yerleşmesine bağlı enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çeşitli kronik enfeksiyonlar oluşturmak için bu son derece koordineli yaşam tarzından yararlanır¹⁰.

Metisiline dirençli S. aureus (MRSA), santral venöz ve üriner kateterler, protez eklemler, kalp pilleri, mekanik kalp kapakçıkları ve rahim içi cihazlar gibi yerleşik tıbbi cihazlarla ilgili enfeksiyonların önde gelen nedenlerinden biridir¹¹. Bu tür enfeksiyonlar sırasında, nötrofiller , çoklu stratejilerle patojenlerle savaşmak için enfeksiyon bölgesine alınan ilk konakçı bağışıklık hücreleridir¹². Bunlar arasında fagositoz, degranülasyon, reaktif oksijen ve azot türlerinin (ROS / RNS) üretimi veya patojenleri ortadan kaldırmak için nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) salınması¹³.

Mikropların fagositozu üzerine ROS üretimi, nötrofiller tarafından sergilenen anahtar antimikrobiyal yanıtlardan biridir¹⁴. Fagositoz, mikroplar opsoninlerle, özellikle immünoglobulinlerle ve serum^15'te bulunan kompleman bileşenleriyle kaplanırsa artar. Opsonize mikroplar daha sonra nötrofiller üzerindeki hücre yüzey reseptörleri tarafından tanınır ve fagozom¹⁵ adı verilen bir bölme oluşturarak yutulur. Nötrofiller, membranla ilişkili NADPH-oksidaz¹⁶ aracılığıyla fagozomda ROS üretir ve serbest bırakır. Bu çok bileşenli enzim kompleksi, elektronları moleküler oksijene aktararak süperoksit anyonları üretir¹⁶. Ek olarak, nötrofiller ayrıca indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) ¹⁷ ekspresyonu yoluyla RNS üretir. Fagozom içindeki bu yüksek süperoksit ve nitrik oksit radikalleri geniş antimikrobiyal aktivitelere sahiptir. Enzimlerdeki metal merkezlerle etkileşime girebilir ve patojenin nükleik asitlerine, proteinlerine ve hücre zarlarına zarar verebilirler 18,19,20,21. Çok sayıda mikrop biyofilm yaşam tarzını benimser ve ROS^22,23 tarafından öldürülmekten kaçınmak için farklı stratejiler ^kullanır. Bu nedenle, ROS'u ölçmek için nötrofiller ile çift biyofilmlerin standartlaştırılmış tahlilleri, tutarlı sonuçlar için faydalıdır.

Nötrofil ROS üretimini ölçmek gibi tahliller, nötrofillerin biyofilmlere tepkileri hakkında bilgi sağlarken, nötrofillerin bir biyofilm içindeki etkileşimlerini görselleştirme yeteneği de güçlü bir araç olarak hizmet edebilir. Mikroskopi için floresan boyaların kullanımı genellikle mikroskopi görüntüleme analizi için kullanılabilecek yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için optimizasyon gerektirir. Bazı koşulları optimize etme esnekliği sınırlıdır, çünkü nötrofiller izolasyon sonrası hücre ölümüne maruz kalabilir. Ayrıca, biyofilmler tipik olarak, nötrofillerin eklenmesinden önce planktonik popülasyonu deney düzeneğinden çıkarmak için yıkanır. Yıkama sırasında, biyofilmler yüzeye gevşek bir şekilde yapışırsa, kısmi biyokütle kaybına bağlı olarak replika biyofilmler arasındaki değişkenlik ortaya çıkabilir.

