Yöntem makalesi

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

DOI:

10.3791/63805

⸱

29 Nisan 2022

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 2Norris Cotton Cancer Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, endojen fosfoprotein fosfatazların ve bunların hücre ve dokulardan etkileşen proteinlerinin zenginleştirilmesi ve kütle spektrometrisine dayalı proteomiklerle tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğu hücresel süreç dinamik protein fosforilasyonu ile düzenlenir. Proteinlerin dörtte üçünden fazlası fosforile edilir ve fosfoprotein fosfatazlar (PPP'ler) tüm hücresel serin / treonin defosforilasyonunun% 90'ından fazlasını koordine eder. Protein fosforilasyonunun serbestleştirilmesi, kanser ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların patofizyolojisinde rol oynamıştır. Yaygın aktivitelerine rağmen, PPP'leri kontrol eden moleküler mekanizmalar ve PPP'ler tarafından kontrol edilenler zayıf karakterizedir. Burada, fosfataz inhibitörü boncukları ve kütle spektrometresi (PIB-MS) olarak adlandırılan proteomik bir yaklaşım, PPP'leri, posttranslasyonel modifikasyonlarını ve interaktörlerini herhangi bir hücre hattı veya dokusunu kullanarak 12 saat kadar kısa bir sürede tanımlamak ve ölçmek için tanımlanmıştır. PIB-MS, endojen PPP'leri ve bunlarla ilişkili proteinleri (PPPome olarak adlandırılır) yakalamak ve zenginleştirmek için sefaroz boncukları üzerinde hareketsiz hale getirilmiş, seçici olmayan bir PPP inhibitörü olan mikrosistin-LR (MCLR) kullanır. Bu yöntem, PPP'lerin etiketli versiyonlarının eksojen ekspresyonunu veya spesifik antikorların kullanılmasını gerektirmez. PIB-MS, evrimsel olarak korunmuş PPP'leri incelemek ve mevcut defosforilasyon sinyalizasyonu anlayışımızı genişletmek için yenilikçi bir yol sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein fosforilasyonu, DNA hasarına verilen yanıt, büyüme faktörü sinyallemesi ve mitoz 1,2,3'ten geçiş dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çoğu hücresel süreci kontrol eder. Memeli hücrelerinde, proteinlerin çoğunluğu bir veya daha fazla serin, treonin veya tirozin kalıntısında fosforile edilir, fosfoserlerin ve fosfotreoninler tüm fosforilasyon bölgelerinin yaklaşık% 98'ini oluşturur 2,3. Kinazlar hücresel sinyalizasyonda kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, PPP'lerin dinamik hücresel süreçlerin düzenlenmesindeki rolü hala ortaya çıkmaktadır.

Fosforilasyon dinamikleri, kinazlar ve fosfatazlar arasındaki dinamik etkileşim ile kontrol edilir. Memeli hücrelerinde, serin / treonin fosforilasyonunu katalize eden 400'den fazla protein kinaz vardır. Bu bölgelerin% 90'ından fazlası, PP1, PP2A, PP2B, PP4-7,PPT ve PPZ 2,3'ten oluşan küçük bir enzim ailesi olan fosfoprotein fosfatazlar (PPP'ler) tarafından defosforile edilir. PP1 ve PP2A, bir hücre 2,3,4 içindeki fosfoserin ve fosfotreonin defosforilasyonunun çoğundan sorumludur. Kinazlar ve fosfatazlar arasındaki kayda değer sayı farkı ve PPP katalitik alt birimlerinin in vitro özgüllüğünün olmaması, kinazların fosforilasyonun ana belirleyicisi olduğu inancına yol açmıştır 2,3. Bununla birlikte, birçok çalışma, fosfatazların multimerik holoenzimlerinoluşumu yoluyla substrat özgüllüğünü oluşturduğunu göstermiştir 5,6,7,8,9. Örneğin, PP1, katalitik bir alt birimden ve belirli bir zamanda, 150'den fazla düzenleyici alt birim 6,7,8'den birinden oluşan bir heterodimerdir. Tersine, PP2A, bir iskele (A), bir düzenleyici (B) ve bir katalitik (C) alt birimi 2,3,9'dan oluşan bir heterotrimerdir. PP2A düzenleyici alt birimlerinin (B55, B56, PR72 ve striatin) dört ayrı ailesi vardır, her biri birden fazla gen, ekleme varyantı ve lokalizasyon paternleri 2,3,9'dur. PPP'lerin multimerik doğası, kinazların ve PPP katalitik alt birimlerinin sayısındaki boşluğu doldurur. Bununla birlikte, PPP sinyallemesini incelemek için analitik zorluklar yaratır. PPP sinyalini kapsamlı bir şekilde analiz etmek için, bir hücre veya doku içindeki çeşitli holoenzimleri araştırmak çok önemlidir. İnsan kinomunun incelenmesinde, multipleks inhibitör boncuklar veya kinoboncuklar olarak adlandırılan kinaz inhibitörü boncukların kullanılmasında, kinaz inhibitörlerinin boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirildiği ve zenginleştirilmiş kinazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisinin kullanıldığı kimyasal bir proteomik strateji kullanılarak büyük ilerlemeler kaydedilmiştir10,11,12,13.

