Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Hücreler, vezikül taşınması 1,2,3'ten mitoz ^4,5,6 sırasında kromozom ayrışmasına kadar çok çeşitli mekanik görevleri yerine getirmek için mikrotübül ağları kullanır. Moleküler motor proteinler kinesin ve dynein gibi mikrotübüllerle etkileşime giren proteinlerin çoğu, kuvvetler üretir ve mekanik yükler tarafından düzenlenir. Bu kritik moleküllerin nasıl çalıştığını daha iyi anlamak için araştırmacılar, boş adım atma hızları, süreçsellik ve bireysel proteinler için kuvvet-hız ilişkileri gibi kritik parametreleri doğrudan izlemek için optik tuzak ve TIRF mikroskobu gibi tek moleküllü biyofiziksel yöntemler kullandılar. En yaygın kullanılan deneysel geometri, motor proteinlerini doğrudan küresel geometrisi ve boyutu motor tahrikli taşımaya tabi tutulan vezikülleri taklit eden tuzak boncuklarına bağlamak olmuştur. Kinesin-1 7,8,9, kinesin-2 10,11,12, kinesin-3 13,14,15,16 kinesin-5 ^17,18, kinesin-8 ^19,20 dahil olmak üzere çok sayıda kinezin, ayrıca dynein ve dynein kompleksleri^{21,22, 23,24,25}, bu yöntemlerle çalışılmıştır.

Bununla birlikte, birçok hücresel süreçte, motor ve motor olmayan proteinler mikrotübülleri hem iz hem de kargo olarak kullanır^26,27. Dahası, mikrotübül filamentlerinin daha yüksek dereceli demetlere çapraz bağlandığı bu senaryolarda, bu proteinler tek birimlerden ziyade topluluklar olarak işlev görür. Örneğin, somatik hücrelerin bölünmesinde, yoğun filament ağları, mitotik iğ aparatını ^28,29,30 oluşturmak için kendi kendini organize eder. Polarlar arası iş mili mikrotübül ağı oldukça dinamiktir ve büyük ölçüde iş mili direktörlerine ve iş mili ekvatorunun yakınında üst üste binen artı uçlara işaret eden eksi uçlarla düzenlenmiştir. İş mili içindeki filamentler, kinesin-5 31,32,33, kinesin-12 34,35,36 ve kinesin-14 ^37,38,39 gibi motor proteinler veya PRC1 40,41,42,43 veya ^{NuMA 44,45} gibi motor olmayan proteinler tarafından çapraz bağlanır^{. 46}. Kutupsal akı gibi süreçler sırasında veya metafaz sırasında kromozom merkezlenmesini koordine ederken veya anafaz ^{47,48,49,50,51,52} sırasında kromozom ayrışmasını koordine ederken sıklıkla mekanik stres yaşarlar veya yaşarlar. Bu nedenle, mikron ölçekli iş mili aparatının mitoz yoluyla bütünlüğü, bu etkileşimli filamentler ağı tarafından üretilen ve sürdürülen itme ve çekme kuvvetlerinin dikkatlice düzenlenmiş bir dengesine dayanır. Bununla birlikte, bu mekanik düzenlemeyi araştırmak ve protein topluluklarının mikrotübül hareketlerini koordine etmek ve iş milini düzgün bir şekilde monte etmek için gereken kuvvetleri üretmek için nasıl uyum içinde çalıştığını açıklamak için gereken araçlar sadece yakın zamanda geliştirilmiştir ve dinamik mikrotübül ağlarını tanımlayan biyofiziksel kuralları anlamaya yeni başlıyoruz.

Bu makalenin amacı, çapraz bağlı mikrotübül çiftlerini in vitro olarak yeniden oluşturmak, bu demetleri hem mikrotübüllerin hem de çapraz bağlanan proteinlerin eşzamanlı floresan görselleştirmesine ve nano ölçekli kuvvet ölçümüne izin veren bir mikroskopi odasında hareketsiz hale getirmek ve bu verileri sağlam bir şekilde işlemek için gerekli adımları göstermektir. Floresan etiketli mikrotübülleri istikrarlı bir şekilde polimerize etmek, bağlantı için mikroskop kapakları hazırlamak, optik yakalama deneyleri için polistiren boncuklar hazırlamak ve doğrudan biyofiziksel manipülasyona izin verirken in vivo işlevlerini koruyan çapraz bağlı filament ağlarını bir araya getirmek için gereken adımları detaylandırıyoruz.

1. Mikrotübüllerin hazırlanması

NOT: GFP etiketli çapraz bağlama proteinleri kullanıldığında, kırmızı (örneğin, rodamin) ve uzak kırmızı (örneğin, biyotinile HiLyte647, metnin geri kalanında biyotinile edilmiş çok kırmızı olarak adlandırılır) mikrotübüllerin organik florofor etiketlemesi iyi çalışır. Görüntüleme sırasında yüksek kaliteli dörtlü bant toplam dahili yansıma floresan (TIRF) filtresi kullanılarak her üç kanal arasında minimum çapraz geçiş sağlanabilir.

