Fotorespiratuar Mutantlarda Fotosentetik Etkinliğin Klorofil Floresan Analizi ile Değerlendirilmesi

Çiftçi tarlalarında yaygın olarak görülen abiyotik stres koşulları, fotosentetik verimliliği azaltarak mahsul verimini olumsuz yönde etkileyebilir. Isı dalgaları, iklim değişikliği, kuraklık ve toprak tuzluluğu gibi zararlı çevresel koşullar, CO₂ kullanılabilirliğini değiştiren ve bir bitkinin yüksek ışık stresine tepkisini azaltan abiyotik streslere neden olabilir. En büyük iki karasal karbon akışı, bitki büyümesi ve mahsul verimi için gerekli olan fotosentez ve fotoresolunumdur. Bu süreçlerde yer alan önemli proteinlerin ve enzimlerin birçoğu laboratuvar koşullarında karakterize edilmiş ve genetik seviye^1'de tanımlanmıştır. Fotosentez ve fotorespirasyonun anlaşılmasında çok ilerleme kaydedilmesine rağmen, bitki organelleri arasındaki taşıma da dahil olmak üzere birçok adım karakterize edilmemiştir ^2,3.

Fotosentezden sonra bitkilerdeki en büyük ikinci karbon akışı olan fotorespirasyon, Rubisco enziminin karbondioksit yerine oksijeni ribuloz 1,5 bisfosfata (RuBP) sabitleyerek inhibitör bileşik 2-fosfoglikolat (2PG) ^1'i üretmesiyle başlar. 2PG'nin inhibitör etkilerini en aza indirmek ve daha önce sabitlenmiş karbonu geri dönüştürmek için, C3 bitkileri çok organellar fotorespirasyon sürecini geliştirmiştir. Fotorespirasyon, 2PG'nin iki molekülünü, C3 karbon fiksasyon döngüsü^1'e tekrar girebilen bir 3-fosfogliserat (3PGA) molekülüne dönüştürür. Böylece, fotorespirasyon, daha önce sabitlenmiş karbonun sadece% 75'ini 2PG üretiminden dönüştürür ve süreçte ATP tüketir. Sonuç olarak, fotorespirasyon işlemi, su mevcudiyetine ve büyüme mevsimi sıcaklıklarına bağlı olarak, fotosentetik işlem üzerinde% 10 -% 50'lik önemli bir sürüklenmedir⁴.

Fotorespirasyonda yer alan enzimler on yıllardır araştırma odağı olmuştur, ancak en az 25 taşıma adımı^sürece dahil olmasına rağmen, genetik düzeyde sadece az sayıda taşıma proteini karakterize edilmiştir ^5,6,7. Fotorespirasyon sürecinde üretilen karbonun hareketine doğrudan dahil olan iki taşıma proteini, her ikisi de kloroplast ^5,6'dan glikolat ihracatında rol oynayan plastidik glikolat / gliserat taşıyıcı PLGG1 ve safra asidi sodyum simporter ^BASS6'dır.

Ortam [CO₂] altında, Rubisco bir oksijen molekülünü RuBP'ye zamanın yaklaşık% 20'sinde sabitler¹. Bitkiler düşük [CO 2] 'ye maruz kaldığında, fotorespirasyon oranları artar, bu da düşük [CO₂] 'yi, yüksek fotorespirasyon stresi altında önemli olabilecek mutantları test etmek için ideal bir ortam haline getirir. 24 saat boyunca düşük CO₂ altında ek varsayılan kloroplast taşıma proteini T-DNA hatlarının test edilmesi ve klorofil floresansındaki değişikliklerin ölçülmesi, fotorespirasyon mutant fenotip^5'i gösteren bass6-1 bitki hatlarının tanımlanmasına yol açmıştır. Daha ileri karakterizasyon, BASS6'nın kloroplastın iç zarında bir glikolat taşıyıcı olduğunu göstermiştir.