PPP biyolojisini incelemek için benzer bir yaklaşım oluşturduk. Bu teknik, fosfataz inhibitörü boncuklar (PIB'ler) olarak adlandırılan mikrosistin-LR (MCLR) adı verilen hareketsiz, seçici olmayan bir PPP inhibitörü ile boncuklar kullanılarak PPP katalitik alt birimlerinin afinite yakalamasını içerir14,15. Protein aktivitesini veya lokalizasyonunu değiştirebilecek eksojen PPP alt birimlerinin endojen etiketlemesini veya ekspresyonunu gerektiren diğer yöntemlerden farklı olarak, PIB-MS, endojen PPP katalitik alt birimlerinin, bunlarla ilişkili düzenleyici ve iskele alt birimlerinin ve belirli bir zaman noktasında veya belirli tedavi koşulları altında hücrelerden ve dokulardan etkileşime giren proteinlerin (PPPome olarak adlandırılır) zenginleştirilmesine izin verir. MCLR, nanomolar konsantrasyonlarda PP1, PP2A, PP4-6, PPT ve PPZ'yi inhibe ederek PIB'leri PPPome16 için zenginleştirmede oldukça etkili hale getirir. Bu yöntem, hücrelerden klinik örneklere kadar herhangi bir başlangıç materyalinde kullanılmak üzere ölçeklendirilebilir. Burada, endojen PPPome ve modifikasyon durumlarını verimli bir şekilde yakalamak, tanımlamak ve ölçmek için PIB'lerin ve kütle spektrometresinin (PIB-MS) kullanımını ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

figure-introduction-1
Şekil 1: PIB-MS protokolünün görsel özeti. Bir PIB-MS deneyinde, hücrelerden tümörlere kadar çeşitli şekillerde örnekler elde edilebilir. Numune, PPP zenginleştirmeden önce toplanır, lize edilir ve homojenize edilir. PPP'ler için zenginleştirmek için, lizat, MCLR gibi bir PPP inhibitörü olan veya olmayan PIB'lerle inkübe edilir. PIB'ler daha sonra yıkanır ve PPP'ler denatüre koşullarında salınır. Numuneler, SP3 protein zenginleştirme, triptik sindirim ve tuzdan arındırma yoluyla deterjanların uzaklaştırılması yoluyla kütle spektrometresi analizi için hazırlanır. Numuneler daha sonra kütle spektrometresi analizinden önce isteğe bağlı olarak TMT etiketli olabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

PIB-MS, hücrelerin veya dokuların lizisini ve berraklaştırılmasını, lizatın PIB'lerle inkübasyonunu, elüsyonu ve batı lekelenmesi veya kütle spektrometrisine dayalı yaklaşımlarla elüatın analizini içerir (Şekil 1). Serbest MCLR'nin eklenmesi, spesifik PIB bağlayıcılarını spesifik olmayan interaktörlerden ayırt etmek için bir kontrol olarak kullanılabilir. Çoğu uygulama için, elüatlardaki proteinleri doğrudan tanımlamak için etiketsiz bir yaklaşım kullanılabilir. Nicelemede veya düşük bolluktaki türlerin tanımlanmasında daha fazla hassasiyetin gerekli olduğu durumlarda, kapsama alanını artırmak ve girişi azaltmak için tandem kütle etiketi (TMT) etiketleme ile daha fazla işlem kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: PIB'lerin üretimi, Moorhead ve ark. tarafından tanımlandığı gibi yapılır; burada 1 mg mikrosistin ve yaklaşık 6 mL sefaroz, 5 mg / mL17'ye kadar bağlanma kapasitesine sahip PIB'ler üretmek için birleştirilir.

1. Numune hazırlama

NOT: PIB-MS için tipik bir başlangıç miktarı, durum başına 1 mg toplam proteindir. Bu deney için, 1 mg proteini çıkarmak için yaklaşık 2.5 x 106 HeLa hücresi kullanıldı. Bu hesaplama, bir deneyde kullanılan her hücre hattı veya doku için yapılmalıdır18. Numune sınırlıysa ve 1 mg elde edilemezse, PPP alt birim tespitinde küçük bir kayıpla girdi miktarı azaltılabilir. Alternatif olarak, TMT etiketlemesi, tüm koşulların tek bir numunede karıştırılmasına izin vermek için kullanılabilir ve Adım 9'da gösterildiği gibi algılama hassasiyetini arttırır.

