Etiket Tutma Genişletme Mikroskobu (LR-ExM), Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Yüksek Verimli Etiketleme Sağlar

Genleşme mikroskobu (ExM), epifloresan ve konfokal mikroskoplar^gibi geleneksel mikroskoplarla süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için uygun bir yaklaşım olarak ilk kez tanıtıldığından beri araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6,7 . ExM kullanarak, düzenli konfokal mikroskoplarla bile ~ 70 nm yanal çözünürlük elde etmek mümkündür. ExM, süper çözünürlüklü görüntüleme ile birleştirildiğinde, çözünürlük daha da geliştirilir. Örneğin, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ile kabaca 30 nm çözünürlüğe ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ^1,5 ile kabaca 4 nm çözünürlüğe ulaşılabilir.

Bununla birlikte, düşük etiketleme verimliliği, standart ExM yöntemleriyle ilgili kritik bir konudur. Floresan kaybı, floresan gruplarının türüne ve sindirim süresine bağlı olarak değişebilir. Bununla birlikte, ortalama olarak, ExM'nin polimerizasyonundan ve protein sindirim adımlarından sonra floroforların% 50'sinden fazlasının kaybolduğu ve bunun görüntüleme kalitesine zarar verdiği bildirilmiştir ^3,4.

Böylece, etiketleri verimli bir şekilde tutabilen ve sinyal kaybını azaltabilen etiket tutma genleşme mikroskobu (LR-ExM) geliştirilmiştir¹. LR-ExM'in temel yeniliği, ilgilenilen proteinleri boyamak için standart ExM prosedüründe olduğu gibi sadece floresan boyalar kullanmak yerine bir dizi üç fonksiyonlu ankrajın kullanılmasıdır. Bu üç fonksiyonlu bağlayıcılar üç bölümden oluşur: (1) antikora bağlanmak için konektör (örneğin, N-hidroksisüksinamid (NHS)), (2) proteinleri polimere sabitlemek için çapa (örneğin, metakrilamit (MA)) ve (3) organik bir boyaya konjuge etmek için muhabir (örneğin, biyotin veya digoxigenin (DIG)). Üç fonksiyonlu ankrajlar polimerizasyon ve protein sindirim adımlarında hayatta kalır ve bu nedenle florofor kaybını önler.

Ayrıca, bu yöntem SNAP veya CLIP gibi kendi kendini etiketleyen enzimatik etiketlerle uyumlu olduğu için büyük bir potansiyele sahiptir. Enzimatik etiket yaklaşımlarının immün boyama yaklaşımına göre yüksek özgüllük ve etiketleme verimliliği^açısından bazı faydaları vardır ^8,9,10.

Bu yazıda LR-ExM'in ayrıntılı bir prosedürü gösterilmiştir. LR-ExM, gelişmiş etiketleme verimliliği ile yüksek uzamsal çözünürlük elde etmek için son derece etkili ve esnek bir yöntemdir.

1. Hücre kültürü

1. McCoy'un 5A ortamında kültürlenmiş U2OS hücrelerini,% 5 CO_2'de% 10 FBS ile 37 ° C'de% 5 ile desteklenmiş olarak kullanın.
2. Kullanım kolaylığı için 16 adet iyi çıkarılabilir odacıklı kapak camı (kültür alanı 0,4^cm2) üzerine kültür hücreleri.

2. Fiksasyon ve geçirgenlik

NOT: Fiksasyon ve geçirgenlik koşulları, optimize edilmiş immün boyama protokollerine bağlıdır. Aşağıdakiler, ko-immünostain mikrotübül ve klatrin kaplı çukurlara (CCP'ler) bir fiksasyon ve geçirgenlik protokolüdür.