Bu makale, başlangıçta BASS6'yı kloroplast zarı içinde bulunan varsayılan taşıma proteinlerinin bir listesinden gelen bir fotorespirasyon taşıyıcısı olarak tanımlamak için kullanılana benzer bir protokolü ayrıntılı olarak açıklamaktadır⁸ Bu protokol, Arabidopsis T-DNA mutantlarını veya EMS tarafından üretilen mutant bitkileri, ısı gibi bir dizi abiyotik stres altında fotosentetik verimliliği korumak için önemli olan genleri tanımlamanın bir yolu olarak karakterize eden yüksek verimli bir deneyde kullanılabilir. yüksek ışık stresi, kuraklık ve CO₂ kullanılabilirliği. Klorofil floresansı kullanarak bitki mutantlarının taranması, geçmişte primer metabolizma için önemli olan genleri hızlı bir şekilde tanımlamak için kullanılmıştır⁹. Arabidopsis genomunun% 30'u bilinmeyen veya zayıf karakterize edilmiş fonksiyona sahip proteinleri kodlayan genleri içerdiğinden, fotosentetik verimliliğin strese bağlı analizi, mutant bitkilerde kontrollü koşullar altında gözlenmeyen moleküler fonksiyonlar hakkında fikir verebilir¹⁰. Bu yöntemin amacı, düşük CO₂ taraması kullanarak fotorespiratuar yolun mutantlarını tanımlamaktır. Düşük CO_2'ye maruz kaldıktan sonra fotorespirasyonu bozan mutantları tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemin bir avantajı, nispeten kısa sürede yapılabilecek fideler için yüksek verimli bir tarama olmasıdır. Video protokolü bölümleri, tohum hazırlama ve sterilizasyonu, bitki büyümesi ve düşük CO₂ arıtma, floresan görüntüleme sisteminin konfigürasyonu, işlenmiş numunelerin kuantum veriminin ölçülmesi, temsili sonuçlar ve sonuçlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlar.

1. Tohum hazırlama ve sterilizasyon

NOT: Tohum hazırlama, tohum imbibleme ve tohum sterilizasyonundan oluşur. Tüm bu adımların steril koşulları korumak için laminer bir akış davlumbazında gerçekleştirileceğine dikkat etmek önemlidir. Gerekli tüm malzemeler, reaktifler ve büyüme ortamları otoklavlanmalıdır ( bkz.

1. Tohum imbibasyonu ve tabakalaşması
   NOT: Kullanılan tohum hatları plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) ve wild tiptir (WT, Col-0).
   1. Tohumları 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine dağıtın. Tohumları steril suda laminer bir akış başlığına batırın ve 2 gün boyunca karanlıkta 4 ° C'de tabakalaştırın.
2. Tohum sterilizasyonu
   1. Steril koşullar altında, 10 mL% 50 (v / v) ağartıcı çözeltisi hazırlayın ve yaklaşık 20 μL Ara 20 ekleyin. Tohum sterilizasyonu için, emilen tohumlardan suyu çıkarın, mikrosantrifüj tüplerine 1 mL çamaşır suyu çözeltisi ekleyin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   2. Ağartıcı çözeltisini bir pipetle çıkarın.
   3. Tohumları yeniden sulandırmak için 1 mL steril suda durulayın. Tohumlar dibe çöktükten sonra suyu çıkarın. Adım 1.6 ve adım 1.7'yi yedi kez yineleyin.
   4. Tohumları steril% 0.1 agaroz çözeltisinde yeniden askıya alın.
3. Tohum kaplama
   1. 500 mL damıtılmış suya 5.43 g toz ekleyerek vitaminlerle 1 L hacimli Murashige & Skoog Bazal Medium ve 1.0 g / L 2-(N-morfonio) etansülfonik asit (MS) yapın. Potasyum hidroksit (KOH) kullanarak pH'ı 5,6 ila 5,8 arasında ayarlayın. Damıtılmış su kullanarak 1 L'ye kadar doldurun.
      1. Sıvı çözeltiyi 500 mL'ye bölün ve her yarısını manyetik bir karıştırma çubuğu içeren 1 L'lik bir şişeye yerleştirin. Her şişe için% 1'lik bir agar w / v çözeltisi elde etmek için 5 g agar tozu ekleyin.
      2. 121 °C'de otoklav ve 30 dakika boyunca 15 psi; daha sonra yavaşça karıştırırken oda sıcaklığına yerleştirin. Soğutulduğunda, kare bir Petri kabına 25 mL MS agar dökün. Katılaşmasına izin verin.
         NOT: Bu Murashige & Skoog Bazal Orta plakalar, test mutantlarının yetiştirilmesi için% 1 vitamin içeren MS ortamı ve% 1 agar içerir.
   2. 200 μL'lik bir pipet ucunu tıraş bıçağı ile kesin. 200 μL mikropipet kullanarak kare MS plakasının (Şekil 1) her test mutantı veya genotipi (1 ^{cm 2} kare) için belirlenen kare ızgaranın ortasına bir tohum yerleştirin.
      NOT: 1 cm x 1 cm kare ızgara, fideler arasında eşit bir mesafe bırakmaya ve üst üste binmeyi önlemeye yardımcı olur, bu da daha sonraki floresan görüntüleme ve analizinde önemli olacaktır.
   3. Tohumlar kaplandıktan sonra, sızdırmazlık sağlamak için kapağın etrafına cerrahi bantla sarın ve aşağıda açıklandığı gibi büyüme odasına yerleştirin.