  1. Doku örnekleri veya hücre peletleri toplayın. Hücre peletleri için, oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca 277 x g'de santrifüjleme yoluyla hücreleri toplayın, ortamları çıkarın ve hücreleri 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Hücre peletleri birkaç ay boyunca -80 ° C'de saklanabilir.
  2. Lizis tamponunu (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, %0.5 Triton X-100 (vol/vol), 5 mM beta-gliserofosforik asit disodyum tuzu pentahidrat, 1:500 (vol/vol) proteaz inhibitörü kokteyli III) hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Tüm örnekleri lize etmek ve yıkamak için yeterince yapın. Durum başına 1 mg protein ile başlıyorsanız, lizis ve yıkamalar için numune başına yaklaşık 3 mL tampon yapın.
    NOT: Bu adımda belirtilen lizis tamponu, çözünmeyen membranı veya sitoiskeletle ilişkili proteinleri çözündürmek için yeterli olmayabilecek hafif bir deterjan çözeltisidir. Çözünürlüğü artırmak için diğer deterjanlar araştırılabilir. Bir dizi NaCl ve Triton-X-100 konsantrasyonu test edildi ve yukarıdaki konsantrasyonların düşük arka plan ve yüksek fosfataz alt birim bağlanması için en uygun olduğu bulundu.
  3. Numunelere soğutulmuş lizis tamponu ekleyin. 1 mg proteinin lizisi için 1 mL tampon kullanın. Numune donmuşsa, lizis tamponu ekleyin ve numunenin tampondaki buz üzerinde çözülmesine izin verin.
    1. Hücreler için, örnekleri sonifikasyon yoluyla homojenize edin ve hücreleri darbeler arasında buz üzerinde tutun. Örnekleri üç adet 15 s darbesi ile% 15 genlikte sonikleştirin. Bu, kullanılan sonikatöre bağlı olarak değişebilir (bkz.
    2. Dokular için, Adım 1.3.1'de açıklandığı gibi sonikleşmeden önce sıvılaştırılana kadar dokuyu öğütmek için önce bir Dounce doku öğütücü kullanarak numuneleri homojenleştirin.
  4. Homojenize edilmiş çözünmeyen döküntü numunesini, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 21.130 x g'de santrifüjleme ile netleştirin. Daha sonra, tüplerin yanında toplanan oluşan peletleri veya lipitleri bozmadan, lizatları yeni tüplere aktarın. İstenirse, berraklaştırılmış lizatın ön zenginleştirme örneğinin 100 μL'sini çıkarın ve -20 ° C'de saklayın. Lisatları buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun.
  5. Üreticinin talimatlarına göre, her numunenin küçük bir alikotu üzerinde biskinkoninik asit testi (BCA) gibi bir protein niceleme testi gerçekleştirerek her numunedeki toplam protein içeriğini belirleyin. BCA testi sırasında lizatların buz üzerinde tutulduğundan emin olun.
  6. BCA testini yaptıktan sonra, yeni tüplere eşdeğer miktarda protein aktarın ve her tüpün aynı protein konsantrasyonuna (örneğin, 1 mg / mL) sahip olmasını sağlamak için lizis tamponu ile seyreltin. Deney bir PPP inhibitörü kontrolü gerektiriyorsa, aynı protein içeriğine sahip her numunenin iki alikotunu hazırlayın ve Adım 1.7'ye geçin. PPP inhibitörü kontrolleri gerekli değilse, Adım 2'ye atlayın. Numunelerin buz üzerinde tutulduğundan emin olun.
    NOT: PIB-MS analizinde koşul başına eşit protein konsantrasyonlarının kullanılması çok önemlidir. PPP inhibitörü kontrolleri, PIB'lere spesifik bağlayıcıları spesifik olmayan arka plandan ayırt etmek için kullanılır.
  7. PPP inhibitörü kontrolü için, bir numuneyi serbest MCLR (1 μM) ile ve diğerine kontrol olarak eşit miktarda DMSO ile muamele edin. Numuneleri nazikçe vorteksleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    NOT: Lisatların MCLR muamelesi, PPP katalitik alt birimlerinin bağlanmasını bloke eder, ancak numunelerdeki PIB'lere spesifik olmayan bir şekilde bağlanan proteinleri bloke etmez. MCLR'yi toksik olduğu için kullanırken dikkatli olun. Malzeme Tablosundaki elleçleme önlemlerine bakın.

2. PIB'lerin hazırlanması

  1. Deneme için gereken PIB miktarını belirleyin. 1 mg protein için 1-3 μg PPP ve etkileşen proteinler elde edilebilir; boncuk kaybını en aza indirmek için numune başına en az 10 μL katı PIB reçinesi kullanın. PIB'lerin bağlanma kapasitesi 3-5 mg/mL 14,17'dir.
  2. Uygun miktarda PIB'yi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve hafifçe vorteks yaparak 0,5 mL lizis tamponu ile 3 kat yıkayın ve ardından yıkamalar arasında RT'de 30 s için 376 x g'de santrifüj yapın. Yıkamalar arasında lizis tamponunu çıkarırken boncukları pipetlemekten kaçının.
  3. Yıkanan PIB'lere uygun miktarda lizis tamponu ekleyerek% 50 PIB / tampon çözeltisi (vol / vol) yapın. PIB'leri yeniden askıya almak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet alın ve pipet ucunu bulamaçta döndürün.
  4. Bulamacın 20 μL'sini, zaten 0,5 mL lizis tamponu içeren yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. Tüpteki lizis tamponu, boncukların pipet ucundan atılmasına yardımcı olur. Her numune için eşit miktarda PIB içeren yeterli tüp olana kadar bunu yapın.
  5. Tüpleri RT'de 30 s için 376 x g'de döndürün. Tüm tüplerin eşit miktarda boncuk reçinesi içerdiğinden emin olun. Herhangi bir süpernatanı atın, sadece katı reçine ve her tüpte maksimum 50 μL lizis tamponu bırakın.