1. Hücre sayıları ~0.04 x 10 6'ya ulaştığında, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PEM tamponunda (100 mM PIPES, 1 mM EGTA ve 1 mM MgCl 2, pH^6.9) 100 μL%_3.2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin (Tablo 1).
   NOT: PFA kullanılarak sabitleme, sertifikalı bir güvenlik başlığında gerçekleştirilir.
2. Hücreleri her biri 5 dakika boyunca üç kez 200 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
3. Oda sıcaklığında 100 μL geçirgenlik tamponu ile hücreleri 15 dakika boyunca geçirgenleştirin (Tablo 1).
   NOT: Hedef protein, RNA veya DNA bozulmasını önlemek ve en uygun sonucu elde etmek için mümkün olan en kısa sürede etiketlemeye devam edin. Bununla birlikte, ihtiyaç duyulursa, sabit numuneler 4 ° C'de bir PBS tamponunda uzun bir süre (bir aya kadar) saklanabilir. Buharlaşmış PBS'leri değiştirin ve numuneyi fotobeyazlatmaya karşı koruyun.

3. Endojen streptavidin ve biyotin blokajı

1. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir hücre bloke edici tamponda (100 μL) seyreltilmiş streptavidin çözeltisi ile hücreleri inkübe edin (Tablo 1).
2. 200 μL hücre bloke edici tampon ile kısaca durulayın.
3. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir hücre bloke edici tamponda seyreltilmiş 100 μL biyotin çözeltisi içeren hücreleri inkübe edin.
   NOT: SNAP- veya CLIP- etiketlerini kullanmak gibi kendi kendini etiketleme yaklaşımı kullanırken, adım 4'ü atlayın ve adım 5.1: kendinden etiketleme etiketleme yaklaşımına geçin.

4. Primer antikor boyama

1. Sıçan anti-α-tübülin antikoru (1:500 seyreltme) ve tavşan anti-klatrin ağır zincirli antikoru (1:100 seyreltme) içeren hücreleri, 4 ° C'de 16 saat veya oda sıcaklığında 1 saat boyunca 100 μL hücre bloke edici tamponda inkübe edin. Doku örnekleri için kuluçka süresini iki katına çıkarın.
2. Numuneleri her biri 5 dakika boyunca 200 μL PBS ile dört kez yıkayın.

5. LR-ExM'e özgü sekonder antikor boyama

1. IgG antikorlarını N-hidroksisüksinamid (NHS) - metakrilatid (MA) -Biotin veya NHS-MA-Digoxigenin (Dig) gibi üç fonksiyonlu bağlayıcılarla birleştirin (Şekil 1B). Trifonksiyonel çapaların sentezi ve sekonder antikorların konjugasyonu daha önce Shi ve ^ark.1'de tanıtılmıştır. Kendi kendini etiketleme yaklaşımı: IgG antikorlarını MA- benzilguanin (BG)-Biotin veya MA- benzilsitozin (BC)-Dig gibi üç fonksiyonlu bağlayıcılarla birleştirin (Şekil 1B). Üç fonksiyonlu çapaların sentezi ve ikincil antikorların konjugasyonu daha önce Shi ve ^ark.1'de tanıtılmıştır.
2. Hücreleri eşek anti-tavşan-Dig-MA (1:100 seyreltme) ve eşek anti-sıçan-biotin-MA (1:100 seyreltme) sekonder antikorları ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca 100 μL hücre bloke edici tamponda inkübe edin. Doku örnekleri için bu kuluçka süresini iki katına çıkarın.
3. Numuneleri her biri 5 dakika boyunca 200 μL PBS'de dört kez yıkayın.

6. Ek ankraj

1. Proteinleri hidrojel üzerine sabitlemek için hücreleri PBS'de (100 μL) 15 dakika boyunca oda sıcaklığında % 0.25 glutaraldehit (GA) ile inkübe edin. Alternatif olarak, ankraj için 25 mM metakrilik asit N-hidroksisüksinamid ester (MA-NHS) kullanın. Oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon teşvik edilir.
2. Numuneleri PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.

7. Jelleşme

NOT: Genleşme hızı, tuz ve suyun jelin dışına veya içine difüzyon süresi ile belirlenir; böylece ince jellerin dökümü genleşme süresini hızlandırır.