1. GMPCPP mikrotübül tohum stoklarının hazırlanması
   1. 84 μL buz gibi soğuk 1x BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA; pH 6.8) içinde 1 mg etiketsiz liyofilize tübülin askıya alın, DTT kullanımdan hemen önce 1 mM'lik son konsantrasyona eklenir. 60 μg florofor etiketli liyofilize tübülini 6 μL soğuk 1x BRB80'de 1 mM DTT ile askıya alın. 60 μg biyotin etiketli liyofilize tübülini 1 mM DTT ile 6 μL soğuk 1x BRB80 içinde askıya alın.
   2. 1:10 etiketleme oranına sahip biyotinillenmemiş rodamin etiketli tübülin tohumu stoğu hazırlamak için, 0,5 mL'lik bir tüpe 84 μL etiketsiz tübülin, 6 μL florofor etiketli tübülin ve 10 μL 10 mM GMPCPP stok çözeltisi ekleyin. Hafifçe pipetleyerek iyice karıştırın ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Bu testler için GMPCPP polimerizasyonu tercih edilir, çünkü mikrotübüller GTP ile polimerize edildiğinden veya taksol atlandığından daha kararlıdır ve optik tuzak ile doğrudan manipülasyona elverişlidir.
   3. 1:10 floresan etiketleme oranına sahip biyotinile edilmiş uzak kırmızı etiketli tübülin tohumu stoğu hazırlamak için, 0,5 mL'lik bir tüpe 80 μL etiketsiz tübülin, 6 μL florofor etiketli tübülin, 4 μL biyotin etiketli tübülin ve 10 μL 10 mM GMPCPP stok çözeltisi ekleyin. Hafifçe pipetleyerek iyice karıştırın ve buz üzerinde tutun. Tohum stoğunu 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   4. Tübülin çözeltisini yüksek hızlı santrifüjleme için uygun bir polikarbonat tüpe aktarın. Mikrotübül polimerizasyonunu önlemek ve alikotasyon için süpernatantı geri kazanmak için tohum stoğunu 2 ° C'de 5 dakika boyunca ~ 350.000 x g'de santrifüj edin. Bu aşamada nihai tahmini tübülin konsantrasyonu ~ 50 μM'dir.
   5. 0.2 mL PCR tüpleri kullanarak, tohum stoğunun 2 μL alikotunu hazırlayın ve sıvı azotla dondurun. Alikotlar -80 ° C'de 6 aya kadar saklanabilir.
2. Mikrotübüllerin polimerizasyonu
   1. 500 μL 1x BRB80 hazırlayın ve buzun üzerine yerleştirin. Çözülmesi için biyotinile edilmiş uzak kırmızı ve biyotinillenmemiş rodamin tohumu stok alikotlarının her birini buz üzerine yerleştirin.
   2. Tohum stoklarını 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kuluçka süresinin sonunda, hemen her tüpe 26 μL 1x BRB80 ekleyin. Daha uzun mikrotübüller istenirse, BRB80'in hacmini 5-10 μL arttırırken, daha kısa mikrotübüller için polimerizasyon hacmini 5 μL azaltın.
   3. Mikrotübül tohum stoklarını bir su banyosunda 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin. 20 μM taksol çözeltisi üretmek için 298,5 μL oda sıcaklığında 1x BRB80 ve 1,5 μL 4 mM taksol stok çözeltisini birleştirin. 300 μL 1x BRB80 hazırlayın ve her iki tüpü de oda sıcaklığında tutun.
   4. Uygun bir yüksek hızlı rotoru 30 °C'ye ısıtın. Bu, 30 ° C'ye ayarlanmış bir masa üstü ultrasantrifüjde yapılabilir. Mikrotübülleri su banyosundan çıkarın ve 10-15 dakika boyunca bir tezgah üstünde oda sıcaklığında tutun.
3. Mikrotübüllerin açıklığa kavuşturulması
   1. Mikrotübül büyüme çözeltisine 100 μL oda sıcaklığında 1x BRB80 ekleyin ve tüpü ~10 kez hafifçe hafifçe sallayarak veya hafifçe pipetleyerek karıştırın. Mikrotübül büyüme çözeltisini bir polikarbonat santrifüj tüpüne aktarın.
   2. Santrifüjün dönüşüne göre dışa bakacak olan polikarbonat tüpün bir tarafını işaretleyin. Bu, küçük malzeme hacmi nedeniyle zar zor görülebilecek olan mikrotübül peletinin bulunmasına yardımcı olacaktır.
   3. Mikrotübül çözeltisini 30 ° C'de 10 dakika boyunca ~ 350.000 x g'de santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, mikrotübülleri içeren tüpü mümkünse bir pelet için kontrol edin. Son birkaç mikrolitre sıvı hariç tümünü, peleti rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın. Pelet açıkça görülmüyorsa, peletin bulunduğu alanı rahatsız etmemek için kılavuz olarak yapılan işaretlemeyi kullanın.
   4. Hemen mikrotübül tüpüne 100 μL 1x BRB80 + 20 μM taksol ekleyin. Bu doğrudan pelet üzerine eklenebilir; Peletin bu aşamada bozulması, arıtma işlemini önemli ölçüde etkilemez.
   5. Mikrotübülleri 10 dakika boyunca ~ 350.000 x g'de tekrar santrifüj yapın, tüpün işaretli bölümünün santrifüjün dönüşüne göre tekrar dışa doğru yönlendirildiğinden emin olun.
   6. Daha önce olduğu gibi birkaç mikrolitre çözelti dışında hepsini çıkarın, yine mikrotübül peletini bozmamaya dikkat edin. 1.3.4.-1.3.5 adımlarını yineleyin. ve daha sonra mikrotübül peletini 20-50 μL 1x BRB80 + 20 μM taksolde yeniden askıya alın.
   7. Yeniden süspansiyon hacminin çoğunu pipetleyerek, doğrudan pelet üzerine yavaşça çıkararak, 20-30x tekrarlayarak veya pelet tamamen yeniden askıya alınana kadar yeniden askıya alın. Bu, mikrotübülleri aşırı kuvvetli pipetleme ile kesmemek için dikkatle yapılmalıdır. Açıklığın boyutunu artırmak için pipet ucunun kesilmesi, mikrotübül kesmeyi azaltmak için de yardımcı olabilir.
   8. Floroforları ışıktan korumak ve tezgahın üstünde tutmak için tüpü folyoya sararak mikrotübülleri oda sıcaklığında saklayın. Mikrotübüller genellikle berraklaştırmadan sonra 2-3 gün boyunca kullanılabilir.
4. Mikrotübüllerin mikroskopi ile değerlendirilmesi
   1. 1 μL mikrotübül ve 9 μL oda sıcaklığı 1x BRB80 karıştırarak arıtılmış mikrotübül çözeltisinin 1:10 seyreltilmesini hazırlayın. Bu çözeltiyi hemen bir mikroskop sürgüsüne 10 μL pipetleyerek ve ardından bir kabak oluşturmak için damlacığın üzerine bir kapak kayması yerleştirerek görüntüleyin.
   2. Yüksek yoğunlukta 8-25 μm arasında değişen uzunluklarda mikrotübüllerin (yoğun bir ağda katmanlanmış tam görüş alanı başına birkaç yüz), floresan mikroskobu ve mikrotübül seyreltmesi ile temas halinde kapak kayma yüzeyine odaklanan 100x hedefi kullanılarak görselleştirildiğinde görülebildiğinden emin olun.