3. PIB'lerin lizatlarla inkübasyonu

  1. Lizatları Adım 1.6'dan aktarın. veya Adım 1.7. Adım 2'den itibaren PIB'leri içeren uygun şekilde etiketlenmiş tüpüne. Lisatı PIB'lerle 8 rpm'de 4 °C'de 1 saat döndürün.

4. PIB'lerin Yıkanması

  1. Boncukları toplamak için PIB'leri 376 x g'de 4 ° C'de 30 s için santrifüj yapın. İstenirse, zenginleştirme sonrası analiz için 100 μL'lik bir aliquot kaydederek süpernatanı çıkarın ve atın.
  2. PIB'leri boncuklara 0,5 mL lizis tamponu ekleyerek, tüpleri ters çevirerek (vorteks önerilmez), boncukları 4 ° C'de 30 s için 376 x g'de santrifüjleme ile toplayarak ve lizis tamponunu yerleşmiş boncuklardan çıkararak, boncuk peletini bozmamaya dikkat ederek 3x yıkayın.

5. PPP'lerin PIB'lerden çıkarılması

  1. Son yıkamadan sonra, PIB'lerin hiçbirini pipetlemeden lizis tamponunun mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. % 2 SDS (vol / vol) içeren elüsyon tamponu yapın ve PIB'lerin hacminin 4x-5 katı olacak kadar elüsyon tamponu ekleyerek PPP'leri PIB'lerden uzaklaştırın. Örneğin, 10 μL PIB kullanılıyorsa, 50 μL elüsyon tamponu kullanın. PPP'leri PIB'lerden uzaklaştırmak için PIB'leri 65 ° C'de elüsyon tamponu ile 1 saat boyunca inkübe edin.
  2. Elüsyondan sonra, tüpleri RT'de 30 s için 376 x g'de santrifüj ederek ve herhangi bir PIB aktarmamaya dikkat ederek elüatı ayrı bir tüpe pipetleyerek elüatı toplayın. Elüatı batı leke analizi veya kütle spektrometresi analizleri için kullanın. Elüatlar -20 ° C'de birkaç aya kadar saklanabilir.
  3. PIB'leri daha fazla kullanım için yeniden oluşturmak için, boncukları RT'de 1 saat boyunca 8 rpm'de döndürerek% 2 SDS (hacim / hacim) cinsinden inkübe edin. Yıkama başına 30 dakika döndürerek 25 mM Tris-HCl'de (pH 7.5) 3x-5x yıkayın. Tüm yıkamalardan sonra, PIB'leri sodyum azid (ağırlıkça% 0.05 ağırlıkça% 0.05) ile 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) depolama tamponunda saklayın.
  4. Elüatları batı lekelenmesi veya kütle spektrometrisi ile analiz edin. PIB elüatlarının kütle spektrometrisi analizi aşağıda açıklanmıştır.

6. Deterjanların çıkarılması

NOT: MS analizi için sıvıyı elüat numunelerinden çıkarmak için çeşitli yaklaşımlar kullanılabilir. Hughes ve ark. tarafından tanımlanan tek kaplı, katı fazlı geliştirilmiş numune hazırlamanın (SP3) iyi çalıştığını gördük19.

  1. Yukarıdaki Adım 5.2'den 50 μL eluata 0,5 μL SP3 boncuk ekleyin. SP3 boncuklarını 10:1 (μg:μg) veya en az 0,5 μg/μL oranında kullanın (stok çözeltisi 50 μg/μL'dir). Boncukları nazikçe vorteksleyin ve süzün.
  2. Boncuk-elüat karışımına %100 etanollük bir elüsyon hacmi ekleyin (örneğin; elüatın 50 μL'si kullanılmışsa, 50 μL'lik %100 etanol kullanın). Numuneleri, 24 ° C'de 1000 rpm'de sallanacak şekilde ayarlanmış bir termomikserde 5 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Tüm boncukları toplamak için manyetik bir tüp rafına yerleştirin. Boncuklar toplandıktan sonra, süpernatantı atın ve boncukları 0,5 mL% 80 etanol (hacim / hacim) 3x ile yıkayın. Yıkama için, boncukları girdap yaparak yeniden askıya alın, boncukları manyetik tüp rafına yerleştirerek toplayın ve süpernatantı yıkamalar arasında atın.
  4. Tüm etanol izlerini gidermek için boncukları 0,5 mL% 100 asetonitril (ACN) ile bir kez daha yıkayın, mümkün olduğunca fazla ACN'yi çıkarın.

7. Proteinlerin sindirimi

  1. 166 mM HEPES'te (pH 8.5) tripsinin 1:100 seyreltilmesini (son konsantrasyon 0.004 μg / μL) yapın ve bu tripsin çözeltisinin 30 μL'sini boncuklarla her tüpe ekleyin, vorteks yaparak geri alın.
  2. SP3-tripsin boncuk karışımını termomikserde 37 °C'de 1000 rpm'de 5 saat veya gece boyunca 30 °C'de inkübe edin. Boncukları toplamak ve sindirimi yeni tüplere çıkarmak için tüpleri manyetik rafa yerleştirin.
  3. Etiketsiz analiz için, %0,2'lik TFA (hacim/hacim) nihai konsantrasyonuna %20 trifloroasetik asit (hacim/hacim) ekleyerek reaksiyonu söndürün. Bir pH kağıdı ile her numunenin pH'ının 2-3 arasında olduğunu kontrol edin. Değilse, bu elde edilene kadar% 20 TFA'lık küçük ek alikotlar ekleyin. Numuneler, tuzdan arındırmadan önce uygun şekilde asitlendirilmelidir. Adım 8'e geçin.
  4. Numunelerin TMT etiketlemesi için asitleştirmeyin ve Adım 9'a devam edin.