2. Bitki büyümesi ve düşük CO₂ arıtımı

1. Bitkileri 7-9 gün boyunca 20 ° C'de 120 μmol · m ^{− 2}s ^{− 1 ve 16} saat karanlık 18 ° C'de 8 saatlik bir ışık döngüsü altında büyütün. Görüntüleme için yeterince büyük olup olmadıklarını belirlemek için bitkileri 6. günde kontrol edin. Kaplamadan sonraki 8. günde, bitkileri düşük CO_2'ye maruz bırakın.
2. Düşük CO₂ tedavisi
   1. 7-9 gün sonra, ortam büyüme odası koşullarından sekiz plakadan dördünü 20 ° C'lik fotorespiratuar koşullara, 200 μmol · m ^{− 2}s ^{− 1} sürekli ışık seviyelerine ve₁₂ saat boyunca düşük CO 2'ye yerleştirin.
   2. Düşük CO₂ koşulunu, kabın altına yerleştirilmiş 100 g soda kireci içeren hava geçirmez şeffaf bir kap kullanarak oluşturun. Kabı kontrol ile aynı büyüme odasına yerleştirin. Kontrol tesislerini 12 saat boyunca ortam CO 2'de ¹²⁰μmol·m−₂ s⁻1'in altında tutun.

3. Floresan görüntüleme sisteminin yapılandırılması

1. Floresan görüntüleme sisteminde kameranın altında ortalanmış bir test plakasını (bölüm 1 ve bölüm 2'ye göre hazırlanmış) sabit bir mesafeye yerleştirin.
2. Cihazın yazılımında, Canlı Pencere'ye gidin ve aktinik olmayan ölçüm flaşlarını açmak için Yanıp Sönüyor kutusunu işaretleyin.
3. Tam ve keskin bir görüntü görünene kadar Yakınlaştırma ve Odaklama araçlarına tıklayın. Bu amaçla, bitkiler ve kamera arasındaki mesafeyi ayarlamak için bir sahne veya raf kullanın. Tüm deneme boyunca yakınlaştırmayı, odağı ve kameradan uzaklığı sabit tutun.
4. El. Deklanşör değerini 0 olarak ayarlayın ve 200-500 dijital ünite aralığında bir floresan sinyali almak için Hassasiyet'i ayarlayın.
   NOT: Daha düşük bir El. Deklanşör değeri (0-1), ölçüm flaşlarının aktinik olmamasını sağlarken, daha yüksek bir değer (2) görüntünün çözünürlüğünü artıracaktır.
5. Bir ışık ölçeri fotoğraf makinesi ayarlarını yapmak için kullanılan konuma yerleştirin.
6. Canlı Pencerede, 800 ms süren doygun bir nabız başlatmak için Süper kutusunu işaretleyin. Yeni bir nabız için her seferinde kutuyu işaretlemeyi unutmayın.
7. Işık ölçer 6.000-8.000 μmol·m⁻²s⁻¹ okuyana kadar Süper darbenin göreli güç yüzdesini ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın.