Genel olarak, nötrofiller ve biyofilmler arasındaki etkileşimleri analiz etmek için alandaki mevcut yöntemler esas olarak mikroskopi, akış sitometrisi ve koloni oluşturan birimler (CFU) numaralandırma 24,25,26,27'yi içerir. Mikroskopi, nötrofilleri ve biyofilmleri doğrudan boyayan veya NET oluşumu, degranülasyon ve hücre ölümü gibi mikroplara karşı çeşitli nötrofil tepkilerini hedefleyen boyaların kullanımını içerir^25,28. Nötrofil hücre ölümü ve degranülasyon gibi bu yanıtların bir alt kümesi, akış sitometrisi ile de analiz edilebilir, ancak nötrofillerin bir biyofilm^28,29'daki büyük mikrop agregalarıyla tercihen ilişkisiz olmasını gerektirir. Akış sitometrisi, hücre canlılığı²⁷ gibi bazı biyofilm parametrelerini de ölçebilir. Bununla birlikte, bu süreçler biyofilm biyokütlesinin bozulmasını gerektirir ve nötrofillerin ve bileşenlerinin bir biyofilm ^27,29,30 içindeki uzamsal dağılımı gibi diğer önemli etkileşimleri görselleştirmek için yararlı olmayacaktır.

Mevcut protokol, kullanım sırasında minimum değişkenlik sağlamak için optimize edilmiş biyofilmler üzerindeki nötrofil-biyofilm etkileşimlerini incelemek için geleneksel olarak kullanılan yöntemlerden bazılarının uyarlanmasına odaklanmaktadır. Bu protokol böylece biyofilmleri büyütmek ve ölçmek, birincil insan nötrofillerini periferik kandan izole etmek, ROS üretimini ölçmek ve mikroskopi yoluyla biyofilm-nötrofil etkileşimlerini görselleştirmek için standartlaştırılmış yöntemler sağlar. Bu protokol, donör havuzları arasındaki heterojenliği göz önünde bulundururken biyofilm-nötrofil etkileşimlerini anlamak için farklı sistemlere uyarlanabilir.

Tüm prosedürler Ohio State Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) (2014H0154) tarafından onaylanmıştır. Primer insan nötrofillerini izole etmek için periferik kan toplamak için tüm donörlerden bilgilendirilmiş yazılı onam alındı. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)³¹ , deneylerin gerçekleştirilmesinde model organizma olarak kullanılmıştır. Deneyler, kan yoluyla bulaşan bir patojene potansiyel maruz kalma nedeniyle uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) ile gerçekleştirildi.

1. İn vitro biyofilm hazırlanması

1. Triptik Soya Agar gibi besin açısından zengin bir agar plakası üzerinde çizgi plaka tekniği^32,33 kullanarak kriyokorunmuş bir stoktan izole edilmiş S. aureus kolonileri elde edin³¹ (bkz.
2. 96 delikli bir plakanın ayrı ayrı kuyularını, steril_H2O içinde seyreltilmiş 100 μL %0,001 (v/v) poli-L-Lizin (PLL) ile kaplayın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Aseptik olarak, vakum yardımlı bir aspirasyon tuzağı kullanarak PLL çözeltisini aspire edin. Kuyuların gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
   NOT: Protokoldeki tüm aspirasyon adımları, aksi belirtilmedikçe vakum yardımlı aspirasyon tuzağı kullanılarak gerçekleştirilir.
3. % 2 glikoz ile desteklenmiş minimal esansiyel media alfada (MEMα) bir S. aureus kolonisini aşılayarak bir gecelik kültür hazırlayın ve 37 ° C'de inkübe edin, 16-18 saat boyunca 200 rpm'de çalkalayın.
4. % 2 glikoz ile desteklenmiş 50 μL ila 5 mL taze MEMα aktararak gece kültürünü seyreltin ve 37 ° C'de inkübe edin, 200 rpm'de sallayın, orta logaritmik faza kadar, genellikle 0.5-0.8 optik yoğunluk 600 (OD_600nm) arasında. Orta logaritmik kültürü OD_600nm'lik 0,1'e normalleştirmek için MEMα kullanın.
5. 150 μL normalleştirilmiş kültürü, PLL işlenmiş 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. 37 °C'de nemlendirilmiş bir odada 18-20 saat boyunca statik olarak inkübe edin.
   NOT: Biyofilmler, μ kanallı slaytlar gibi diğer formatlarda da yetiştirilebilir (bkz.
6. Planktonik hücreleri çıkarmak için süpernatantı aspire edin. Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için kalan biyokütleyi 150 μL Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile nazikçe yıkayın. Biyofilmi bozmamak için HBSS'yi damla damla ekleyin.
   NOT: Yıkamalar sırasında süpernatant ve HBSS'yi aspire ederken, biyofilm içeren kuyucuklarda biyofilm hala daldırılmış olacak şekilde yeterli miktarda sıvı (süpernatant veya HBSS) bırakın. Bu, biyofilmi yıkamak için HBSS damla damla eklendiğinde biyofilm yapısının bozulmasını önler.
7. Tüm planktonik hücreleri çıkarmak için adım 1.6'yı en az iki kez daha tekrarlayın. Bu noktada, biyofilmler hemen aşağı akış deneyleri için hazırdır.
   NOT: Biyofilmler nötrofil deneyleri için kullanılmazsa, HBSS fosfat tamponlu salin (PBS) ile değiştirilebilir. HBSS, nötrofil aktivasyonu için optimum koşullar sağlayan glikoz da dahil olmak üzere bileşenler içerdiğinden HBSS yerine tercih edilir³⁴.

