Method Article

Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek

DOI:

10.3791/63807

⸱

May 20th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku kesitlerinin kalınlığı deri innervasyonunun morfolojik çalışmasını sınırladı. Mevcut protokol, konfokal mikroskopi altında kalın 300 μm doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için benzersiz bir doku temizleme tekniğini tanımlamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deri innervasyonu periferik sinir sisteminin önemli bir parçasıdır. Kutanöz sinir liflerinin incelenmesi hızla ilerlemiş olsa da, dağılım ve kimyasal özelliklerinin anlaşılmasının çoğu, ince doku kesitlerinde geleneksel histokimyasal ve immünohistokimyasal boyamadan kaynaklanmaktadır. Doku temizleme tekniğinin gelişmesiyle birlikte daha kalın doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerinin görüntülenmesi mümkün hale gelmiştir. Mevcut protokol, iki tipik kıllı ve göz kamaştırıcı cilt bölgesi olan sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisinden 300 μm kalınlığında doku kesitlerinde çoklu floresan boyamasını tanımlamaktadır. Burada, kalsitonin geni ile ilişkili peptid duyusal sinir liflerini etiketlerken, faloidin ve lenfatik damar endotelyal hyaluronan reseptörü 1 sırasıyla kan ve lenfatik damarları etiketler. Konfokal mikroskop altında, etiketli duyusal sinir lifleri tamamen daha uzun bir mesafeden takip edildi, derin kutanöz tabakada demetler halinde ve yüzeysel tabakada serbest stilde çalıştı. Bu sinir lifleri kan damarlarına paralel olarak koştu veya onları çevreledi ve lenfatik damarlar tüylü ve göz kamaştırıcı ciltte üç boyutlu (3D) bir ağ oluşturdu. Mevcut protokol, cilt innervasyonunu incelemek için metodoloji perspektifinden mevcut geleneksel yöntemlerden daha etkili bir yaklaşım sunmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vücudun en büyük organı olan ve çevreye anahtar bir arayüz görevi gören deri, birçok sinir lifi tarafından yoğun bir şekilde innerve edilir 1,2,3. Deri innervasyonu daha önce tüm deri ve doku kesitlerinde boyama gibi çeşitli histolojik yöntemlerle yaygın olarak çalışılmasına rağmen, 4,5,6, kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı etkili gösterimi hala bir zorluktur 7,8. Bu göz önüne alındığında, mevcut protokol, kalın doku bölümünde kutanöz sinir liflerini daha net sergilemek için benzersiz bir teknik geliştirmiştir.

Kesitlerin kalınlığına göre sınır nedeniyle, innerve deri sinir liflerinin gözlemlenmesi, elde edilen görüntü bilgisinden kalsitonin gen ile ilişkili peptid (CGRP) sinir lifleri ile lokal doku ve organlar arasındaki ilişkiyi doğru bir şekilde tasvir edecek kadar kesin değildir. 3D doku temizleme teknolojisinin ortaya çıkışı bu sorunu çözmek için uygulanabilir bir yöntem sağlar 9,10. Doku temizleme yaklaşımlarının hızla gelişmesi, son zamanlarda doku yapılarını, tüm organları, nöronal projeksiyonları ve bütün hayvanları incelemek için birçok araç sunmuştur11. Şeffaf cilt dokusu, kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için veri elde etmek için konfokal mikroskopi ile çok daha kalın bir bölümde görüntülenebilir.

Bu çalışmada, bir sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisi, tüylü ve göz kamaştırıcı cildin iki hedef bölgesi olarak seçilmiştir 3,4,7. Kutanöz sinir liflerini daha uzun bir mesafede izlemek için, cilt dokusu immünohistokimyasal ve histokimyasal boyama için 300 μm kalınlığında dilimlendi ve ardından doku temizleme tedavisi uygulandı. CGRP, duyusal sinir liflerini12,13 olarak etiketlemek için kullanıldı. Ek olarak, doku arka planındaki kutanöz sinir liflerini vurgulamak için, sırasıyla 14,15 kan damarlarını ve lenfatik damarları etiketlemek için falloidin ve lenfatik damar endotelyal hyalurondan reseptör 1 (LYVE1) daha fazla kullanılmıştır.