8. Özetin tuzunu alma

  1. Rappsilber ve ark.20 tarafından açıklandığı gibi 200 μL MS solvent uyumlu ucu C18 reçinesi ile paketleyerek her numune için bir aşama ucu hazırlayın. İki C18 malzeme diskine basmak için kör uçlu bir iğne kullanın ve disklerin iğnede kalmasını sağlayın. Diskleri iğneden çıkarmak için ince bir tel piston kullanarak diskleri MS solvent uyumlu uca aktarın.
    NOT: Diğer pipet uçları, kütle spektrometrisi ile tespit edilebilen numunelere kimyasalları sızdırabileceğinden, protokolün bu noktasından MS çözücü uyumlu uçların kullanılması kritik öneme sahiptir.
  2. Her aşama ucunu 30 μL% 100 MeOH, daha sonra% 60 MeOH (hacim / hacim) ile 30 μL, ardından% 0.1 TFA'nın 30 μL'si (hacim / hacim) ile dengeleyin. Her çözeltiyi bir şırınga ile sahne ucundan geçirin. Gerekirse şırınga ve sahne ucu arasındaki teması artırmak için şeffaf bir filmle şırınganın ucuna bir pipet ucu takın. Sahne ucunun içindeki C18 malzemesinin kurumasına asla izin vermediğinizden emin olun.
  3. Adım 7.3'ten etiketli aşama ucuna asitlenmiş peptit sindirimi ekleyin ve sahne ucundan bir şırınga ile itin, yine sahne ucunun tamamen kurumasına izin vermemeye dikkat edin.
  4. Her numuneyi 30 μL% 0,1 TFA (hacim / hacim) ile 2 kat yıkayın. Her aşama ucuna 30 μL% 60 MeOH (hacim / hacim) ekleyerek ve hepsini şırınga basıncıyla uçtan yeni, etiketli bir tüpe atarak peptidleri her aşama ucundan uzaklaştırın. Bu, C18 malzemesinin tamamen kurutulduğu tek adımdır.
  5. Her numuneyi vakum santrifüjleme ile kurutun. Kurutulmuş peptitler birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir. Numuneler artık etiketsiz kütle spektrometresi analizi için hazırdır. Numunenin sadece yarısını kütle spektrometresinde analiz için, diğer yarısını ise gerekirse reenjeksiyon için kullanın. Analiz için uygun bir kütle spektrometresi yönteminin kullanıldığından emin olun.

9. TMT etiketleme

NOT: Tandem-kütle etiketi etiketleme, kantitatif analiz için numuneleri çoğaltmak için kullanılır. 0.8 mg'lık bir TMT reaktifi şişesi, 0.8 mg'a kadar protein21'i etiketlemek için yeterlidir. 1 mg protein ile başlayan bir PIB pulldown deneyinde, 1-3 μg fosfoprotein alt birimleri elde edilir. Aşağıdaki protokol 10 μg'a kadar protein için idealdir.