2. Pasifleştirilmiş kapak fişlerinin hazırlanması

1. Yıkama kapakları
   1. 18 mm x 18 mm kapak kapaklarını reaktif olmayan plastik raflara yerleştirin, ardından her rafı 100 mL'lik bir beherin içine yerleştirin. Kapak kaymalarının her iki tarafının temizlenmesi gerektiğinden, raflardaki yuva başına bir kapak fişi yerleştirin.
   2. Her sonikasyon döngüsü için verilen sırayla aşağıdaki çözeltilerin 50 mL'sini kullanarak 5 dakika boyunca bir banyo sonicator kullanarak sonicate: (1) deiyonize su (18.3 MΩ-cm dirençli), (2)% 2 Micro-90 çözeltisi, (3) deiyonize su, (4) taze hazırlanmış 0.1 M KOH, (5) deiyonize su (Şekil 1A). Kapak kapaklarının tamamen sıvı ile kaplandığından emin olun. Sonikasyon döngüleri arasında, rafı deiyonize suya 10-20x yukarı ve aşağı batırmak, suyu değiştirmek ve durulama işlemini 2x tekrarlamak için cımbız kullanarak her bir kapak kapağı rafını deiyonize suda durulayın.
   3. Kapakları 3 kat suda durulayın, ardından beherleri% 100 etanol ile doldurun ve rafları beherlere geri koyun. Beherleri bir duman davlumbazına taşıyın ve tüm kapak kaydırma raflarına yer açmak için yeterli doku mendili yerleştirin. Ardından, rafları cımbızla çıkarın ve mendillerin üzerine yerleştirin.
   4. Kuru bir azot gazı akışı kullanarak, etanolün kapaklarından ve raflarından kuruyana kadar üfleyin. Kalan etanolün beherlerden atılması ve benzer şekilde kuru azot gazı akışını kullanarak kurutulması (Şekil 1A).
2. Kapaklarda aminosilan yüzey fonksiyonelleştirmesi
   1. 50 mL'lik konik bir tüpe 40 mL aseton ve 400 μL APTES reaktifi ekleyerek, sıkıca kapatarak ve 10x'i ters çevirerek karıştırarak (3-Aminopropil) tietoksisilan (APTES) reaktif çözeltisi hazırlayın.
   2. Bir raf kapak kapağını ilgili kuru kabına taşıyın ve ardından APTES çözeltisine tamamen batırın. 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın (Şekil 1A). APTES ile işlenmiş rafı yeni bir kuru beher'e taşıyın ve 5 m boyunca kuluçka yapmak için APTES'e yeni bir raf taşıyın.
   3. İşlem görmüş rafı, Adım 2.1.2.'de açıklandığı gibi 10-20x batırarak deiyonize suyla durulayın, suyu 5x ile değiştirin. Tüm kapak kapakları tedavi edilip yıkanana kadar tekrarlayın.
3. Aminosilan yüzeyinin PEGilasyonu
   1. Biri %25 w/v PEG ile ~100 μL ve diğeri %10 w/v biotin-PEG ile ~10 μL olmak üzere iki PEG çözeltisi hazırlayın, her ikisi de taze hazırlanmış 0,1 M NaHCO_3'te asılı, 24 kapak kapağını kaplamak için yeterlidir. PEG'i tamamen çözmek için 0,1 M NaHCO 3 eklendikten sonra 20 s için 3.000 x_{g'de %25} PEG çözeltisini santrifüj edin; çözüm bulutlu kalabilir. Biotin-PEG'i nazik pipetleme ile karıştırın (Şekil 1B).
   2. PEG ve biotin-PEG çözeltilerinin bir karışımını, 33.3 kat hacimli PEG ila 1 hacimli biotin-PEG (örneğin, 100 μL PEG çözeltisi ve 3 μL biyotin-PEG çözeltisi) hazırlayın.
   3. Bir duman davlumbazında, birkaç steril ve tüy bırakmayan mendil yerleştirin. Kapak kaydırma raflarını mendillerin üzerine taşıyın ve daha önce olduğu gibi kuru bir azot gazı akışıyla kurulayın. Birkaç yeni ve kuru mendilde, çiftler halinde düzenlenmiş tamamen kurutulmuş kapak fişlerini yerleştirin ve her birini sağ alt köşede "b" gibi asimetrik bir sembolle etiketleyin. Bu işaretleme, kapak kapağının numune yüzeyinin karşısında olacak ve deneye müdahale etmeyecektir (Şekil 1B).
   4. Her çiftte bir kapak kapağını cımbızla çevirin. Her bir ters çevrilmiş kapak kapağının üzerine, 6 μL PEG / biotin-PEG karışımı yerleştirin ve ikinci kapak kapağını her iki "b" etiketi de dışa bakacak şekilde üstüne yerleştirin.
   5. Kapak kayma kenarlarını hizalayın ve kurumasını önlemek için nemlendirilmiş ve hava geçirmez bir odaya yerleştirin. Nem odasındaki kapakları oda sıcaklığında 3 saat boyunca inkübe edin.
   6. Kuluçkadan sonra, kapak kaymalarını nem odasından çıkarın, kapak kayma çiftlerini dikkatlice ayırın ve raflarına geri yerleştirin. Her rafı daha önce olduğu gibi deiyonize suda yıkayın, rafları cımbız kullanarak 10-20x batırın ve suyu toplam 5x değiştirin.
   7. Kapak kaymalarının tüm PEGile edilmiş kenarlarını aynı yöne bakacak şekilde yerleştirin, böylece iki PEGylated coverslip yüzeyi birbirine bakmaz. PEGile edilmiş yüzey tamamen kuruyana kadar çok yapışkan olacaktır, bu nedenle kapak kaymalarının temas etmesini önlemek için ekstra özen gösterin. Her rafı ve kapak kapaklarını kuru azot gazı akışı kullanarak önceki gibi kurutun (Şekil 1B).
   8. Kapaklar ve rafları tamamen kuruduktan sonra, yüzey kaplamasının bozulmasını önlemek için vakumlu bir kurutucuda saklayın. Nemin PEG kaplamayı bozmasını önlemek için vakum altında ve kurutucu ile uygun şekilde saklanır; coverslipler yaklaşık 1 hafta boyunca kullanılabilir.

3. Kinezin kaplı boncukların hazırlanması

1. Rigor kinesin yapısının seçimi ve hazırlanması
   1. Rigor kinesin yapılarını yayınlanan protokollere göre eksprese edin ve saflaştırın^53,54. 0.02 mg/mL kinezin çözeltisinden 5 μL alikotu flaşla dondurun ve -80 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
      NOT: Rigor kinesin proteinleri, ATP hidrolizini önleyen bir G234A nokta mutasyonuna sahiptir. Mikroboncuklara konjuge edildiğinde, mikrotübül ile yüksek afiniteli etkileşimler, boncukların birkaç dakika boyunca 10-20 pN yükleri sürdürmesine izin verir. Hem yaygın olarak kullanılan kinesin-1 homodimer K560^53'ün hem de daha da optimize edilmiş bir K439 yapı^55'in titiz mutasyona uğramış versiyonları da bu tahlillerde başarı ile kullanılmıştır⁵⁴. Bu geliştirilmiş K439 yapısı, stabiliteyi arttırmak için bir EB1 dimerizasyon alanı ve aşağıda açıklandığı gibi 6-His antikoruna spesifik bağlanma için bir C-terminal 6-His etiketi içerir.
2. 6-Streptavidin kaplı boncuklara karşı antikoru
   1. 0,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 50 μL 1 μm çapında streptavidin kaplı polistiren boncuklar ekleyin. 30 s için sonikat.
   2. 790 μL 1x BRB80'e 10 μL 200 mM DTT ekleyin. Bu 1x BRB80 + 2.5 mM DTT tamponunun 40 μL'sine 10 μL sonik boncuk ekleyin.
   3. 1 μL biyotinile 6-His antikoru ve 49 μL 1x BRB80 + 2.5 mM DTT'yi birleştirin; vorteks kısaca karıştırmak için.
   4. 50 μL seyreltilmiş boncuk karışımını ve 50 μL antikor seyreltmesini yeni bir tüpte birleştirin. Tüpü 4 ° C'de bir tüp rotatöre yerleştirin ve 1 saat boyunca döndürün. Boncuk karışımını 4 ° C'de 3.000 x g'de 10 dakika boyunca döndürün.
   5. Süpernatanttan pipet alın ve peleti 1x BRB80'de 100 μL 2 mg/mL kazein çözeltisinde yeniden askıya alın. Bu santrifüjleme ve yeniden süspansiyonu 2x tekrarlayın.
3. Rigor kinesin ilavesi
   1. Son peleti 100 μL 2 mg/mL kazein çözeltisi içinde yeniden askıya alın. 0,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 5 μL 0,02 mg/mL rigor kinesin ve 5 μL boncukları birleştirin, tüpü ~10x hafifçe hafifçe sallayarak hafifçe karıştırın.
   2. Hem K439 G234A boncuk süspansiyonunu hem de kalan 6-His boncuklarını rotorda kullanılmadığında 4 °C'de tutun. Boncuklar taze hazırlanmalı ve deneyler için aynı gün kullanılmalıdır, çünkü bu sürenin ötesinde kümelenme ve aktivite kaybetme eğilimindedirler.