2. Biyofilm biyokütlesinin nicelleştirilmesi

1. % 20 (v / v) etanol ve% 80 (v / v) H₂O'da çözünerek% 0.1 (w / v) Kristal Menekşe (CV) çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) bir stok hazırlayın.
2. Yıkanmış biyofilme 150 μL% 0.1 CV çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Yalnızca medya denetimleri olarak en az üç boş kuyu kullanın.
3. Biyofilmlerden% 0.1 CV çözeltisini aspire edin ve lekeli biyofilmleri 200 μL 1x PBS ile yıkayın. Fazla CV'yi kuyulardan çıkarmak için toplam üç yıkama için bu işlemi tekrarlayın.
4. _H2O ile seyreltilmiş 150 μL % 33 (v / v) buzul asetik asit ekleyin. biyokütleye bağlı CV'nin tamamen çözünmesini sağlamak için 30 dakika boyunca 50 rpm'de bir rocker üzerinde oda sıcaklığında inkübe edin.
   DİKKAT: Bu adımı, buzul asetik asit aşındırıcı bir kimyasal olduğundan, uygun KKD'li laminer bir akış başlığında gerçekleştirin.
5. Bu arada, CV leke değerlerini okumak için mikro plaka okuyucuyu ayarlayın (bkz. Buzul asetik asit tedavisini takiben, plakayı 595 nm dalga boyunda okuyun.
   NOT: CV'nin OD'sini ölçmek için kullanılan dalga boyu 500-600 nm³⁵ arasında değişebilir.

3. Nötrofil izolasyonu

NOT: Nötrofiller, daha önce yayınlanmış bir yöntem izlenerek küçük değişikliklerle izole edildi³⁶. Bu izolasyon protokolü önce yoğunluk gradyanı santrifüjlemeyi, ardından %3 dekstran çökeltmesini birleştirir. Bu bölüm yalnızca yayınlanan protokolde yapılan değişikliklere odaklanarak genel nötrofil izolasyon protokolünü kapsamaktadır. Ayrıca, aşağıda özetlenen protokol, nötrofilleri izole edebilen ve gerektiğinde değiştirilebilen birçok yöntemden biridir. Nötrofillerin izole edilmesi için diğer yöntemler, hücre ayırma ortamının veya manyetik antikor hücre ayırma^37'nin kullanımını içerir.