  1. 80 μL susuz ACN'de bir 0.8 mg TMT reaktifi şişesini yeniden oluşturun.
  2. Adım 7.4'teki her numuneyi 18 kanala kadar farklı bir TMT etiketiyle etiketleyin. Her numuneye hangi TMT etiketinin eklendiğini not ettiğinizden emin olun. Peptit sindirimine 2 μL TMT reaktifi ve 2 μL ACN ekleyin, karıştırmak için yavaşça vorteks, numuneyi toplamak için RT'de 30 s için 376 x g'de santrifüj yapın ve numuneyi etiketlemek için RT'de 1 saat inkübe edin.
  3. TMT etiketleme verimliliğini test etmek için, reaksiyonu söndürmek için 9 μL LC-MS sınıfı su ve 1 μL %10 hidroksilamin (vol/vol) içeren 0,5 mL'lik bir tüpte her etiketleme reaksiyonunun 1 μL'sini birleştirerek bir etiket kontrol numunesi alın. Kalan söndürülmemiş etiketli numuneleri -80 °C dondurucuya koyun. Etiketleme verimliliği değerlendirilirken numuneler birkaç gün saklanabilir.
  4. TMT etiket kontrol numunesini 30 μL% 0,1 TFA (hacim / hacim) ekleyerek asitleştirin. PH'ın 2-3 arasında olduğunu kontrol edin. Değilse, bu pH elde edilene kadar% 20 TFA (hacim / hacim) ekleyin. Adım 8.1.-8.5'te açıklandığı gibi kademe devrilme yoluyla etiket kontrol numunesinin tuzunu çözün.
  5. Etiketleme verimliliğini değerlendirmek için kütle spektrometresindeki TMT etiket kontrol numunesini analiz edin. Arama sonuçlarını peptid düzeyinde% 1'lik bir yanlış keşif oranına (FDR) filtreleyin ve etiketleme verimliliğini21,22 olarak belirleyin.
  6. Tamamen TMT etiketli peptitler, N-terminusta ve tüm lizinlerde TMT reaktifine sahiptir. TMT muhabiri iyon yoğunluklarını ölçün ve tüm kanallardaki toplam toplamlarını karşılaştırın. Tüm peptitlerin% >95'i etiketlendiğinde ve TMT raporlayıcı iyon toplamı yoğunlukları karşılaştırılabilir olduğunda numune yeterince etiketlenir.
    NOT: Eksik etiketlemenin yanı sıra, toplam TMT raportör iyon yoğunluklarındaki farklılıklar, 1 μL test numunesinin yanlış pipetlenmesinin sonucu olabilir. Aynı zamanda gerçek bir biyolojik gözlemi de yansıtabilir, bu durumda tüm kopyalar aynı davranışı göstermelidir.
  7. Söndürülmemiş numuneleri -80 °C depodan çıkarın ve çözün. Tam olarak etiketlenmemişlerse, yukarıda belirtildiği gibi numuneye uygun TMT reaktifinden 1 μL ekleyin, 1 saat inkübe edin ve TMT etiket kontrolünü tekrarlayın. Örnekler tam olarak etiketlenmişse, Adım 9.8'e geçin.
  8. Tamamen etiketlendiğinde, etiketlemeyi söndürmek için TMT reaksiyonlarına 2 μL% 10 hidroksilamin (hacim / hacim) ekleyin. RT'deki numuneleri 15 dakika boyunca inkübe edin. Söndürüldükten sonra, numuneler birkaç ay boyunca -80 ° C'de saklanabilir.
  9. Tüm söndürülmüş TMT kanallarını birleştirin ve reaksiyonu asitleştirmek için 2 μL% 20 TFA (hacim / hacim) ekleyin. Kombine reaksiyonun pH'ını kontrol ederek pH 2-3 arasında olduğundan emin olun. Değilse, istenen pH'a ulaşılana kadar% 20 TFA'lık küçük alikotlar ekleyin. Bu, uygun tuzdan arındırma için kritik öneme sahiptir.
  10. ACN'yi 30 dakika boyunca vakum santrifüjleme ile çıkarın ve numuneyi aşağıda açıklandığı gibi tuzdan arındırın.

10. TMT etiketli kombine numunenin tuzunun alınması

  1. Kombine TMT reaktifinin tuzunu gidermek için uygun protein kapasitesine sahip bir SPE C18 tuzdan arındırma plakası kullanın (bu uygulama için genellikle 2 mg sorbent yeterlidir). Kuyuyu 200 μL %60 MeOH (hacim/hacim) ve 200 μL %10 MeOH/%0,1 TFA (hacim/hacim) ile dengeleyin.
  2. Asitlenmiş TMT etiketli peptitleri Adım 9.10'dan yükleyin. tuzdan arındırma plakası üzerine. Numune kuyucuklarını 200 μL %10 MeOH/%0,1 TFA (hacim/hacim) ile 2 kat yıkayın.
  3. Peptitleri 100 μL% 60 MeOH (hacim / hacim) ile süzün. Numuneleri vakum santrifüjleme ile kurutun. Kurutulmuş, TMT etiketli numune birkaç ay boyunca -80 ° C'de saklanabilir.
  4. TMT etiketli numunenin kütle spektrometrisi analizi için, numunenin yarısını enjekte edin ve reenjeksiyon gerekiyorsa diğer yarısını kaydedin.
    NOT: Kütle spektrometresindeki enjeksiyon miktarları, belirli sütuna, cihaz kurulumuna ve numune tipine bağlı olarak değişecektir.

11. Veri analizi

NOT: Veri filtreleme ve çözümleme yöntemleri değişiklik gösterir ve bu protokolün kapsamı dışındadır, ancak bu protokolden kaynaklanan veri türüne özgü rehberlik sağlamak için analizle ilgili aşağıdaki notlar eklenmiştir.

