3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Doku sferoidleri, dış kuvvetler olmadan kendi kendine bir araya gelen hücre süspansiyonları tarafından oluşturulan 3 boyutlu mikro dokulardır¹. Bu sferoidler, insan fizyolojik sisteminin temel özelliklerine benzerlikleri nedeniyle biyofabrikasyon protokollerinde yaygın olarak kullanılmaktadır ^2,3. Doku sferoidleri, geleneksel tek katmanlı hücre kültüründen daha benzer metabolizma, hücre iskeleti dinamikleri, hücre canlılığı ve metabolik ve sekresyon aktivitesi sağlar¹. Füzyon yetenekleri nedeniyle, gelişmiş biyolojik alaka düzeyine sahip karmaşık doku mühendisliği yapıları oluşturmak için yapı taşları (örneğin, biyo-baskı protokolleri) olarak da kullanılabilirler ^4,5.

Biyolojik ilgileri nedeniyle, doku sferoidleri, doku mühendisliği, ilaç geliştirme, hastalık modelleme ve nanotoksikolojik değerlendirme gibi çeşitli protokoller için biyoteknolojik bir araç olarak kullanılmış, zaman, alan maliyetleri ve hayvan testlerini azaltmıştır 3,6,7,8. Bununla birlikte, doku sferoidlerinin potansiyelini tam olarak keşfetmek ve bunlardan yararlanmak için, büyük ölçekli üretimlerini hedefleyen güvenilir ve tekrarlanabilir yöntemler son derece gereklidir ve bunlar devam eden bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Asılı damla, kaplanmış u şeklindeki dip kuyuları, mikroakışkanlar ve polimerik bir matris ^9,10 kullanma gibi çeşitli metodolojiler sferoidler üretir. Bu metodolojiler küresel üretim pazarının yolunu açmış olsa da, hala karmaşık, zaman alıcı, emek yoğun veya pahalıdır¹⁰.

Mevcut protokol, düşük maliyetli ve zaman etkin bir metodoloji kullanarak homojen doku sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini rapor etmektedir. 6 oyuklu plaka başına 4.716'ya kadar sferoid üretmek için 3D baskılı damga benzeri bir cihaz geliştirdik. Ayrıca, damga benzeri cihaz, farklı hücre kültürü plakaları için uygun, kuyu başına daha fazla sferoid üretecek şekilde uyarlanabilir. Kolayca sterilize edilebilir ve uzun süre tekrar kullanılabilir. Homojen doku sferoidlerinin verimli ve büyük ölçekli üretimi, kullanımlarını kliniklere çevirmek ve doku mühendisliği, ilaç geliştirme, hastalık modelleme ve isteğe bağlı kişiselleştirilmiş tıp gibi birçok endüstri alanına katkıda bulunmak için çok önemlidir.

Bu çalışma için L929 hücre hattı, fare fibroblastları kullanıldı. Damga benzeri 3D baskılı biyocihaz, ticari bir kaynaktan elde edildi (bkz. Protokol boyunca iyi hücre kültürü uygulamaları ve steril teknikler izlendi. Üretilen cihaz %70'lik alkol ile silinerek ve 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılarak sterilize edildi. Hücre kültürü ortamı ve çözeltileri, hücreler veya doku sferoidleri ile temas etmeden önce 37 °C'ye ısıtıldı. Protokolün şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Damga benzeri cihazdan yapışmayan kalıpların hazırlanması