1. Kurumsal IRB'de belirtilen protokole göre, yetişkin bir donörden venipunktur yoluyla kan alın. Kan alımından önce, şırınganın yeterli koruyucu içermeyen heparine sahip olduğundan emin olun, böylece son heparin konsantrasyonu 20 U / mL'dir.
2. Heparinize olmuş kanı oda sıcaklığında_H2O'da endotoksin içermeyen% 0.9 NaCl hacminin 3/4'ü ile seyreltin (bakınız Malzeme Tablosu).
3. Seyreltilmiş kan örneğinin her 20 mL'si için, taze bir 50 mL konik tüpte ticari olarak temin edilebilen bir yoğunluk gradyanı ortamının 14 mL'sini (bkz. Seyreltilmiş kan örneğini yoğunluk gradyanı ortamının üzerine dikkatlice katlayın.
4. Katmanlı kan örneğini oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra tabakayı rahatsız etmemek için santrifüjün yavaş bir mola verdiğinden emin olun.
   NOT: Kan örneği, bir salin ve plazma karışımı, bir mononükleer hücre tabakası, yoğunluk gradyan ortamı, nötrofiller ve eritrositler içeren beş katmana sahip olacaktır.
5. Serolojik bir pipet kullanarak, nötrofillerin ve eritrosit peletinin üzerindeki tüm katmanları aspire edin, ardından_H2O'da soğuk endotoksin içermeyen% 0.9 NaCl'de peletin nazik bir şekilde yeniden süspansiyonu yapılır. 20 mL'lik bir kan örneğinden üretilen her pelet için, peleti toplam 20 mL hacme geri askıya alın. %3 dekstran 1:1 hacim ekleyin (bkz. Tüpü buz üzerinde 18-20 dakika dik olarak inkübe edin.
   NOT: %3 dekstranın_H2O'da endotoksin içermeyen% 0.9 NaCl ile yapıldığından emin olun.
6. Nötrofiller ve bazı eritrositler içeren üst tabakanın 20 mL'sini yeni bir 50 mL konik tüp üzerine çıkarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 355 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı kırmızı bir pelet bırakarak dökün.
7. Kalan eritrositleri lize etmek için peleti 10 mL soğuk, steril_H2O'da 30 s boyunca nazikçe askıya alın. Tonisiteyi geri kazanmak için karışıma hemen 10 mL soğuk endotoksin içermeyen% 0.9 salin ekleyin. Çözeltiyi 4 °C'de 3 dakika boyunca 233 x g'de santrifüj yapın.
8. Süpernatantı dökün ve% 95-97 nötrofil içeren peleti, kan örneğinin 20 mL'si başına 1 mL soğuk HBSS'de yeniden askıya alın.
9. Yeniden askıya alınan nötrofillerin 10 μL'sini% 0.4 tripan mavisi dışlama boyasının 90 μL'sine aktarın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın (bkz.
   NOT: Canlı olmayan hücreler, tripan mavisi dışlama boyası canlı hücrelerde geçirimsiz olduğu için maviye boyanır. Bu protokol %99 > hücre canlılığı sağlar^37,38.
10. Nötrofillerin son konsantrasyonu 4 x 10⁶ hücre / mL olacak şekilde ek HBSS ekleyin.
    NOT: %<99 hücre canlılığına sahip örnekler için, 4 x 10⁶ hücre/mL'lik nihai konsantrasyon hala elde edilebilir; Bununla birlikte, elde edilen 4 x 10⁶ hücre/mL içeren çözeltinin toplam hacmi azalacaktır. Nötrofillerin nihai konsantrasyonu, kullanıcının deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Nötrofiller, aşağıda açıklanan tüm deneyler için 4 x 10⁶ hücre / mL nihai konsantrasyonda yeniden askıya alındı. Donörden donöre değişkenliği hesaba katmak için, nötrofiller ile ilgili tüm deneylerin en az üç farklı donör ile yapılması şiddetle tavsiye edilir.