4. Mikroskopi odasının montajı

1. Cam slaytların hazırlanması ve oda yapımı
   1. 75 mm x 25 mm mikroskop camı slaytlarını önce ultra saf suyla, ardından çizgisiz amonyak-d cam temizleyiciyle ve ardından bir kez daha ultra saf suyla durulayın. Fazla su damlacıklarını çıkarmak için çalkalayın. Slaytları bir azot akışı kullanarak kurutun, böylece hiçbir çizgi kalmaz ve slaytları bir kağıt havluya koyun (Şekil 2A).
   2. Makasla, çift taraflı bandı ~ 2-3 mm x 2,5 cm'lik şeritler halinde kesin (tek oda başına 2 şerit ve çift oda başına 3).
   3. Forseps kullanarak, bir cam slayt üzerine iki bant şeridi yerleştirin, böylece tek bir oda oluşturmak için aralarında ~ 0,5 cm boşluk kalır. Çift bölmeler için, aynı aralığı kullanın, ancak üç şerit bant ile (Şekil 2B). Bu yöntemi kullanan örnek kanalın hacmi yaklaşık 10 μL'dir.
      NOT: Oda(lar) ne kadar geniş olursa, çözeltiler içeri akıtıldığında kabarcıkların oluşma olasılığı o kadar artar; Bununla birlikte, 0,5 cm'den daha az genişliğe sahip odalar, görüntüleme için azalan alan nedeniyle kullanımı zor olabilir.
   4. Forseps kullanarak her bant şeridinin uzunluğu boyunca kazıyın, böylece bant cam slayda sıkıca yapışır.
   5. Kurutucudaki basıncı serbest bırakın ve bir saklama rafından bir biyotinillenmiş kapak kaymasını çıkarmak için forseps kullanın. Forseps kullanarak cam sürgü üzerine bir biyotinillenmiş kapak kayması yerleştirin. Biyotinillenmiş tarafın içeriye, cam kızağa doğru baktığından emin olun.
   6. Forsepslerin düz arka ucunu kullanarak, odaları güvenli bir şekilde kapatmak için kapak kaymasının banda temas ettiği cama hafifçe bastırın. Kapak kaymasının çatlamamasını sağlamak için hafif basınç kullanılmalıdır (Şekil 2C).
   7. Bitmiş mikroskopi odalarını, kullanıma kadar doğrudan ışıktan uzak, hava geçirmez bir kapta saklayın (Şekil 2D).
      NOT: Biyotinillenmiş kapak kızakları havaya maruz kaldıklarında bozulduğundan, odaların yapıldığı gün kullanılması önerilir.
2. Mikroskopi reaktiflerinin akışı
   1. Boş bir pipet ucu kutusunun altına ultra saf suyla nemlendirilmiş katlanmış tüy bırakmayan bir doku yerleştirerek bir nem odası oluşturun. Numune odaları, çözeltilerin kanaldan buharlaşmasını azaltmak için akış adımları arasında bu kutuda tutulmalıdır.
   2. Kanalın bir ucundaki sıvıyı pipetleyerek ve diğer ucundaki sıvıyı fitil ederek tüm reaktifleri tanıtın. Fitillemek için, dokunun bir ucunu bükün ve yavaşça odanın çıkış tarafına yerleştirin, böylece kılcal hareketin reaktifi homojen bir şekilde dağıtmasına izin verin (Şekil 3A). Mikrotübül depolimerizasyonunu önlemek için tüm reaktifleri akmadan hemen önce oda sıcaklığına getirin.
   3. Bir haznenin giriş tarafına değecek şekilde 20 μL açılı pipet ucu kullanarak, 10 μL 0,5 mg/mL streptavidin veya Neutravidin içinde yavaşça akıtın. Haznede kabarcık elde etme olasılığını azaltmak için daha küçük pipet uçları ve yavaş, sabit bir reaktif akışı kullanın (Şekil 3B).
   4. Nem odasındaki kaydırağı, odanın kapak kaydırma tarafı aşağı bakacak şekilde 4 dakika boyunca inkübe edin. Bu yönelim, mikrotübüller veya boncuklar gibi daha büyük nesnelerin PEGile yüzeyin yakınında batmasına izin verecektir.
   5. Sıvıları dışarı çekmek için tüy bırakmayan bir doku kullanarak odayı 20 μL 1x BRB80 kullanarak yıkayın. Odada bir sızıntı varsa, slaytı atın ve başka biriyle başlayın; Odada meydana gelen küçük kabarcıklar görüntülemeyi zararlı bir şekilde etkilemeyecektir.
   6. Akış, inkübasyon ve yıkama adımlarını 10 μL 0,5 mg/mL kazein bloke çözeltisi ile tekrarlayın (Şekil 3C). Biyotinile edilmiş uzak kırmızı mikrotübülleri ~ 1:20 seyreltin ve odaya 10 μL akıtın. 5 dakika boyunca inkübe edin ve odayı 20 μL 1x BRB80 ile yıkayın (Şekil 3D). Bu mikrotübüllerin 100 μm x 100 μm görüntüleme alanı içindeki optimal yoğunluğu 10-20 olmalıdır; ve bu aşamadaki seyreltme, bu yüzey bağlama oranını elde etmek için ayarlanmalıdır.
   7. Akış, inkübasyon ve yıkama adımlarını, incelenecek uygun bir konsantrasyonda (tipik olarak 1-10 nM) çapraz bağlanan motor veya motor olmayan proteinin 10 μL'si ile tekrarlayın (Şekil 3E).
   8. 10 μL rodamin mikrotübüllerindeki akış, önceki biyotinile edilmiş uzak kırmızı mikrotübüllerle benzer bir konsantrasyonda seyreltilir. Kuluçka ve yıkama adımlarını tekrarlayın (Şekil 3F).
   9. Çapraz bağlama protein aktivitesi için optimize edilmiş 1 μL rigor kinesin kaplı boncuk ve 19 μL reaksiyon tamponunu birleştirin. Örneğin, kinezin-5 aktivitesinin analizi için, 1x BRB80'de istenen konsantrasyonda (örneğin, maksimum kinesin hızı koşulları için 1 mM) 1 mM TCEP bağ kırıcı, 0.2 mg / mL alfa kazein, 70 mM KCl, oksijen süpürme sistemi (4.5 mg / mL glikoz, 350 birim / mL glikoz oksidaz, 34 birim / mL katalaz), 1 mM DTT ve ATP ile istenen konsantrasyonda (örneğin, maksimum kinesin hızı koşulları için 1 mM) reaksiyon tamponu kullanın ). Motor olmayan proteinlerin analizi için, ATP'yi atlayın ve bu testlerde protein-mikrotübül etkileşim gücünü modüle etmek için KCl konsantrasyonunu değiştirin.
   10. Odanın her iki kenarını şeffaf oje ile kapatın ve görüntülemeden önce cila kuruyana kadar bekleyin (Şekil 3H). Başarılı bir şekilde inşa edilmiş bir oda, sızıntı mevcut olmayacak ve minimum kabarcıklara sahip olacaktır.