4. Kuantum verim programını tasarlayın

1. Görüntüleme sistemi için standart işletim araçlarını içe aktarın.
   default.inc dosyasını dahil et
   light.inc dosyasını dahil edin
   NOT: Bu deneyde referans olarak kullanılan program sözdizimi bir FluorCam görüntüleme sistemi içindir.
2. Yapılandırılan ışık ayarlarına göre aşağıdaki global değişkenleri tanımlayın:
   Deklanşör = 0
   Hassasiyet = 40
   Süper = 65
3. Verileri günlüğe kaydetmek için zaman adımını ekleyin:
   TS = 20ms
4. Fo ölçümünü, karanlık uyarlanmış bir durumda floresan örnekleyerek toplayın.
   F0duration = 2s;
   F0period = 200ms;
   NOT: F0duration , karanlığa uyarlanmış floresanın kaydedildiği zaman aralığını tanımlar. F0period , karanlığa uyarlanmış floresan ölçümünün tekrarlandığı zaman aralığını tanımlar.
5. Fo ölçümlerini veri tablolarına kaydedin.
   <0,F0period.. F0duration>=>mfmsub
   <0'lar>->kontrol noktası,"startFo"
   =>checkpoint,"endFo";
   Burada < , > zamana göre endekslenen floresan değerleri kümesini temsil eder; => ölçümleri bir sistem dosyasında depolar; mfmsub, deneme için tüm veri kümesini temsil eder; ve checkpoint, startFo gibi belirli ölçümlerin verileri için bir alt küme oluşturur.
6. Doygun bir darbeden sonra floresan örnekleyerek Fm ölçümünü toplayın ve saklayın.
   PulseDuration=960ms; ##
   a1=F0duration + 40ms
   a2 = a1 + 480ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>checkpoint,"startFm"
   =>checkpoint,"endFm"
   =>checkpoint,"timeVisual";
   A1 ve a2'nin örnekleme süresini doygunluk darbesiyle koordine etmek için değişkenler olduğu durumlarda; a1, Fm ölçümünün başlangıç zamanını temsil eder; ve a2, nabzın orta nokta zamanını temsil eder.

5. İşlenmiş numunelerin kuantum veriminin ölçülmesi

1. İşlemden hemen sonra, karanlık adaptasyon için plakaları 15 dakika boyunca alüminyum folyo ile örtün. Fotosistem II'nin kuantum verimini nabız genliği modifiye edilmiş bir florometre ile ölçmek için folyoyu çıkarın. Ardından, fide plakasını doğrudan kameranın altına yerleştirin ve GitHub deposunda bulunan kuantum verim protokolünü çalıştırın.
2. GitHub'dan quantum_yield protokolünü indirin (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) veya bölüm 4'ten benzer şekilde tasarlanmış bir program kullanın. Klasör simgesine tıklayıp dosya konumuna giderek program dosyasını açmak için florometrenin yazılımını kullanın.
3. Kırmızı yıldırım simgesine tıklayarak kuantum verim programını çalıştırın.
4. Protokol tamamlandıktan sonra, ön analiz penceresine gidin. Plaka görüntüsündeki her fide için tüm pikselleri vurgulamak üzere Seçim Araçları'nı kullanarak plakayı tek tek fidelere bölün. Vurgulanan arka plan piksellerini kaldırmak için Arka plan hariç tutma'yı tıklayın ve yalnızca fide alanını bırakın.
5. Plaka görüntüsündeki her fide için floresan verileri oluşturmak üzere Analiz Et'e tıklayın. Tüm plakalar arasında tutarlı minimum ve maksimum değerleri görüntülemek için floresan değer aralığını manuel olarak ayarlayın.
6. Deneme sekmesinden Sayısal-Ortalama seçeneğine tıklayın | İhracat | Sayısal. Tüm veriler ve sütuna göre seçeneğini belirleyin ve her fide için QY ölçümlerini içeren bir metin dosyası oluşturmak üzere Tamam'ı tıklatın.

6. Veri dosyasını açma

1. Metin dosyasını analiz için bir e-tabloda açın. Alan numarasını, piksel boyutunu, Fm, Ft, Fq ve QY'yi gösteren başlıklardan, çekirdek genotip (WT veya test mutant) ve QYmax için alan numarasını tanımlayın. Önemi belirlemek için vahşi tipe göre çift yönlü bir t-testi yapın. Veriler, p-değerleri 0,05'in altında olduğunda önemli ölçüde farklı olarak yorumlanır.