  1. Ham kütle spektrometresi verilerini, kullanılan örnek hücrelerin veya dokunun kökenine bağlı olarak türe özgü bir proteom veritabanına karşı arayın. Burada, Kuyruklu Yıldız bir arama algoritması olarak kullanılmıştır23.
  2. Arama algoritmasına özgü parametreleri ayarlayarak arama sonuçlarını% 1 FDR ile filtreleyin22. Etiketsiz niceleme için, verileri ölçmek üzere MS1 tepe alanı ölçümlerini kullanın. TMT etiketli numunelerde, niceleme için MSn türetilmiş raporlayıcı iyon yoğunluklarını kullanın. İstatistiksel anlamlılık için, örnekleri biyolojik üçlü olarak analiz edin.
  3. PPP alt birimlerini ve bunların interaktörlerini de novo olarak tanımlamak için, MCLR ile inhibe edilmiş ve DMSO ile muamele edilmiş numunelerin üçlü biyolojik örneklerinin karşılaştırıldığından emin olun. PPPome'u farklı koşullar altında veya ilaç tedavisi üzerine karşılaştırmak için, her durumun veya ilaç tedavisinin biyolojik üçlüsünün üretildiğinden emin olun.
  4. Verileri, DMSO kontrolüyle tedavi edilen üç numuneden en az ikisinde yalnızca toplam peptid sayısı >1 olan proteinlerin mevcut olması için filtreleyin. MCLR rekabeti her zaman tüm katalitik alt birim bağlama ile rekabet etmez. Ayrıca, bazı PPP katalitik alt birimleri spesifik olmayan bir şekilde sefaroz reçinesine yapışabilir. Reçineye spesifik olarak bağlanmayan proteinleri filtrelerken her iki olasılığı da hesaba katmak için, MCLR ile muamele edilen durumda toplam peptid sayısı herhangi bir PPP katalitik alt biriminden daha yüksek olan proteinleri çıkarın.
  5. Keratin, kollajen, 40S ve 60S ribozomal proteinler ve PPP alt birimleri olmayan heterojen nükleer ribonükleoproteinler gibi yaygın kirleticileri analizden hariç tutun14.
  6. Yük bölümü24,25'teki Genel Matris Yükleme'ye tıklayarak filtrelenmiş verileri Perseus'a aktarın. Günlük2, Temel > Dönüştür'e giderek, verileri seçerek ve dönüştürme işlevini belirterek verileri dönüştürür, bu durumda log2(x).
  7. Normal Dağılımdan Eksik Değerleri Atama > Değiştir'e gidip verileri seçerek ve hesaplama için genişliği (varsayılan 0,3) ve aşağı kaydırmayı (varsayılan 1,8) belirterek normal bir dağılımdaki eksik değerleri ima edin. Normalleştir > Kantil Normalleştirme'ye giderek kantil normalleştirme gerçekleştirin.
  8. İlgili koşullar için log2 oranlarını ve Öğrencinin T-testi p-değerlerini hesaplayın. İlk olarak, Not Satırları'na giderek verilere açıklama ekleyin > Kategorik Ek Açıklama Satırları. İki örneklemli Testlere > Testler'e giderek ve karşılaştırılacak grupları, gerçekleştirilecek testi ve kesme için kullanılan çoklu hipotez testi düzeltme yöntemini seçerek T-testini gerçekleştirin.
    NOT: De novo tanımlama için, bir protein, MCLR ile muamele edilen DMSO koşuluna karşı bolluğu istatistiksel olarak anlamlıysa, spesifik olarak bağlı bilinen herhangi bir PPP alt biriminin minimum katlama değişiminden2 kat daha büyük bir log değişimi varsa, PPP ile etkileşime giren bir protein olarak kabul edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 2: Spesifik PIB bağlayıcılarının tanımlanması . (A) PIB-MS ile çeşitli doku tipleri veya hücreler analiz edilebilir. Biyolojik üçlüdeki HeLa hücreleri DMSO veya PPP inhibitörü MCLR ile tedavi edildi, PIB'lerle inkübe edildi ve LC-MS / MS ile analiz edildi. (B) DMSO ve MCLR ile tedavi edil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PIB-MS, PPPome'u çeşitli numune kaynaklarından tek bir analizde kantitatif olarak profillemek için kullanılan kimyasal bir proteomik yaklaşımdır. Kinomu incelemek için kinaz inhibitörü boncukları kullanarak ve kanser ve diğer hastalık durumlarında nasıl değiştiğini incelemek için çok fazla çalışma yapılmıştır10,11,12,13. Yine de, PPPome çalışması geride kalıyor. Bu yaklaşımın bu boşluğu doldura...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri ve çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.N.K., NIH R33 CA225458 ve R35 GM119455'in desteğini kabul eder. Kettenbach ve Gerber laboratuvarlarına yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetonitril (ACN)HoneywellAH015-4DİKKAT: ACN yanıcı ve zehirlidir; eldiven giyin ve kimyasal davlumbazda çalışın.
Susuz AsetonitrilSigma-Aldrich271004-100ML DİKKAT: ACN yanıcı ve zehirlidir; eldiven giyin ve kimyasal davlumbazda çalışın.
Tezgah üstü santrifüjEppendorfmodel no. 5424
Beta-gliserofosforik asit, disodyum tuzu pentahidratAcros Organics410991000
SantrifüjEppendorfmodel no. 5810 R 15 amp versiyonu
Damıtılmış su
DMSOFisher ScientificBP231-100
Dounce doku öğütücüFisherbrand Pelet Havaneli12-141-363
Empore katı faz ekstraksiyon diski, C18CDS Analitik76333-132
Eppendorf tüpleri, 1,5 mLEppendorf22363204KRİTİK : Diğer tüpler polimeri numuneye sızdırarak analizi kirletebilir.
Eppendorf tüpleri, 2 mLEppendorf22363352KRİTİK : Diğer tüpler polimeri numuneye sızdırarak analizi kirletebilir.
Ekstraksiyon plakasımanifoldu SularWAT097944
Falcon tüpleri, 50 mLVWR21008
Jenerik künt uçlu iğne ve piston
Jenerik manyetik ayırma rafı
HEPESSigma-AldrichH3375
Hidrojen klorür (HCl)VWRKimyasalları BDHBDH3028DİKKAT: HCl aşındırıcıdır; Eldiven giyin ve kimyasal davlumbazda çalışın.
Hidroksilamin çözeltisi %50 (ağırlık/hacim)Sigma-Aldrich467804
İnkübatör, 65 derece; CVWRmodel no. 1380FM
Koptec Saf Etanol, HPLCDecon LabsV1001
MetanolSigma-Aldrich34860-4L R:DİKKAT: MeOH yanıcı ve toksiktir; eldiven giyin ve kimyasal davlumbazda çalışın.