5. 3 renkli TIRF ile görüntüleme mikrotübül demetleri

1. TIRF görüntüleme yeteneklerine sahip ve içine tek ışınlı optik tuzak inşa edilmiş ters çevrilmiş bir mikroskop cihazı kullanın (Şekil 4).
   NOT: Burada açıklanan çalışmalar için, GFP etiketli protein, rodamin etiketli mikrotübüller ve biyotinile edilmiş uzak kırmızı etiketli mikrotübüller için sırasıyla 100x / NA1.49 yağ objektif lens, TIRF modülü ve 488 nm, 561 nm ve 640 nm'de üç lazer ile ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılmıştır.
   1. Numune odasının kapak kapağına bir damla daldırma yağı ekleyin. Aşırı yağ mikroskop hedefine zarar verebilir. Numune odasının kapak kaydırma tarafı aşağı bakacak şekilde, görüntülenecek numuneyi mikroskop platformuna yerleştirin.
   2. Hedefi yavaşça yukarı kaldırın, böylece hem kapak kayması hem de amaç arasında yağ yoluyla temas olur. Objektif yüksekliği, numune odasının kapak kaydırma yüzeyi odakta olacak şekilde ayarlayın.
   3. Numunenin tek karelik görüntülerini üç kanalın hepsine kaydedin. Buradaki deneyler için, her üç kanalda da optimal görüntüleme süresi olarak 100-200 ms maruz kalma kullanın; daha uzun pozlama süreleri fotobeyazlatmanın artmasına neden olabilir.
   4. Numunelerden iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için lazer gücünü ayarlayın ve bireysel demet test edildiğinde 2-5 dakika boyunca fotobeyazlatmayı en aza indirin. Burada kullanılan lazer için (Şekil 4 ve Şekil 5), GFP kanalı için 5 mW ve her iki mikrotübül kanalı için 3 mW'lık bir lazer gücü optimum olarak kullanın.
      NOT: Başarılı bir şekilde monte edilmiş demetler, uzak kırmızı kanalda bir yüzey immobilize mikrotübül, önemli GFP-protein sinyaline sahip birkaç mikronluk bir kogentansiyon bölgesi ve bu bölgelerle örtüşen ve daha sonra demetten birkaç mikron uzağa uzanan bir rodamin mikrotübülünden oluşmalıdır (Şekil 5B, C ve Şekil 6 ). Rodamin mikrotübülünün canlı görüntülenmesi, çapraz bağlı olmayan mikrotübül ucundaki ince dalgalanmaları ortaya çıkarmalı ve bu filamentin yüzeye veya odadaki diğer proteinlere bağlı olmadığını göstermelidir.
   5. Görüş alanı başına mikrotübül demetlerinin frekansını gözlemleyin. Başarılı bir şekilde hazırlanmış bir numune için, oda başına 100 μL x 100 μL görüş alanı başına yaklaşık 3-4 mikrotübül demeti bulunmalıdır.