1. Aşağıdaki adımları izleyerek% 2 (a / h) agaroz jeli hazırlayın.
   1. Agaroz tozunu fosfat tamponlu salin (1x PBS) içinde seyreltin ve elde edilen süspansiyonu dairesel hareketlerle homojenize edin.
      NOT: Bu çözelti bir cam şişeye yerleştirilebilir. Bu adımda, agaroz çözeltisi yarı saydam olmayacaktır.
   2. Cam şişeyi mikrodalgaya koyun ve 30 saniye bekletin. Her 5 saniyede bir mikrodalgayı durdurun, cam şişeyi çıkarın ve çözeltiyi dairesel hareketlerle manuel olarak homojenize edin. Isıtma işleminin, çözelti sıvı-berrak bir duruma ulaşana kadar gerçekleştirilmesi gerekir.
      NOT: Mikrodalga alternatifi olarak bir sıcak plaka da kullanılabilir. Isıtma işleminden sonra çözelti yarı saydam/berrak olmalıdır.
   3. Deney için planlanan 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL agaroz çözeltisi ekleyin.
   4. ~ 15 dakika veya agaroz katılaşana kadar bekleyin.
      NOT: Katılaşma süresini azaltmak için bir soğutma plakası kullanılabilir.
   5. 1-2 mL agaroz solüsyonu ekleyin ve cihazı yavaşça sıvı agarozun üzerine yerleştirin.
      NOT: Agaroz-cihaz arayüzünde hava kabarcıklarını önlemek için cihazın yerleşimi dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
   6. ~ 30 dakika veya agaroz katılaşana kadar bekleyin.
      NOT: Katılaşma süresini azaltmak için bir soğutma plakası kullanılabilir.
   7. Cihazı agarozdan yavaşça çıkarın.
      NOT: Kaldırma işlemi çok önemlidir. Agaroz özelliklerini sağlam tutmak için dikkatli bir şekilde çıkarılmalıdır; Aksi takdirde, agaroz bozulabilir.
   8. 2 mL DMEM ortamı ekleyin, 10 dakika bekleyin, ortamı atın ve yeni DMEM ile değiştirin. İyiliği düzgün bir şekilde yıkamak için bunu üç kez tekrarlayın.
   9. 2 mL DMEM ekleyin ve 6 oyuklu plakayı hücre tohumlanana kadar bir inkübatöre (% 5 CO₂ ve% 80 nemde 37 ° C'de) yerleştirin (Şekil 2A-F, Ek Video 1).

2. Doku sferoidlerinin oluşumu

NOT: Farklı hücre soyları farklı yapışma özelliklerine sahiptir. Bu nedenle, bu metodolojiyi kullanarak, bazı hücre türleri doku sferoidlerini düzgün bir şekilde oluşturmayabilir.

1. Geleneksel tek tabakalı kültürü takiben hücreleri büyütün (yani, hücreleri% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 μg / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş düşük glikozlu DMEM kullanarak hücre kültürü şişelerinde büyütün) (bkz. Hücreleri %5'lik bir CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de tutun ve birleşme oranının %80'ine ulaşana kadar izleyin.
2. İstenilen birleşmeye ulaştıktan sonra, hücreleri 1x PBS ile yıkayın.
   NOT: 25 cm'lik^2'lik mataralar için 5 mL, 75 cm'lik^2'lik mataralar için 10 mL, 150 cm'lik^2'lik mataralar için 15 mL kullanılması tavsiye edilir.
3. Ayrışma enzimini ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve% 80 nemde 2-5 dakika inkübe edin.
   NOT: Bu çalışmada ayrışma enzimi olarak 0.78 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ile %0.125 tripsin kullanılmıştır (bkz.
4. Hücrelerin hücre kültürü şişelerinden ayrılmasını gözlemleyin ve hücre ayrışma enzimini nötralize etmek için FBS ile desteklenmiş bir büyüme ortamı ekleyin.
   NOT: Bu çalışma için, düşük glukozlu DMEM ( Materyal Tablosuna bakınız)% 10 FBS ile desteklenmiş olarak kullanılmıştır.
5. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Ardından, hücreleri manuel olarak sayın.
6. Tüp başına 50 x 10⁵ hücre alın ve 5 mL 1x PBS ekleyin.
   NOT: Ekilen hücre sayısı, nihai doku sferoid çapını etkiler. Bu nedenle, daha büyük çaplı doku sferoidleri oluşturmak için hücre sayısı artırılabilir.
7. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
8. Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın, 1 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve çözeltiyi homojenize edin.
   NOT: Bu çalışmada, %10 FBS, 100 μg/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş, düşük glikozlu tam bir DMEM kültür ortamı kullanılmıştır.
9. 6 oyuklu plakadan (adım 1.1.9) 2 mL ortamı çıkarın ve 3D baskılı biyocihaz tarafından oluşturulan agaroz kalıbının merkezine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin (adım 1.1.7). Mikro rezeksiyonlarda hücreler çökelene kadar bekleyin (~ 20-30 dakika) ve kuyucuğa dikkatlice 1 mL hücre kültürü ortamı ekleyin.
   NOT: Bu adımda ekstra dikkatli olmak gerekir. Ortamın nazikçe eklenmesi, pipet ucunun kuyu duvarına yakın yerleştirilmesi ve küçük miktarlarda dağıtılması önerilir.
10. Doku sferoidlerinin oluşması için 6 oyuklu plakayı inkübatöre (%5 CO₂ ve %80 nemde 37 °C'de) yerleştirin (hücre tipine bağlı olarak yaklaşık 24-48 saat) (Şekil 3).
    NOT: Farklı hücre tipleri (örneğin, kanser hücreleri, birincil hücreler) farklı kendi kendine montaj kinetiğine sahiptir¹¹.