4. Nötrofiller tarafından üretilen ROS'un ölçümü

1. Yıkanmış biyofilme (adım 1.6) damla damla 100 μL% 20 normal insan serumu (HBSS'de seyreltilmiş) ekleyin ve biyofilmi opsonize etmek için 30 dakika boyunca statik koşullar altında 37 ° C'de inkübe edin.
2. % 20 serum çözeltisini aspire edin ve biyofilmleri bir kez 150 μL HBSS ile damla damla yıkayın. HBSS'yi aspire edin, opsonize biyofilmlerle kuyuları geride bırakın.
   NOT: Deneyin yorumlanması için en az dört grup önerilir: (A) Nötrofiller + Biyofilm, (B) Nötrofiller + PMA (pozitif kontrol, bakınız Malzeme Tablosu), (C) Yalnızca nötrofiller ve (D) Yalnızca Biyofilm.
3. HBSS'de 4 x 10⁶ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden askıya alınan nötrofillere, nihai luminol konsantrasyonu 50 μM olacak şekilde luminol ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Bu çözüm (A) ve (C) grupları için kullanıma hazırdır. Opsonize biyofilmlerle kuyucuklara luminol ile karıştırılmış 4 x 10⁵ nötrofil ekleyin.
4. Ayrı bir tüpte, HBSS'de herhangi bir nötrofil olmadan 50 μM luminol çözeltisi hazırlayın ve bunu içeren biyofilm içeren kuyuya ekleyin (D grubu).
5. Luminol ile karıştırılmış Aliquot 350 μL nötrofiller ve karışıma 500 ng / mL'lik son konsantrasyonda forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ekleyin. Grup (B) için, bu karışımdan 4 x 10⁵ nötrofil biyofilmsiz kuyucuklara ekleyin. Bu olumlu bir kontrol görevi görür.
   NOT: Bu adımda belirtilen PMA konsantrasyonu, PMA uyarılmış nötrofiller pozitif bir kontrol olduğundan, sağlam patlama tepkisi sağlamak için nispeten yüksektir. PMA, deneye bağlı olarak nötrofilleri aktive etmek için daha düşük bir konsantrasyonda kullanılabilir.
6. Plakayı 4 °C'de 30 s için 270 x g'de santrifüj yapın.
7. Plaka okuyucunun, 3 dakikalık aralıklarla 60 dakika boyunca lüminesans ve kinetik okuma ayarıyla birlikte 37 °C'ye ayarlandığından emin olun. 60 dakika boyunca nötrofiller tarafından ROS üretimini ölçmek için plakayı plaka okuyucuya yerleştirin.
   NOT: Bu test için, biyofilmler lüminesans testleri için kullanılan beyaz plakalarda yetiştirilmiştir. PMA, oksidatif patlama yanıtı³⁹ için bilinen bir agonisttir. PMA içeren çalışmalar yaparken, PMA patlama tepkisini hemen başlattığından, nötrofil içeren çözelti soğukken PMA'nın son adımda eklendiğinden emin olun.

5. Biyofilm-nötrofil etkileşimlerinin görüntülenmesi

1. 1.2-1.6 adımlarını kullanarak bir biyofilm oluşturun. Biyofilm görüntülemeyi kolaylaştırmak için, mikroskopi görüntülemenin kolaylığını artırmak için yeşil floresan proteini (GFP) 40,41'i ifade eden USA300 gibi bir floresan S. aureus suşu kullanın.
   NOT: In vitro biyofilm modelini göstermek için 96 delikli bir plaka yerine 6 μ kanallı bir slayt (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılmıştır (adım 1).
2. 4 x 10⁶ hücre/mL nötrofilleri, 100 μM Mavi CMAC (7-amino-4-klorometilkumarin) Boya (BCD, bakınız Malzeme Tablosu) ile 37 °C'de bir rocker'da 30 dakika boyunca ve %5 CO_2'de inkübe edin. Numunelerin karanlıkta inkübe edildiğinden emin olun ve kalan adımlar için ışığa maruz kalmayı sınırlayın.
3. Fazla BCD'yi yıkamak için, nötrofilleri 5 dakika boyunca 270 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı aspire edin. Nötrofilleri taze HBSS'de yeniden askıya alın. Bu noktada, nötrofil ve bakteriyel ölümü izlemek için BCD boyalı nötrofillere 4 μM'lik son konsantrasyonda ethidyum homodimer-1 (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
4. μ slaytlarda yetiştirilen S. aureus biyofilmine 150 μL nötrofil ekleyin, böylece nötrofil-bakteri oranı 1:30'dur (nötrofil: bakteri). μ kızaklarını nemlendirilmiş bir odada 30 dakika boyunca inkübe edin. Bakteriyel hücrelerin sayısı, 18 saatlik bir biyofilmin kaplanmasından elde edilen hücre sayımlarına dayanmaktadır.
5. Nötrofil-biyofilm etkileşimini, floresan boyaların / proteinlerin uyarılmasına ve emisyon dalga boylarına karşılık gelen floresan kanalları kullanarak görüntüleyin.
   NOT: Bu çalışmada BCD 353/466 nm, ethidium homodimer-1 528/617 nm ve GFP 395/509 nm'dir. Numunelerin fotobeyazlamasını önlemek için numunenin lazere veya ışığa maruz kalmasını sınırlayın.
6. Mikroskopi görüntü analiz yazılımını veya FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ ve BAIT gibi programları kullanarak görüntüleri analiz edin, bunların yanı sıra^{daha birçok 42,43,44,45}.
   NOT: Lekelerle çalışırken, kullanılan boyaların özgüllüğünü göz önünde bulundurmak önemlidir. Bazı lekeler prokaryotik ve ökaryotik hücreler üzerinde çalışırken, diğerleri sadece bir tanesi üzerinde çalışır. Nötrofiller ve biyofilmler her iki hücre tipini de lekeleyebilen boyalar kullanılarak ayrı ayrı boyanırsa, çapraz lekelenmeyi önlemek için nötrofiller ve biyofilmleri birleştirmeden önce kalan boyaları yıkadığınızdan emin olun.