Bu yaklaşımlar, kutanöz sinir liflerinin yüksek çözünürlüklü bir görünümünü göstermek ve ayrıca derideki sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar arasındaki uzamsal korelasyonu görselleştirmek için uygulanabilecek basit bir yöntem sağladı; bu, normal cildin homeostazını ve patolojik koşullar altında kutanöz değişikliği anlamak için çok daha fazla bilgi sağlayabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Akupunktur ve Moxibustion Enstitüsü Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (referans numarası D2018-04-13-1). Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) uyarınca gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada üç yetişkin erkek sıçan (Sprague-Dawley, ağırlık 230 ± 15 g) kullanılmıştır. Tüm hayvanlar, kontrollü sıcaklık ve nem ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde barındırıldı ve yiyecek ve suya serbest erişime izin verildi.

1. Perfüzyon ve numune hazırlama

  1. Ötanazi indüklemek için sıçana intraperitoneal olarak 250 mg / kg tribromoetanol çözeltisi (bakınız Malzeme Tablosu) enjekte edin.
  2. Solunum durduktan sonra, sıçanın göğüs boşluğunu açmak için paslanmaz çelik cerrahi makas kullanın. Sol kardiyak ventrikül13 üzerinden 3 mL/dak oranında perfüze etmek için 20 G iğne kullanın ve 100 mL% 0.9 normal salin ve ardından 0.1 M fosfat tamponunda (PB, pH 7.4) 250-300 mL% 4 paraformaldehit kullanın (Şekil 1A, B).
  3. Perfüzyondan sonra, dorsum derisini ve tabanını arka pençeden çıkarmak için bir neşter kullanın.
    1. Dondurulmuş kesit gerektiren numuneler için, dokuları 2 saat boyunca 0.1 M PB'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin; daha sonra dokuları 0.1 M PB'de% 25 sakkarozda 4 ° C'de 24 saatten fazla bir süre kriyoprotect
    2. Doku temizliği gerektiren kalın kesitli numuneler için, dokuları 2 saat boyunca 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) içinde% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin; daha sonra dokuları 4 °C'de 1x PBS'de kriyoproteksiyon yapın (Şekil 1C-E).

2. CGRP, faloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama ve ardından doku temizleme tedavisi

NOT: CGRP, faloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama, doku temizleme tedavisini takiben 300 μm kalınlığındaki doku kesitlerinde tüylü ve göz kamaştırıcı derideki sinir liflerini, kan damarlarını ve lenfatik damarları ortaya çıkarmak için uygulandı.

  1. Agaroz çözünene kadar bir mikro fırında 2 dakika ısıtılarak 1x PBS'de% 2 agaroz hazırlayın (bkz.
  2. Yıkadıktan sonra, cilt dokularını 37 ° C'de% 2 agaroz içine gömün ve soğutma için buz kutusunun içine yerleştirin (Şekil 1F, G).
  3. Titreşimli mikrotom üzerine monte edilmiş dokuyu buzlu suyla sabitleyin ve enine yönde 500 μm kalınlığında dilimleyin. Titreşim dilimleyiciyi ayarlamak ve dilimlemeyi bitirmek için aşağıdaki parametreleri kullanın: hız, 0,50 mm/sn ve genlik, 1,5 mm (Şekil 1H-K).
  4. Dilimledikten sonra, agarozu bölümlerden çıkarın ve 1x PBS (pH 7.4) içeren altı delikli bir plakada saklayın (Şekil 1L).
  5. Doku kesitlerini 4 °C'de gece boyunca 1x PBS'de (TriX-PB) %2 Triton X-100 çözeltisi içinde inkübe edin. Aşağıdaki yordam için Şekil 2'ye bakın.
  6. Doku bölümlerini bloke edici tampona yerleştirin ve 4 ° C'de gece boyunca çalkalayıcı üzerinde 72 rpm'de döndürün.
    NOT: Bloke edici tampon bileşimi 1x PBS'de %10 normal eşek serumu, %1 Triton-X 100 ve %0,2 sodyum aziddir (bkz.
  7. Doku kesitlerini, mikrosantrifüj tüpündeki seyreltme tamponunda fare monoklonal anti-CGRP (1:500) ve koyun poliklonal anti-LYVE1 antikorunun (1:500) birincil antikorlarını içeren çözeltiye aktarın (bkz.
    NOT: Seyreltme tamponu bileşimi, 1x PBS'de% 1 normal eşek serumu,% 0.2 Triton-X 100 ve% 0.2 sodyum aziddir.
  8. Doku bölümlerini oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, ardından yıkama tamponunda 4 °C'de gece boyunca çalkalayıcıda tutun.
    NOT: Yıkama tamponu bileşimi 0,1 M PB'de (pH 7,4) %0,2 Triton-X 100'dür.
  9. Ertesi gün, doku kesitlerini eşek anti-fare IgG H & L Alexa-Flour488 (1:500) ve eşek anti-koyun IgG H & L Alexa-Flour405 (1:500) ve Alexa-Flour594 falloidin (1:1000) (bkz.
  10. Doku kesitlerini, oda sıcaklığında 1 saat, iki kez yıkama tamponu ile altı delikli bir plakada yıkayın. Doku bölümlerini çalkalayıcı üzerindeki yıkama tamponunda gece boyunca 4 ° C'de tutun.
  11. Doku kesitlerini doku temizleme reaktifine aktarın ( bakınız Malzeme Tablosu, hacmi numune hacminden beş kat daha fazlaydı) ve çalkalayıcı üzerinde 60 rpm'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca yavaşça döndürün.
    NOT: Bu tedaviden sonra doku kesitleri netleşir (Şekil 2B).
  12. Temizlenmiş dokuları slayta monte edin, dokuları bir ara parça ile daire içine alın ve boşluğu taze doku temizleme reaktifi ve örtü kayması ile yapıştırın.