Mikrosistin LR (MCLR)Cayman Chemical10007188DİKKAT: MCLR toksiktir; tutarken eldiven giyin ve cilt temasından kaçının.
PBS, 1 kez; kalsiyum ve magnezyum olmadan, pH 7.4 & plusmn; 0.1Corning; 21-040-CV
MilliporeSigma MColorpHast pH test şeritleri ve gösterge kağıtları gibi pH test şeritleriFisher ScientificM1095310001
PIB'lerinüretilmesine ilişkin protokol için bakınız Moorhead ve diğerleri, 2007.
Pierce BCA Protein TestKiti Thermo Scientific23225
Pipet uçları, 10 μ LEppendorf22491504KRİTİK : Diğer uçlar polimeri numunelere sızdırarak analizi kirletebilir.
Pipet uçları, 1000 μ LEppendorf22491555KRİTİK : Diğer uçlar polimeri numunelere sızdırarak analizi kirletebilir.
Pipet uçları, 200 μ LEppendorf22491539KRİTİK : Diğer uçlar polimeri numunelere sızdırarak analizi kirletebilir.
plastik şırınga, 10 mLBD309604
Proteaz inhibitörü kokteyli IIIAraştırma Ürünleri UluslararasıP50700-1
Q Exactive Plus Hibrit Dört Kutuplu Orbitrap Kütle Spektrometresi, Oribtrap Füzyonu, Orbitrap Füzyon Lumonları veya Orbitrap Eclipse Tribrid Kütle Spektrometresi Thermo Scientific Soğutmalı
tezgah üstü santrifüjEppendorfmodel no. 5424 R
Döndürücü (Labquake Çalkalayıcı Döner Çeviri)Thermo Scientific13-687-12Q8 rpm dönüş
Numune toplama plakası, 96 kuyu, 1 mLSularWAT058957
SDSFisher ScientificBP1311-1
Sıralama sınıfı modifiye tripsinPromegaV511C
Sodyum azidEMD KimyasallarıSX0299-1DİKKAT: Sodyum azit patlayıcı ve toksiktir; eldiven giyin, kimyasal davlumbazda çalışın ve metallerle temastan kaçının.
Sodyum klorür (NaCl)Fisher ChemicalS27110
Sonicator (Branson dijital sonifier)model no. SFX 250
SPE C18 tuz giderme plakasıSular186001828BA
SpeedBeads manyetik karboksilat modifiye parçacıklar (SP3 boncuklar)Cytiva6.51521E+13
ThermomixerEppendorfmodel no. 5350
TMT10plex İzobarik Etiket Reaktif Seti artı TMT11-131C Etiket Reaktifi, 3 > Etiket başına 0,8 mgThermoFisherA37725
Trifloroasetik asit (TFA)HoneywellT6508-25MLDİKKAT: TFA aşındırıcıdır ve temas halinde cildi tahriş eder. Eldiven ve göz koruması giyin ve kimyasal davlumbazda çalışın.
Tris BaseResearch Products InternationalT60040
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Vakum santrifüjü ve buhar kapanıThermo Scientificmodel nos. SpeedVac SPD120 ve RVT5105
Vortexer (Vortex-Genie 2)Bilimsel Endüstriler
Su LC-MSHoneywellLC365-4
(MeOH) için 200 Korumalı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nilsson, J. Protein phosphatases in the regulation of mitosis. Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).
  2. Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
  3. Brautigan, D. L., Shenolikar, S. Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates. Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).
  4. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).
  5. Virshup, D. M., Shenolikar, S. From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover. Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).
  6. Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. The extended PP1 toolkit: designed to create specificity. Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).
  7. Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. 4D-networking by mitotic phosphatases. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).
  8. Heroes, E., et al. The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity. The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).
  9. Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer. Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).
  10. Bantscheff, M., et al. Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors. Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).
  11. Klaeger, S., et al. Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).
  12. Duncan, J. S., et al. Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer. Cell. 149 (2), 307-321 (2012).
  13. Cooper, M. J., et al. Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia. PLoS ONE. 8 (6), 66755(2013).
  14. Lyons, S. P., et al. A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).
  15. Nasa, I., et al. Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry. Science Signaling. 13 (648), (2020).
  16. Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse. Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).
  17. Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose. Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).
  18. Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).
  19. Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  20. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  21. Zecha, J., et al. TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach. Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
  22. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  23. Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool. Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).
  24. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  25. Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins. Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein FosforilasyonuPPP Etkile imcileriProteomik Yakla mFosfataz nhibit r BoncuklarEtiketsiz Nicelle tirmePosttranslasyonel ModifikasyonlarProtein DefosforilasyonuA Analizi

İlgili makaleler