Bakteriyel biyofilmler yetiştirmek için kullanılan medya, nötrofillerin hayatta kalmasını etkiler. Nötrofil-biyofilm etkileşimlerini incelemek için nötrofillerin yaşayabilirliği üzerindeki tek başına ortamın etkisini azaltmak için farklı ortamlar test edilmiştir (Şekil 1). Triptik Soya Suyu gibi bakteriyel büyüme ortamları, nötrofillerin yaşayabilirliğini en aza indirir, öyle ki,% 60'ı 37 ° C'de 30 dakikalık bir kuluçka süresinden sonra% 5 CO2 ile canlı. MEMα gibi memeli hücre kültürü ortamı, nötrofillerin yaşayabilirliğini etkilemez ve S. aureus biyofilmlerinin büyümesini destekler. Aslında, minimal medya, diğer bakterilerde biyofilmlerin sağlam büyümesini teşvik eder46,47.

Planktonik hücreleri ortadan kaldırmak için biyokütleyi yıkadıktan sonra medyanın biyofilm büyümesi ve biyofilm biyokütle nicelleştirmesindeki değişkenlik üzerindeki etkisini değerlendirmek için, 18 saatlik bir S. aureus biyofilmi, poli-L-Lizin ile işlenmiş veya muamele edilmemiş kuyucuklarla 96 kuyucuklu bir plakada yetiştirildi. Besin açısından zengin (Triptik Soya Suyu (TSB)) ve minimal (MEMa) bir ortam olduğu gibi kullanıldı veya% 2 glikoz ile desteklendi. CV ile boyanmış biyofilm biyokütlesi, MEMa'da yetiştirilen S. aureus biyofilminin% 2 glikoz ile desteklendiğini, test edilen tüm ortamlar arasında en sağlam biyofilmi ürettiğini ortaya koymuştur (Şekil 2A). Ayrıca, MEMα +% 2 glikoz içeren PLL ön işlemden geçirilmiş kuyucuklarda yetiştirilen biyofilmler, MEMa + % 2 glikoz içeren PLL-işlenmemiş kuyucuklardaki biyofilmlerden daha az değişkenlik göstermiştir. Bu biyofilmler, CV testi35 ve biyokütle nicelemesi için biyofilmleri hassas bir şekilde kullandıktan sonra kaplandığında CFU / mL ile nicelemede daha az değişkenlik göstermiştir. Bu biyofilmler, biyofilmlerin 3 ayrı günde kaplanmasıyla gösterildiği gibi, ortalama olarak 1 x 108 CFU / mL içeriyordu (Şekil 2B). Bu sayı, nötrofil işlevsellik testleri için biyofilmlere eklenecek nötrofil sayısının belirlenmesinde yararlıdır.