6. Mikrotübül demetleri üzerinde optik tuzak deneyleri yapılması

1. Şartların deney öncesi kalibrasyonu
   1. Bu deneyleri gerçekleştirmek için, sertliği 0,05-0,1 pN/nm olan tek ışınlı bir optik tuzak kullanın. Sırasıyla hedefin hemen altına ve kondenserin üstüne kısa geçirgen filtreler ekleyerek yakalama optiklerini ve konuma duyarlı fotodetektörü, TIRF özellikli bir ters mikroskopa dahil edin (Şekil 4).
   2. Ek olarak, kullanıcının bu tahliller sırasında mikrotübülleri nanometre ölçeğinde hassasiyetle kontrollü bir şekilde hareket ettirmesine izin vermek için numunenin oturduğu bir nanokonumlandırma aşaması ekleyin. Burada temsili verileri elde etmek için kullanılan sistem, yayınlanmış 27,53,54,56,57 çalışmasında açıklanmıştır.
      NOT: Bu protokolün kapsamı dışında olsa da, tek ışınlı optik tuzak^58,59,60'ın yapımını ve kalibrasyonunu detaylandıran birden fazla kaynak mevcuttur.
   3. Bir parlak alan veya DIC kanalı ve mikroskoptaki 100x hedefini kullanarak numunedeki boncukların yoğunluğunu gözlemleyin. Parlak alan mikroskobunu yalnızca boncukları tanımlamak ve manipüle etmek için kullanın, floresan görüntü alımı ile aynı anda kayıt yapmayın. Boncukları ortalama olarak birbirlerinden en az 10 μm olacak şekilde ayırın ve her türlü yüzey hapsinden veya bağlantısından arındırılmış olduklarından ve birbirlerine bağlı olmadıklarından veya başka bir şekilde kümelenmediklerinden emin olun.
   4. Biyotinile edilmiş uzak kırmızı mikrotübüllerin, mikrotübül ekseni boyunca hareketler veya çözelti içinde dalgalanan mikrotübüllerin serbest uçları gibi görünür bir Brownian hareketi olmadan, kapak kaymasının yüzeyine sıkıca tutturulduğundan emin olun.
   5. Rodamin mikrotübüllerinin çapraz bağlama MAP aracılığıyla biyotinile mikrotübüllere bağlandığından ve serbest uçlarında gözle görülür şekilde dalgalandığından emin olun. Biyotinillenmemiş mikrotübüllerin yüzeye tutturulması genellikle PEGilasyonun başarısız olabileceğini veya PEG kaplamanın bozulduğunu gösterir.
2. Motor tahrikli mikrotübül kayma ölçümleri
   1. Yayınlanan protokolleri takiben ilgilenilen motor proteini ifade edin ve saflaştırın. Örneğin, tam uzunlukta GFP etiketli kinesin-5 proteinleri, 53,61'in yanı sıra etiketlenmemiş kinesin-12 62 ve kinesin-14 ^63'ün yanı sıra bu tahlillerde başarıyla saflaştırılmış ve kullanılmıştır. Motor-protein çapraz bağlı demetleri yukarıda adım 4 ve 5'te açıklandığı gibi birleştirin ve görselleştirin.
   2. Optik tuzakla, Brownian hareketi sergileyen çözeltide serbest bir tek boncuk yakalayın. Boncuğu görüş alanının ortasına taşımak için tuzak optiklerini gerektiği gibi ayarlayın. Tuzak ışınından yansıyan girişim deseninin simetrik olduğundan emin olun ve herhangi bir ışın asimetrisini çözmek için tuzak optiklerini ayarlayın.
   3. Numune aşamasını hareket ettirin, böylece bir demet içindeki bir rodamin mikrotübülünün serbest ucu doğrudan boncuğun altındadır ve boncuk, tuzak ışını kaynaklı fotobeyazlatmayı en aza indirmek için çapraz bağlanma proteinleri içeren örtüşme bölgesinden birkaç mikron uzaktadır. Boncuğu mikrotübülle çarpışana kadar Z ekseninde indirin. Boncuğu nazikçe indirmeye özen gösterin ve boncuğu örtü kayma yüzeyine doğru itmeyin, çünkü bu kapak kayması yüzeyine yapışmaya neden olabilir.
   4. Parlak alan kanalı ile sürgülü mikrotübüle bağlı boncuğun hareketliliğini gözlemlemek için tuzağı kısaca kapatın. Motor protein tahlilleri yapılırken, ekli boncuk, mikrotübüller birbirinden uzaklaştıkça yönlü olarak hareket edecektir. Tuzağı yeniden etkinleştirin ve boncuğu tekrar yakalayın.
   5. Yukarıdaki 5. adımda optimize edilen lazer gücünü ve pozlama sürelerini kullanarak üç (488 nm, 561 nm, 640 nm) kanala floresan verilerini s başına 1-2 kare hızında kaydetmeye başlayın.
   6. Yakalama bilgisayarı yazılımını kullanarak, konuma duyarlı fotodetektörden (X, Y ve SUM yoğunluk sinyalleri), nanokonumlandırma aşamasından (X, Y ve Z koordinatları) ve TIRF kamera deklanşör durumundan voltaj verilerini kaydedin. Deneysel gereksinimlere bağlı olarak, uygun yazılım (özel olarak yazılmış LabView kodu gibi) tarafından kontrol edilen özel bir voltaj girişi veri toplama kartı kullanarak bu tuzak voltaj değerlerini 1-10 kHz hızında dijitalleştirmeye başlayın.
   7. Veri elde edildikçe kuvvet sinyalini izleyin ve başarılı veri toplamaya müdahale edebilecek anormalliklere çok dikkat edin.
      NOT: Anormallikler arasında (1) tuzağa giren diğer boncuklar, (2) tuzaktan erken kaçan boncuk ve (3) ani kuvvet düşüşleri ve ardından boncuk yüzeyindeki rigor kinesin molekülleriyle ilgili sorunları gösteren tuzağa karşı kuvvetin yeniden başlatılamaması yer alır ancak bunlarla sınırlı değildir.
   8. Ölçümden sonra, boncuğu serbest bırakmak için tuzağı devre dışı bırakın ve gerekli sayıda deneysel tekrar elde edilene kadar yeni bir boncuk ve yeni bir mikrotübül ile tekrarlayın.
3. Pasif çapraz bağlama direnci ölçümleri
   1. Yayınlanan protokolleri takiben ilgilenilen motor olmayan çapraz bağlama proteinlerini eksprese edin ve saflaştırın. Örneğin, tam uzunlukta GFP etiketli PRC1 43,54,57 ve dimerik NuMA kesilmiş yapı ⁵⁶ bu tahlillerde başarıyla kullanılmıştır. Çapraz bağlı demetleri yukarıda adım 4 ve 5'te açıklandığı gibi birleştirin ve görselleştirin.
   2. Sadece iki mikrotübül içeren, biri tam yüzey bağlantısı ile biyotinile edilmiş ve çözelti içinde kısmen serbest olan bir biyotinillenmemiş mikrotübül içeren uygun bir mikrotübül demeti tanımlayın; bu, bir boncuk takmak için serbest bir uç verir ve boncuğun yüzeye bağlı mikrotübüle bağlı olmadığını ve X veya Y ekseninde hizalandığını garanti eder, böylece sahne hareketi yalnızca bir eksen boyunca olacaktır.
   3. Brownian hareketine maruz kalan serbest bir boncuk yakalamak için optik tuzağı kullanın. Boncuk sıkıştıktan sonra, boncuğu dikkatlice seçilen mikrotübül demetine doğru hareket ettirin ve işlem sırasında başka hiçbir boncuğun tuzağa çekilmemesini sağlayın. GFP etiketinin fotobeyazlatmasını en aza indirmek için boncuğun çapraz bağlanma proteinleri içeren örtüşme bölgesinden birkaç mikron uzakta olduğundan emin olun.
   4. Boncuğu, rodamin mikrotübülünün serbest segmentinin kenarı ile temas edene kadar Z ekseninde dikkatlice indirin. Yavaşça yukarı çekin ve rodamin mikrotübül bükülmesini gözlemleyerek ve boncuk pozisyonunu takip ederek yapışmayı kontrol etmek için mikrotübül eksenine dik olarak hareket edin. Takılı değilse, boncuğun mikrotübül üzerine hafifçe çarpmasını takılana kadar tekrarlayın.
   5. Nanokonumlandırma aşamasını hareket ettirerek rodamin mikrotübülünü, yüzeye bağlı mikrotübülün mikrotübül ekseni boyunca dikkatlice yeniden hizalayın ve mikrotübül demetinin otomatik olarak çekilmesi için parametreleri ayarlayın. Mikrotübüllerin paralel ekseni boyunca yönü ayarlayın, örtüşme uzunluğuna bağlı olarak istenen çekme hızını (25-200 nm / s yararlı bir hız aralığıdır) ve istenen çekme süresini (yaklaşık 30 s ila 2 dakika) ayarlayın.
   6. Üç (488 nm, 561 nm, 640 nm) kanalda floresan verilerini saniyede 1-2 kare hızında kaydetmeye başlayın. Yukarıdaki 5. adımda optimize edilmiş lazer güçlerini ve pozlama sürelerini kullanın.
   7. Otomatik sahne alanı hareketini başlatın ve konuma duyarlı dedektör, sahne alanı ve TIRF kamera durumundan yakalama verilerini kaydedin. (1) tuzağa giren başka bir boncuk, (2) mikrotübül çapraz bağlanmasının erken kaybı veya (3) rodamin mikrotübülünden boncuk ayrılması dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere veri toplamaya müdahale edebilecek herhangi bir faktörü izleyin.
   8. Boncuğu serbest bırakmak için tuzağı devre dışı bırakın ve denemeyi istediğiniz gibi tekrarlayın. Tipik bir numune odası, demetlerin bozulmasından ve protein aktivitesi kaybından önce yaklaşık 30 dakika boyunca kullanılabilir.
      NOT: Bozunma etkileri, kullanılan çapraz bağlayıcıya göre değişecektir, ancak mikrotübüllerde veya yüzeyde statik punkta oluşumu, spesifik olmayan bağlanmayı gösteren mikrotübül dalgalanmalarının kaybı veya mikrotübüllere boncukların istikrarlı bir şekilde bağlanamaması olarak ortaya çıkabilir.

7. Verilerin analizi ve floresan görüntülerin optik tuzak kayıtlarıyla korelasyonu

NOT: Veri toplamayı optimize etmek için, iki ayrı bilgisayar kontrol sistemi kullanmak yararlıdır: biri optik yakalama yazılımı ve diğeri floresan görüntüleme için. Bu kurulum, hem deneysel modalitelerde yüksek hızlı veri toplanmasına izin verir hem de tek bir CPU kullanıldığında ortaya çıkabilecek verilere tanıtılan işlem yürütmedeki nano ve mikrosaniyelik gecikmeleri ortadan kaldırır.