1. 16 delikli jel plakanın üst yapısını çıkarın. Buz üzerindeki hücreleri koşullandırmak için her bir kuyucuğa 40 μL monomer çözeltisi ekleyin. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
   1. Bir monomer çözeltisi hazırlamak için bkz: Tablo 2.
2. Jelasyon çözeltisini buz üzerinde hazırlayın. Monomer çözeltisine çift damıtılmış su ve% 10 N,N, N′,N′ Tetrametilenidiamin (TEMED) hızlandırıcı ekleyin (%10 TEMED: monomer çözeltisi = 1:47); başlatıcıyı henüz eklemeyin (Tablo 3).
3. 0.4^cm2'lik bir alana sahip bir hücre kültürü odası için, yaklaşık 40 μL'lik bir jelasyon çözeltisi hacmi kullanın.
4. Jelasyon çözeltisine% 10 amonyum persülfat (APS) ekleyin, buz üzerinde inkübe edin ve hemen buz üzerindeki her silikon contaya 40 μL jelasyon çözeltisi pipetin. 3 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin (%10 APS:%10 TEMED:monomer çözeltisi = 1:1:47).
5. Numuneyi ışıktan koruyun ve 10 cm'lik Petri kabındaki kapak camını jelasyon için 1,5 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre taşıyın. 37 ° C inkübasyon sırasında jelin nemini korumak için, Petri kabını kapakla örtün ve Petri kabına birkaç damla su koyun.

8. Sindirim

1. Jelleşmeden sonra, jeli ayırmak için camı çıkarın ve jeli 6 kuyucuklu plakaya aktarın. Gömülü hücreleri 2 mL sindirim tamponu (Tablo 1) ile oda sıcaklığında gece boyunca veya 37 °C'de 4 saat sindirin. En az 10 kat fazla hacimli sindirim tamponu kullanın.
2. Jelleri, son jel hacminden en az 10 kat fazla su hacmiyle yıkayın. Yıkama adımını her seferinde 20 ila 30 dakika boyunca dört kez tekrarlayın. Jel her boyutta yaklaşık iki kat genişler.
   NOT: Jel numuneleri, 4 °C'de PBS tamponunda 1 aya kadar saklanabilir. Kurumasını önlemek için buharlaşan suyu değiştirin ve depolama sırasında numuneyi ışıktan koruyun. Üç fonksiyonlu ankrajların bozulmasını önlemek için, numuneler sindirim ve yıkamadan sonra mümkün olan en kısa sürede lekelenmelidir.

9. Sindirim sonrası floresan boyama

1. Jelleri, oda sıcaklığında 24 saat boyunca 2 ila 5 μM STV-boya ve/veya anti-DIG-boya ile 2 mL hacimli streptavidin (STV)/digoxigenin (DIG) boyama tamponunda inkübe edin. Örnekleri karanlıkta tutun.

10. Genişleme

1. Jeli her seferinde 30 dakika ila 1 saat arasında aşırı suyla (2-3 mL) dört kez yıkayın ve genişletin.
2. Floresan mikroskopi altındaki hücrelerin daha kolay görselleştirilmesi için, beş yıkamanın üçüncüsü sırasında hücreleri DAPI ile lekeleyin. DAPI stok konsantrasyonunu (5 mg/mL, 4 °C'de depolanır) yıkama suyunda 1:5.000 seyreltmede seyreltin. Jeli 30 dakika ila 1 saat boyunca bir DAPI-su çözeltisi (2 mL) ile inkübe edin.
3. 3 mL su ile iki kez daha yıkayın.
4. Numuneleri içerecek kadar büyük olan herhangi bir düz tabakta jelleri genişletin. 0,4^cm2 alan kapak camı üzerine hazırlanan genişletilmiş jeller, cam tabanlı 6 delikli bir plakaya güzel bir şekilde oturur.
   NOT: Genleşme sonrası lekeli numuneler, 4°C'de PBS tamponunda 4 aya kadar saklanabilir. kurumasını önlemek ve numuneyi fotobeyazlatmaya karşı korumak için yeterli su ekleyin. Görüntülemeden önce genişletme ve DAPI boyama adımını tekrarlayın. Florofor bozulması riskini önlemek için, numunelerin mümkün olan en kısa sürede görüntülenmesi gerekir.