Biyofilmlere yanıt olarak nötrofiller tarafından ROS üretimini ölçmek için, S. aureus biyofilmleri 96 kuyucuklu bir plakada 18-20 saat boyunca statik olarak yetiştirildi. Biyofilmler daha sonra opsonize edildi ve nötrofiller eklendi. ROS üretimi daha sonra 60 dakika boyunca ölçüldü (Şekil 3A). Eğrinin altındaki alan, nötrofiller tarafından toplam ROS üretimini ölçmek için kinetik eğriden hesaplanır. Kontrol olarak kullanılan PMA gibi bir agonist ile tedavi edilen nötrofiller, artmış bir ROS üretimi gösterir. Biyofilmlerin yokluğunda, PMA ile muamele edilen nötrofiller sağlam ROS üretimi gösterdi. S. aureus biyofilminin varlığında, PMA ile muamele edilen nötrofillerin genel ROS üretimi azalmıştır. PMA'nın yokluğunda, nötrofiller yalnızca biyofilm ile etkileşimlerine dayanır ve bu da üretilen ROS miktarını daha da azaltır (Şekil 3B).

Floresan mikroskobu kullanarak nötrofil-biyofilm etkileşimlerini görselleştirmek için, sırasıyla canlı hücrelerin sitoplazmasını ve ölü hücrelerin DNA'sını boyayan S. aureus, Blue CMAC boya ve ethidium homodimer-1'in GFP eksprese eden bir suşu kullanılmıştır. S. aureus biyofilmi, 6 μ kanallı bir slaytta 18 saat boyunca yetiştirildi. Mavi CMAC boya etiketli nötrofiller, yıkanmış biyofilmlere ethidyum homodimer-1 ile birlikte eklendi ve görüntülemeden önce% 5 CO2 ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edildi. Geniş alan floresan mikroskopisi, birçok nötrofilin S. aureus biyofilmlerinin yüzeyine lokalize olduğunu, birkaçının ise biyofilm içinde olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 4A). Nötrofiller içindeki S. aureus hücreleri arasındaki etkileşim de belirgindi (Şekil 4C). Nötrofiller (camgöbeği) ile etkileşime giren S. aureus hücrelerinin çoğu ölü (macenta) iken, birkaçı canlı-ölü boyama ile belirlendiği gibi canlı (sarı) kaldı (Şekil 4C). Karşılaştırma için, GFP eksprese eden S. aureus biyofilmleri, biyofilm içindeki ölü S. aureus popülasyonunun bir kısmını ortaya çıkaran ethidium homodimer-1 ile boyandı (Şekil 4B). Ethidiyum homodimer-1 için pozitif olan canlı olmayan nötrofiller, S. aureus biyofilmleri ile inkübasyondan sonra analiz yazılımı (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılarak ölçülmüştür. Nötrofillerin yaklaşık% 48'i, S. aureus biyofilmi ile inkübasyondan sonraki 30 dakika içinde zaten ölmüştü. Mikroskopi protokolünün optimizasyonu sırasında, yapışmamış nötrofillerin çıkarılması için 30 dakikalık inkübasyondan sonra biyofilm ve nötrofillerin yıkanmasının etkisi de değerlendirildi ve hala biyofilme bağlı ölü nötrofillerin yaklaşık% 33'ü ortaya çıkarıldı (Şekil 4D).