1. Optik yakalama verilerini, kullanılan motor veya motor olmayan çapraz bağlama proteinleri ve beklenen adım atma hızları için optimize edilmiş bir hızda dijitalleştirin (örneğin, tipik olarak 1-10 kHz arasında).
2. Konuma duyarlı fotodetektörden X, Y ve SUM voltaj sinyallerinin yanı sıra optik tuzağı kontrol etmek ve bu bileşenlerden dijital voltaj sinyallerini örneklemek için özel bir yazılım kullanarak nano konumlandırma aşamasının X, Y ve Z konumsal verilerini kaydedin.
3. Fotoğraf makinesinden gelen deklanşör açık durumdaki dijital sinyali, optik yakalama veri toplama kartına ek bir voltaj giriş kanalı ile kaydedin. Bu, floresan görüntüleme verilerinin optik yakalama süresi izleriyle korelasyonunu sağlar. Görüntülemenin başlatılmasından önce optik tuzakla veri toplamaya başlayın, böylece ilk karedeki kamera sinyali düzgün bir şekilde kaydedilir.
4. İhtiyaçlara bağlı olarak, kayan pencere, medyan filtre veya Gauss filtresi gibi uygun bir filtreleme yöntemi kullanılarak yüksek örnekleme hızlarında elde edilen ham zaman serisi verilerinin ortalaması.
5. Floresan görüntü zaman serisi verilerini, mikrotübül bölgesinin uzunluğu boyunca piksel yoğunluğu değerinin hesaplandığı linecan analizi gibi yöntemleri kullanarak ölçün. Bu çizgilerden yörüngeler, mikrotübül kenarlarını ve dolayısıyla örtüşen bölgeleri tanımlayın. Ek olarak, protein lokalizasyonunu, konsantrasyonunu ve yoğunluğunu hesaplamak için çapraz bağlayıcı protein kanalından floresan yoğunluğunu kullanın.
6. Kuvvet ve görüntü verilerinin korelasyonu, bu deneysel sistemin temel bir çıktısıdır. Örneğin, ilgili floresan görüntü çerçevesiyle doğrudan karşılaştırmak için belirli bir kamera pozlama bölgesindeki (kamera kanalındaki karşılık gelen dijital sinyal artışıyla gösterilir) tüm kuvvet veri noktalarını seçin ve ortalamasını alın. Daha sonra, kuvvet büyüklüğü ile çapraz bağlanan proteinlerin sayısı, örtüşme uzunluğu veya çapraz bağlayıcı dağılımı arasındaki ilişkileri ayıklayın.

Biyofiziksel analiz için uygun mikrotübül demetlerinin hazırlanması, anahtar kriterlerin birçoğunun karşılanması durumunda başarılı kabul edilir. İlk olarak, üç renkte görüntüleme, tercihen örtüşme bölgesini süsleyen çapraz bağlama proteini konsantrasyonuna sahip iki hizalanmış mikrotübül ortaya çıkarmalıdır (Şekil 5B, C ve Şekil 6B). İdeal olarak, örtüşen kenar ile rodamin mikrotübülünün serbest ucu arasındaki mesafe, yakalama ışını ile floresan etiketli proteinler arasında yeterli fiziksel alan sağlamak için en az 5 μm olmalıdır. İkincisi, biyotinile edilmiş uzak kırmızı mikrotübüllerin bulunmadığı bölgelerde, özellikle çapraz bağlanma proteininin etiketlendiği aynı kanaldan minimum arka plan floresan sinyali olmalıdır. Yüksek arka plan floresansı, zayıf örtü kayma pasivasyonunun ve muhtemelen mikrotübüller veya tuzak boncukları ile spesifik olmayan bir şekilde etkileşime girecek olan yüksek konsantrasyonda cama bağlı proteinlerin göstergesidir. Ek olarak, mikrotübül görüntüleme kanallarından herhangi birinde görülen küçük yuvarlak punkta veya kısa fragmanların varlığı, mikrotübül polimerizasyonunun ve berraklaştırılmasının başarısız olduğunu veya mikrotübüllerin yaşlandığını veya hasar gördüğünü düşündürmektedir.

Üçüncüsü, tuzak için kullanılan boncuklar, birçok boncuk içeren kümeler içinde değil, tek boncuk olarak görünmelidir. Boncukların küçük bir kısmının geri dönüşümsüz bir şekilde yüzeye yapışması muhtemeldir, ancak numune odasında dağılmış bireysel parçacıklar olarak önemli bir fraksiyon gözlenmelidir. Aşırı kümelenme genellikle odaya akmadan önce boncukların en az 10 dakika boyunca sonikleştirilmesiyle hafifletilebilir. Dördüncüsü, bir mikrotübüle bir boncuk takmak, iyi bir bağlantı ile sonuçlanmalı, bindirme lazer ışığı kapatıldığında boncuk bağlı kalmalıdır. Boncuklar, yüzeyle temas ettiğinde spesifik olmayan bir şekilde yapışmamalıdır ve mikrotübüle bir boncuk tutturulduktan sonra, ölçümden önce filamenti hafifçe manipüle etmek (örneğin, bükmek veya esnetmek) mümkün olmalıdır. Son olarak, kuvvet uygulandığında veya motor aktivitenin ilerlemesine izin verildiğinde örtüşme uzunluğundaki değişiklikleri gözlemlemek mümkün olmalıdır. Örneğin, motor protein güdümlü kaymayı gözlemliyorsanız, örtüşme uzunluğu, motor protein sıçrama hızıyla tutarlı bir oranda azalmalıdır. Pasif çapraz bağlayıcıları incelerken, kuvvet uygulaması örtüşme uzunluğunda bir değişikliğe neden olmalıdır. Bu çıktılar, rodamin mikrotübülünün, örtü kayması yüzeyine spesifik olarak yapışmamak yerine, çapraz bağlanan proteinler yoluyla sadece yüzeye bağlı mikrotübüle bağlandığını göstermektedir.

Bu kriterlerin tümü karşılandığında, topluluk mekaniğini tanımlayan temel biyofiziksel parametreleri çıkarmak için çok çeşitli deneyler yapmak mümkündür. Bu tahlil veya benzeri tahliller, önceki çalışmalarda mitotik çapraz bağlanma proteinlerini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Örneğin, esansiyel mitotik motor proteini kinezin-5'in topluluklarının, örtüşme uzunluğu64 ile doğrusal olarak ölçeklenen hem itme hem de frenleme kuvvetleri üreterek mikrotübül kaymasını düzenleyebileceğini gösterdik (Şekil 5). Antiparalel veya paralel geometrideki mikrotübüller, küçük bir kinesin-5 molekülü topluluğu tarafından çapraz bağlandı. Bu motor proteinler mikrotübül artı uçlarına doğru adım attığında, filamentler ya birbirinden ayrıldı (antiparalel) ya da hızla ileri geri dalgalandı (paralel). Bu mini iş mili geometrisindeki mekaniği izleyerek, hem filament örtüşmesinin uzunluğu hem de çapraz bağlanan motor proteinlerinin sayısı ile ölçeklendirilmiş kuvvetin büyüklüğünü bulduk. Mikrotübüller kinesin-5'in boşaltılmış adım hızından daha hızlı bir hızda hareket ettirildiğinde, motor proteinleri dirençli bir frenleme kuvveti sağladı. Ayrıca C-terminal kuyruk alanının verimli çapraz bağlama ve kuvvet üretimi61 için gerekli olduğu bulunmuştur (Şekil 5B,C). Tam uzunluktaki protein, tüm motor proteinler kendi duraklama kuvvetlerine ulaştığında plato oluşturan sürekli kuvvetler üretebilir (Şekil 5D). Bununla birlikte, C-terminal kuyruğundan yoksun olan kinesin-5 motoru, büyüklükte yaklaşık beş kat daha küçük olan maksimum kuvvetler üretir (Şekil 5E, F). Birlikte, bu sonuçlar, kinesin-5 proteinlerinin, iğ montajı sırasında mikrotübülleri kutuplara doğru itmek ve molekül içindeki temel düzenleyici protein alanlarının biyofiziksel işlevini aydınlatmak için topluluklarda nasıl çalıştığını ortaya koymaktadır.