11. Görüntüleme

1. Jel numunelerini hareketsiz hale getirmek için 6 delikli cam tabanlı görüntüleme odasını %0,01 poli-L-lizin (her biri 3 mL) ile kaplayın.
2. Jel numunelerini kaplanmış görüntüleme odasına aktarın.
3. Numuneleri istenen floresan kapsamlarıyla görüntüleyin.

Klatrin kaplı çukurlar (CCP'ler) üç fonksiyonlu ankrajlar (Şekil 1B) kullanılarak immünoboyalıdır ve LR-ExM, Şekil 1A'da açıklandığı gibi gerçekleştirilir. LR-ExM (Şekil 2C, E), protein tutma genleşme mikroskobu (proExM, Şekil 2A) veya biotin-ExM'ye (Şekil 2B) kıyasla çok daha yüksek floresan yoğunluğu gösterir; LR-ExM sinyali proExM'den yaklaşık altı kat daha yüksekti (Şekil 2D). LR-ExM, kırınım sınırından bile daha küçük olan CCP'ler gibi küçük yapıları etkili bir şekilde yakalayabilir (Şekil 2F, G).

LR-ExM'in bazı temsili sonuçları, immün boyama yaklaşımı kullanılarak sergilenmektedir. Mikrotübüller ve CCP'ler, NHS-MA-DIG ve NHS-MA-biotin dahil olmak üzere üç fonksiyonlu ankrajlar kullanılarak birlikte immünoboyalıdır (Şekil 3A, B). LR-ExM, enzimatik etiket tabanlı yaklaşım için kullanılabilir. Sonuç, Şekil 3C-F'de BG-MA-biotin (SNAP-etiketi için) ve BC-MA-DIG (CLIP-etiketi için) üç fonksiyonlu ankrajlar kullanılarak gösterilmiştir. Ayrıca, LR-ExM'de hem immün boyama hem de protein etiketi yaklaşımı, Şekil 3G-J'de gösterildiği gibi birleştirilebilir. Bu sonuçlardan, LR-ExM'in gelişmiş etiketleme verimliliği ve çözünürlüğü ile yüksek kaliteli görüntüler elde etmenin faydalı olduğu doğrulanmıştır.

LR-ExM, doku örneklerinde de mükemmel performans gösterir. LR-ExM, fare beyin dokusu üzerinde, presinaptik belirteç Fagot ve postsinaptik belirteç Homer1'in birlikte immün boyanmasıyla gerçekleştirilir. İki etiket net ve iyi ayrılmış, bu da yüksek çözünürlüğü ve etiketleme verimliliğini destekliyor (Şekil 4A-E).