Şekil 1: LIVE-DEAD testi, bakteriyel ve memeli büyüme ortamları arasındaki nötrofil sağkalımını karşılaştırır. Nötrofiller izole edildi ve HBSS, MEMa, TSB veya% 0.1 SDS'de 30 dakika boyunca inkübe edildi. LIVE-DEAD boyaması Calcein (canlı) ve ethidyum homodimer-1 (ölü) kullanılarak gerçekleştirildi. HBSS ile inkübe edilmiş nötrofillerin% 100 canlı nötrofil olarak muamele gördüğü canlı nötrofillerin yüzdesi belirlendi. Sonuçlar, iki farklı donörden elde edilen nötrofiller ile üçlü olarak gerçekleştirilen ortalama iki bağımsız deneyi temsil etmektedir. Veriler ortalama ± SD (*p < 0.05, ****p < 0.0001 olarak sunulmuştur. Tek yönlü ANOVA). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Biyofilm biyokütlesinin farklı koşullarda nicelleştirilmesi ve optimize edilmiş koşullarda yetiştirilen biyofilmlerin bakteriyel canlılık sayısı. (A) S. aureus, poli-L-Lizin (PLL) ile kaplanmış veya kaplanmamış 96 delikli bir plakaya tohumlanmıştır. Biyofilmler TSB, MEMα veya 18 saat boyunca statik koşullar altında% 2 glikoz ile desteklenen ortamlardan herhangi birinde yetiştirildi. Biyofilm biyokütlesini boyamak için kristal menekşe (CV) boyama yapıldı. Salınan CV lekesi 1: 10'da seyreltildi ve bir mikro plaka okuyucuda okundu. Sonuçlar, üçlü olarak gerçekleştirilen ortalama üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. Veriler ortalama SD ± olarak sunulmuştur. Her grubun SD'si, farklı biyofilm büyüme koşulları değişkenliğini göstermek için altta gösterilmiştir. (B) Bakteriyel CFU sayımları, optimize edilmiş bir ortamda (MEMa +% 2 glikoz) yetiştirilen biyofilmlerden elde edilmiştir. 18 saatlik statik biyofilmler, biyofilm biyokütlesini gevşetmek için 10 dakikalık bir sonikasyon ile aynı sayıda yıkamaya tabi tutuldu ve kaplamadan önce agregaları bozmak için 22G iğnesinden geçirildi. Sonuçlar üçlü olarak gerçekleştirilen üç replikayı temsil eder. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmaktadır (ns = anlamlı değildir. Tek yönlü ANOVA). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kemilüminesans testi ile nötrofiller tarafından ROS üretiminin ölçülmesi. (A) Nötrofiller (PMN), nötrofiller tarafından ROS üretimini ölçmek için PMA'nın varlığında (kapalı gri üçgen) veya yokluğunda (açık gri ters üçgen) HBSS ile yıkanmış S. aureus biyofilmleri (BF) ile inkübe edildi. Luminol, bir mikroplaka okuyucuda 60 dakika boyunca her 3 dakikada bir ROS'u tespit etmek için kullanıldı. Bir biyofilm (kapalı siyah daire) yokluğunda PMA ile tedavi edilen nötrofiller pozitif bir kontrol görevi görürken, sadece nötrofil (açık siyah daire) ve sadece biyofilm (açık gri üçgen) grupları negatif kontrol olarak görev yaptı. Veriler, iki farklı donörden elde edilen nötrofiller ile üçlü olarak gerçekleştirilen ortalama iki bağımsız deneyi temsil etmektedir. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmaktadır. (B) (A) 'dan itibaren eğrinin altındaki alan, nötrofiller tarafından üretilen toplam ROS'u ölçmek için hesaplanmıştır. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilir. (***p < 0.0001. Tek yönlü ANOVA). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak S. aureus biyofilmi ve nötrofiller arasındaki etkileşimin görselleştirilmesi. Mavi CMAC boya etiketli nötrofiller (camgöbeği), 18 saatlik bir S. aureus biyofilmi (sarı) ile inkübe edilmeden önce ethidium homodimer-1 (macenta; ölü) ile desteklenmiştir. Biyofilm-nötrofil etkileşimleri, geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi ve görüntüler bir görüntü analiz yazılımı kullanılarak işlendi. Deneyler üç farklı donör ile yapıldı. Temsili görüntüler, (A) canlı (camgöbeği) ve ölü (macenta; beyaz oklarla belirtilmiş birkaçı) nötrofillere sahip S. aureus biyofilminin 3D görünümü, (B) GFP'yi (sarı) ifade eden canlı S. aureus veya ethidium homodimer-1 (macenta) ile boyanmış ölü S. aureus nötrofillerin yokluğunda bir S. aureus biyofilminin 3D görünümü, (C) S. aureus'un ortogonal bir görünümü olarak sunulmaktadır. ve xy, yz ve xz düzlemleri tarafından tasvir edildiği gibi nötrofil etkileşimi ve (D) yapışmamış nötrofillerin çıkarılması (yıkanmış) çıkarmak için HBSS ile 30 dakika sonra ya hemen (yıkanmamış) ya da HBSS ile üç tur yıkamadan sonra S. aureus biyofilm varlığında nötrofil canlılığının nicelleştirilmesi. Nötrofil hücre ölümü ortalama ± SD (Student's t-testi) olarak sunulmaktadır. Ölçek çubuğu (A) ve (B) içinde 50 μm ve (C) cinsinden 10 μm değerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.