3. Geleneksel yaklaşımı takiben CGRP, falloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama

NOT: Bir karşılaştırma olarak, aynı boyama geleneksel teknikler izlenerek 30 μm kalınlığında doku kesitlerinde de gerçekleştirilmiştir.

  1. Doku kesitlerini enine yönde bir mikrotom üzerinde 30 μm'de dilimleyin ve slayta monte edin.
  2. 0,1 M PB'de %3 normal eşek serumu ve %0,3 Triton X-100 içeren blokaj çözeltisi ekleyin ve bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  3. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve fare monoklonal anti-CGRP (1:500) ve koyun poliklonal anti-LYVE1 antikorunun (1:500) birincil antikorlarını içeren çözelti ile bölümleri, 4 ° C'de gece boyunca seyreltme tamponunda inkübe edin.
  4. Ertesi gün, doku bölümlerini 0.1 M PB (pH 7.4) ile üç kez yıkayın, eşek anti-fare IgG H & L Alexa-Flour488 (1: 500) ve eşek anti-koyun IgG H & L Alexa-Flour405 (1: 500) ve Alexa-Flour594 falloidin (1: 1000) sekonder antikorlarını içeren karışık çözeltiyi ekler ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  5. Mikroskobik gözlemden önce, bölümleri üç kez 0.1 M PB (pH 7.4) içinde yıkayın, ardından% 50 gliserin içindeki kapaklarla örtün.