Şekil 1: Etiket Tutma Genişletme Mikroskobu (LR-ExM) İş Akışı. (A) LRR-ExM'nin İş Akışı. (B) Üç fonksiyonlu ankrajların şemaları. Bu rakam Shi ve ark.1'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Klatrin ağır zincir (POI) için dolaylı olarak immünoboyalı U2OS hücrelerinde klatrin kaplı çukurların (CCP'ler) sinyal tutma (A-C) Genleşme Mikroskobu (ExM) konfokal görüntülerinin miktarı. (A) AF488 konjuge sekonder antikorları kullanan protein retansiyon ExM (ProExM). (B) Biotin konjuge antikorlar kullanılarak genişleme sonrası etiketlemeli ExM. (C) NHS-MA-BIOTIN üç fonksiyonlu ankrajlarla konjuge edilmiş antikorlar kullanan LR-ExM. B ve C'deki örnekler genişleme sonrası streptavidin-AF488 ile boyanır. (D) A-C'nin yoğunluk ölçümü. Hata çubukları her durum için SD. n = 3'ü temsil eder. A, B, C ve E-G'deki görüntüler için uzunluk genişletme oranları sırasıyla 4,3, 4,5, 4,6 ve 4,3'tür. D grafiğinde kullanılan numuneler için uzunluk genleşme oranı 4,5 ± 0,2'dir. Ölçek çubukları, 500 nm (A-C ve E) ve 100 nm (F ve G). Tüm kantar çubukları genişletme öncesi ünitelerdedir. Arb. u., keyfi birimler; STV, streptavidin. Tüm görüntüler, 60x suya daldırma hedefi (NA1.27) ile dönen disk konfokal mikroskop (Nikon CSU-W1) kullanılarak elde edilir. Bu rakam Shi ve ark.1'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bir U2OS hücresinde NHS-MA-biotin-konjuge sekonder antikorlar (macenta) ile etiketlenmiş mikrotübüllerin ve NHS-MA-DIG-konjuge sekonjuge ikincil antikorlar (yeşil) ile etiketlenmiş CCP'lerin LR-ExM konfokal görüntüleri. (A,B) LR-ExM konfokal görüntüleri. (B) Büyütülmüş görünüm. (C-F) Protein etiketi yaklaşımı kullanılarak etiketlenmiş HeLa hücrelerindeki CCP'lerin ve/veya mitokondrilerin LR-ExM konfokal görüntüleri (C) SNAP etiketi etiketli klatrin, (D) CLIP etiketli TOMM20 ve (E) iki renkli görüntüleme. (F) Büyütülmüş görünüm. (G) İmmün boyama yaklaşımı (NPC, kırmızı sıcak) ve protein etiketi yaklaşımının (SNAP etiketli lamin klima (camgöbeği)) bir kombinasyonunu kullanan iki renkli konfokal LR-ExM görüntüleri. (H) Büyütülmüş görünüm. (I,J) H'nin bireysel kanallarının görünümleri. G'deki sitoplazmik arka planın anti-NUP153 antikorundan kaynaklandığını unutmayın. A-B: 4,7, C-D: 4,4, E-F: 4,5 ve G-J'deki görüntülerin uzunluk genişletme oranları 4,5'tir. Ölçek çubukları, A için 1 μm, B ve F için 200 nm, C-E için 500 nm, G için 2 μm ve H, I ve J için 500 nm. Tüm kantar çubukları genişletme öncesi ünitelerdedir. Tüm görüntüler, 60x suya daldırma hedefi (NA1.27) ile dönen diskli bir konfokal mikroskop (Nikon CSU-W1) kullanılarak elde edilir. Bu rakam Shi ve ark.1'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: LR-ExM'nin doku örnekleri üzerindeki temsili sonuçları. (A) Presinaptik belirteç Fagot (macenta) ve postsinaptik belirteç Homer1 (yeşil) için dolaylı olarak immünoboyalı fare beyin diliminin LR-ExM konfokal görüntüsü. (B,C) Sinapsların yakınlaştırılmış görüntüleri. (D,E) Sarı kutu uzun eksenleri boyunca enine yoğunluk profilleri. Fagot, NHS-MA-DIG-konjuge sekonjuge sekonder antikorlarla etiketlenir ve Homer1, NHS-MA-biotin-konjuge sekonjuge ikincil antikorlarla etiketlenir. Tüm numuneler genişleme sonrası streptavindin-AF488 ve/veya anti-Digoksin-AF594 ile boyanır. A-C'deki görüntüler için uzunluk genişletme oranları 4,2'dir. Ölçek çubukları, 1 μm (A) ve 200 nm (B,C). Tüm kantar çubukları genişletme öncesi ünitelerdedir. Tüm görüntüler, 60x suya daldırma hedefi (NA1.27) ile dönen diskli bir konfokal mikroskop (Nikon CSU-W1) kullanılarak elde edilir. Bu rakam Shi ve ark.1'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kimyasallar ve tamponlar Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: Monomer çözümü Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: Jelasyon çözümü Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.