Sonuçlar, WT ve test mutantlarının ortam ve düşük CO2 taramasından ham ve floresan görüntülerin plaka görüntülerini göstermektedir. Her plantlet, QY olarak verilen karşılık gelen floresan okumaları ile alan numarası ile etiketlenir. Veriler metin dosyası olarak dışa aktarılır ve analiz için bir elektronik tabloda açılabilir (bkz. Ek Tablo S1). Fotorespiratuar stres ile ilişkili genlerin pozitif ve negatif tanımlanmasını göstermek için plgg1-1 ve abcb26 mutant hatları seçildi. PLGG1, RuBP6'nın oksijenlenmesini takiben yolaktaki ilk taşıyıcıyı kodlarken, ABCB26'nın fotorespirasyon11'e dahil olduğu bilinmeyen bir antijen taşıyıcısını kodladığı düşünülmektedir. WT ve mutantların karanlığa uyarlanmış Fv/Fm QY verimlilikleri, kutu ve bıyık grafikleriyle görselleştirilir. WT ve test mutantları arasındaki istatistiksel farkı test etmek için, p değeri 0.05 < bir çift yönlü t-testi kullanılmıştır. Burada, tarama yönteminin verimliliğini kontrol etmek için test mutantları olarak QY Fv / Fm azaltılmış fotorespiratuar mutant çizgileri kullandık. Şekil 3B, plgg1-1 için değişken ila maksimum floresan (Fv / Fm) oranında önemli bir azalma olduğunu, ancak düşük CO 2'de abcb26 olmadığını göstermektedir. Bu sonuç, PLGG1'in fotorespirasyonda yer alan bir taşıyıcı olarak rolü ile tutarlıdır, abcb26 ise düşük CO2 koşulları altında WT kontrolünden farklı bir fenotip göstermez. Böylece, bu tarama yöntemi düşük CO2 taraması kullanarak fotorespiratuar mutantları tanımlayabilir.

Şekil 1: Çekirdek plaka düzeninin örnek şeması. Üst üste yerleştirilmiş altı tohumla iki teknik kopya gösterilir. Mutant tohumların üzerine yerleştirilen WT kontrol tohumları. Kısaltma: WT = wild type. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: 9 günlük fidelerin koyuluğa uyarlanmış Fv/Fm görüntüleri. Vahşi tip kontrol, ortam ve düşük CO 2'deki T-DNA mutant çizgileri ilekarşılaştırılır. Renk ölçeği, her fideninortalama F v / Fm'sini temsil eder. Ölçek çubuğu = 1 cm. Kısaltmalar: Fv/Fm = değişkenin maksimal floresan oranı; WT = vahşi tip; plgg1-1 = plastital glikolat/gliserat translokatör 1; abcb26 = ATP bağlayıcı kaset B26. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Floresan gözlemleri. (A) ortam ve (B) düşük CO2 koşullarında fideler üzerinde yapılan maksimum kuantum verimi (Fv / Fm) ölçümleri. Kutular iç çeyrekler arasındaki aralığı, kutuların içindeki çizgiler medyanları ve bıyıklar maksimum ve minimum gözlemleri temsil eder. * WT'ye göre çift yönlü t-testine göre anlamlı farkı gösterir (n > 44, p < 0.05; Ek Tablo S2). Kısaltmalar: Fv / Fm = değişkenin maksimum floresan oranı; WT = vahşi tip; plgg1-1 = plastital glikolat/gliserat translokatör 1; abcb26 = ATP bağlayıcı kaset B26. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Deneyde kullanılan tüm fide plakalarından derlenmiş floresan verileri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S2: İstatistikler, vahşi tip ve her iki mutant genotip arasındaki bir t-testinden raporlanmıştır. Mutantlar, p değeri 0.05'ten düşük olduğunda vahşi tipten önemli ölçüde farklı kabul edilir. Tablo A, ortam CO 2'de yetişen bitkiler üzerinde yapılan t-testlerini temsil ederken, Tablo B, düşük CO2'de yetişen bitkiler üzerinde yapılan t-testlerini temsil eder. t-Testi: eşit varyansları varsayan iki örneklem. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların rakip finansal çıkarları veya çıkar çatışmaları yoktur.