3D baskılı damga benzeri cihaz kullanılarak homojen mikro rezeksiyonların oluşturulması
3D baskılı damga benzeri cihaz, fotokürlenebilir bir reçine kullanılarak stereolitografi yöntemi12 ile başarıyla üretildi (Şekil 2A). Son cihaz, 1.3 mm yüksekliğinde ve 650 μm genişliğinde silindirik mikro pimlerden oluşuyordu (Şekil 2A). Yapışık olmayan mikro rezeksiyonlar üretmek için ana kalıp olarak kullanılması, geometrinin korunmasıyla sağlandı (Şekil 2B-F ve Ek Video 1). Cihazın kullanımı basitti, sterilize edilmesi kolaydı ve uzun vadede tekrar kullanılabilirdi. Ayrıca, farklı boyutlardaki kuyu plakaları (yani 6 kuyu, 12 kuyu, 24 kuyu, 96 kuyu) ve Petri kapları (yani 30 mm, 50 mm, 90 mm, 150 mm) için de ayarlanabilir. Burada, 6 oyuklu plaka için cihazla ilgili verileri gösteriyoruz. Kuyucuk başına 750 homojen mikro rezeksiyon veya 6 kuyu plakası başına 4.716 homojen mikro rezeksiyon üretti (Şekil 2C-D). Cihaz erken çekilirse yapışık olmayan kalıbın bozulması ve mikro rezeksiyon geometrisinin deformasyonu gibi dezavantajlar meydana gelebilir (Şekil 2G).

Doku sferoidlerinin büyük ölçekli üretimi
Hücreler, yapışmayan agaroz kalıpları üzerine ekildi, çökeltildi ve yaklaşık 24 saat sonra doku sferoidlerini oluşturdu. Sferoidlerin büyük ölçekli üretimi, şekillerini, boyutlarını (123 μm ± 3 μm) ve canlılıklarını koruyarak elde edildi (Şekil 3A-D). Bu metodoloji sferoid kültürünü aylarca destekledi (veriler gösterilmemiştir).

Şekil 1: Damga benzeri bir 3D baskılı biyocihaz kullanılarak doku sferoid üretiminin şematik gösterimi. Silindirik mikropinlerden oluşan biyocihaz, bir dizi üniform mikro rezeksiyon oluşturmak için yapışmayan bir hidrojeli (örneğin agaroz) kalıplar. Agarozun katılaşmasından ve hücre kültürü ortamı ile inkübasyon süresinden sonra (yeni yapışmayan kalıpları iklimlendirmek için), hücre süspansiyonu kalıpların üzerine ekilir ve hücreler toplanır, kendi kendine birleşir ve küresel bir şekle sıkıştırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Yapışmayan mikro kalıplı agaroz oluşturmak için ana kalıp olarak kullanılan 3D baskılı damga benzeri cihaz. (A) 3D baskılı damga benzeri cihaz. (B) Mikro rezeksiyonları oluşturmak için cihazın sıvı agaroz içine yerleştirilmesi. (C-E) Cihazın çıkarılmasından sonra homojen rezeksiyonlar oluşur. (E) Ölçek çubuğu = 200 μm. (F) Hücre kültürü ortamı ile inkübasyondan sonra mikro kalıplanmış agaroz (pembe renk: hücre ortamı). (G) Tamamen katılaşmadığında cihazın agarozdan çıkarılması, bozulmasına yol açar (oklu sarı çizgi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hücre tohumlaması ve sferoid oluşumu. Faz kontrast mikroskobu (A) mikro rezeksiyonlarda hücrelerin tohumlanmasından 0 saat sonra (rezeksiyonlar içindeki noktalar). (İ.Ö.) Sferoidler tohumlamadan yaklaşık 24 saat sonra oluştu. Ölçek çubuğu = 100 μm. (D) Kürelerin çapının grafik gösterimi, n = 4. Oluşan sferoidler şekil ve boyut olarak homojendir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: Damga benzeri cihazın çıkarılmasından sonra mikro kalıplanmış agaroz. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

3D baskılı pul benzeri cihazlar, Janaína Dernovsek'in kurucu ortağı ve inovasyon direktörü olduğu Bioedtech girişimi tarafından sunuldu. Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.