4. Görüntüleme ve analizler

  1. Lekeli örnekleri floresan mikroskop altında gözlemleyin ve ardından konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri alın.
  2. Her 300 μm kalınlığındaki bölümden her biri 10 μm karede 30 görüntü (Z-yığınları ) yakalayın ve konfokal mikroskopi sisteminin görüntü işlemcisini kullanarak tek bir odak içi görüntüyü entegre edin (bkz.
    1. Üç boyutlu (3B) analiz için konfokal kurulumun görüntü işleme yazılımında aşağıdaki adımları gerçekleştirin: Başlangıç Odak Düzlemini Ayarlama | Bitiş odak düzlemi | ayarlama Adım boyutu | ayarlama Derinlik Deseni | Seçin Görüntü Yakalama | Z serisi.
      NOT: Mavi floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 401 nm ve 421 nm idi. Yeşil floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 499 nm ve 519 nm idi. Kırmızı floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 591 nm ve 618 nm idi. 152 μm, konfokal iğne deliğinin çapıdır (10x objektif lens, NA: 0,4). Görüntü yakalama çözünürlüğü 1024 × 1024 piksel idi.
  3. Geleneksel numuneler için (adım 3), her 30 μm kalınlığındaki bölümden 1 μm karede 30 görüntü (Z-yığınları) yakalayın ve bu görüntüleri yukarıda belirtildiği gibi ele alın (adım 4.1-4.2).
  4. Görüntü işleme sistemi ile görüntüleri 3D rekonstrüksiyon deseninde gösterin.
  5. Z-yığını konfokal görüntüleri Imaris 9.0'a içe aktararak 3B rekonstrüksiyonlar gerçekleştirin (hücre görüntüleme yazılımı, bkz. Malzeme Tablosu) ve leke yoğunluklarına göre yüzey işlemeleri oluşturun: Yeni yüzeyler ekleyin | Kaynak Kanal | Surface Detail (Yüzeyler Ayrıntısı) | pürüzsüz seçeneğindeki parametreleri belirleyin Mutlak Yoğunluk |'nin eşik seçeneğindeki parametreleri belirleyin Yüzeyleri Sınıflandırma | Bitirin.
  6. Hücre görüntüleme yazılımı ile pozitif sinir liflerinin yüzey alanında veri elde edin. İşlenen görüntü | İstatistik | Detaylı | Belirli Değerler | Hacim.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üçlü floresan boyama işleminden sonra, sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar, tüylü ve göz kamaştırıcı deride sırasıyla CGRP, faloidin ve LYVE1 ile açıkça etiketlendi (Şekil 3,4). Temizleme tedavisi ile, CGRP-pozitif sinir lifleri, faloidin-pozitif kan damarları ve LYVE1-pozitif lenfatik damarlar, cildin tüm yapısal bilgisini elde etmek için daha derin bir derinlikte görüntülenebilir (Şekil 3). Bu doku yapıları 3B bir düzende daha da...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, deri innervasyonunu daha iyi anlamak için daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan ve 3D görünüm ile daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan kullanılarak tüylü ve göz kamaştırıcı derideki kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı bir gösterimini sunmaktadır. 1-2 güne kadar antikor inkübasyon süresi ve gece boyunca temizleme işlemi önemlidir. Bu iki önemli adım, kalın kesitlerin immünofloresan boyama etkisini doğrudan etkiler. Hepsi kalın kesitler için uygun olmayan antikorların seçiminden başka bir sorun daha...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Tıp Bilimleri Akademisi İnovasyon Fonu (Proje Kodu no. CI2021A03404) ve Ulusal Geleneksel Çin Tıbbı Disiplinlerarası İnovasyon Fonu (Proje Kodu no. ZYYCXTD-D-202202).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x fosfat tamponlu tuzlu suSolarbio Yaşam BilimleriP1020pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-TribromoetanolSigma Yaşam BilimleriT48402-5G
Konfokal floresan mikroskobuOlympus CorporationFluoview FV1200
Eşek anti-fare IgG H & L Alexa-Flour488Abcam plc.ab150105
Eşek anti-koyun IgG H & L Alexa-Flour405Abcam plc.ab175676
EP tüpWuxi NEST Biyoteknoloji A.Ş.6150011.5 mL
Donma kademeli kayar mikrotom sistemiLeica BiosystemsCM1860
Imaris SoftwareOxford Instrumentsv.9.0.1
IRIS standart makasWPI (World Precision Instruments Inc.)
iSpacerSunJin Laboratuvarı co.IS005
Mikro forseps-StrRWDF11020-11
Fare monoklonal anti-CGRP antikoruSanta cruz biyoteknoloji, Inc.sc-57053
Nötr tamponlu FormalinSolarbio Yaşam BilimleriG2161%10
Normal eşek serumuJackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları017-000-1210 mL
Peristaltik pompaDaha Uzun Hassas Pompa Co., LtdBT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594Thermo Fisher ScientificA12381
RapiClear 1.52 çözümSunJin Lab co.RC15200110 mL
Düzenli agarozGen Şirketi LimitedŞirketi G-10
SEMKEN 1 x 2 Diş Doku Forseps-StrRWDF13038-12
Koyun poliklonal anti-LYVE1 antikoruR& D Sistemleri A.Ş.AF7939
Altı kuyulu plakaCorning Incorporated3335
Sodyum azidSigma Life ScienceS200225 g
SükrozSigma Life ScienceV900116500 g
Süper YapıştırıcıHenkel AG & Co.Pattex 502
Cerrahi SaplarRWDS32003-12
Triton X-100Solarbio Yaşam Bilimleri9002-93-1100 mL
ÜretanSigma Yaşam BilimleriU2500500 g
VANNAS yaylı makasRWDS1014-12
Titreşimli mikrotomLeica BiosystemsVT1200S
503242

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677(2019).
  2. Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181(2012).
  3. Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121(2021).
  4. Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
  5. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749(2014).
  6. Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406(2018).
  7. Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106(2017).
  9. Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
  10. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  11. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).
  12. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  13. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742(2021).
  14. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
  15. Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
  16. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  17. Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401(2016).
  18. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  19. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  20. Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
  23. Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
  24. Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308(2019).
  25. Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Skin InnervationHairy SkinGlabrous SkinTissue ClearingFluorescent StainingConfocal MicroscopySensory Nerve FibersBlood VesselsLymphatic VesselsCGRP Staining

Related Articles