Ayrıca, motor olmayan mitotik protein PRC1 topluluklarının, anafaz mili orta bölgelerinde54 mikrotübül kaymasına direnmek için mekanik bir dashpot olarak çalıştığını gösterdik (Şekil 6A-C). PRC1, mekanik bir dashpotun hıza bağlı direnç kuvvetleri üretmesi gibi, çekme hızıyla doğrusal olarak ölçeklenen sürtünme direnci üretir. Bu dirençli kuvvetler, mikrotübül çiftleri arasındaki örtüşme bölgelerinin uzunluğuna veya lokal çapraz bağlayıcı yoğunluğuna bağlı değildir, ancak nişanlı PRC1 moleküllerinin toplam konsantrasyonuna büyük ölçüde bağlıdır (Şekil 6D, E). Bu sonuçlardan, PRC1 topluluklarının sızdıran bir piston görevi gördüğü, burada difüzif çapraz bağlayıcıların sıkıştırılmasının hıza bağlı bir direnç ürettiği öne sürülmektedir, ancak mikrotübül artı uçlarındaki çapraz bağlayıcıların kaybı büyük basınç kuvvetlerini hafifletmektedir.

Benzer tahlil geometrileri mitotik kinezin-12 proteini Kif1562'yi incelemek için de kullanılmıştır. Reinemann ve ark.62 , mikrotübüller birbirinden ayrılırken üretilen kuvveti ölçerek, Kif15 topluluklarının filamentleri kritik bir plato kuvvetine kadar ayırabildiğini ve mikrotübülleri verimli bir şekilde çapraz bağlamak ve sürekli yükler oluşturmak için proteinin C-terminal kuyruk bağlantı bölgesine ihtiyaç duyduğunu bulmuşlardır. Reinemann ve ark. ayrıca, eksi uçlu yönlendirilmiş bir kinesin olan kinesin-14 HSET'in benzer şekilde antiparalel mikrotübülleri63'ü birbirinden ayırabildiğini zarif bir şekilde göstermiştir. Eşit miktarda artı uçlu yönlendirilmiş kinezin-5 Eg5 proteini ile karıştırıldığında, HSET, örtüşme bölgesi içindeki mikrotübül kayma hareketi için bir savaş çekişmesine girerek Eg5 kayma aktivitesini inhibe etmeye hizmet eder. Birlikte, bu sonuçların hepsi aktif mikrotübül demetleri arasında doğrudan kuvvet ölçümünün gücünü göstermektedir ve biyolojik olarak uygun ağ geometrisinde protein fonksiyonunu karakterize etme ihtiyacını açıkça ortaya koymaktadır.

Şekil 1: Cam kapakların pasivasyonu. (A) Amino-silan konjugasyonu için No. 1.5 cam kapakların sıralı yıkama basamaklarını, kurutulmasını ve konjugasyonunu gösteren şematik. (B) PEG ve biotin-PEG gruplarını kovalent olarak cam örtü kapağına bağlamak, yıkamak ve kurutmak ve kısa süreli depolama için kapak kapaklarını vakum altında kapatmak için protokolü gösteren şematik. Şemanın bazı bölümleri 65'ten değiştirilmiş görüntülerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bir numune odasının montajı. (A) Pasifleştirilmiş kapaklar ve mikroskop slaytında standart bir 3 kullanılarak bir numune akış odasının montajını gösteren şematik. (B) Mikrotübül demetlerinin optik yakalama ve floresan görüntülemesi için optimize edilmiş tek ve çift kanallı akış odalarının montajı ve tipik boyutları. Şemanın bazı bölümleri 65'ten değiştirilmiş görüntülerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Optik yakalama ve TIRF tabanlı görüntüleme için yüzey immobilize mikrotübül demetlerinin oluşturulması. Optik olarak hapsedilebilir mikrotübül demetlerinin kademeli montajını gösteren şemalar. (A) Reaktifler haznenin giriş portundan içeri akar ve sıvı çıkış kanalından dışarı atılır. (B) Streptavidin (mavi) ilk önce kapak kayması üzerindeki biyotin-PEG bölgelerine bağlanır ve (C) kazein (kırmızı) ek bir bloke edici ajan olarak tanıtılır. (D) Biyotinile edilmiş uzak kırmızı etiketli mikrotübüller (macenta) tanıtılır ve ~ 5 dakika boyunca inkübe edilmesine izin verilir, ardından (E) çapraz bağlama proteini (yeşil), (F) biyotinillenmemiş rodamin etiketli mikrotübüller (kırmızı) ve son olarak, (G) demetin ve optik tuzak bazlı manipülasyon için uygun reaksiyon tamponunda asılı duran rijor kinesin kaplı mikrosferler eklenir. (H) Deney sırasında numune tamponunun buharlaşmasını önlemek için hazne, şeffaf oje ile kapatılır. Şemanın bazı bölümleri 65'ten değiştirilmiş görüntülerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 4: Optik cımbız/TIRF mikroskop sisteminin şeması. Tek ışınlı bir optik tuzak, ters çevrilmiş bir mikroskop içinde objektif tabanlı bir TIRF görüntüleme sisteminin optik yoluna sokulur. Hedefin hemen altına yerleştirilen kısa geçişli bir filtre, tuzak ışınının hedefin arka açıklığına yönlendirilmesini sağlar, burada numune kapağının yüzeyinin hemen üzerine odaklanarak optik bir tuzak oluşturur. Konuma duyarlı bir fotodetektör, iletilen ışığı toplayarak boncuğun konum ve kuvvet algılamasına izin verecektir. TIRF görüntüleme yoluyla birden fazla floresan veri kanalı elde edilebilir ve yüksek hassasiyetli EMCCD veya sCMOS kameraya kaydedilebilir. Deneylerin kurulumu sırasında boncukları yakalamak için geniş spektrumlu bir ışık kaynağı kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kinesin-5 ile kuvvet üretiminin ölçülmesinin temsili örneği. (A) Deneysel geometriyi tasvir eden şema, filamentleri birbirinden kaydırırken kuvvet üreten kinesin-5 motor proteinleri tarafından çapraz bağlanmış mikrotübülleri gösteren, optik bir tuzakla ölçülen. Yüzey hareketsiz mikrotübüller, GFP-kinesin-5 ve rodamin etiketli taşıma mikrotübüllerinden oluşan demetlerin temsili floresan görüntüleri. (B) Tam boy ve (C) C-terminal kuyruk kesilmiş kinesin-5 yapıları kullanılmıştır. Ölçek çubukları = 5 μm. (D) tam uzunlukta ve (E) kuyruksuz için kuvvet üretiminin örnek kayıtları, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilen ortalama kuvvetle gösterilir. (F) Her iki yapı için maksimum plato kuvvetinin ve karşılık gelen örtüşme uzunluğunun grafikleri gösterilir ve tam uzunluktaki kinesin yapısının, kuyruksuz kinesin yapısından büyük ölçüde daha büyük olan örtüşme uzunluğuna bağımlı kuvvetler ürettiğini ortaya koymaktadır. Bu rakam61'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: PRC1 ile sürtünme kuvvetlerini ölçmenin temsili örneği. (A) Deneysel geometriyi gösteren şematik, GFP-PRC1 (sitokinezinin protein regülatörü) ile çapraz bağlanmış mikrotübülleri gösteren, filamentler kapak kaymasını sabit hızda hareket ettirerek birbirinden ayrılırken direnç üreten çapraz bağlanan proteinler. (B) Hareketli yüzey hareketsiz hale getirilmiş uzak kırmızı mikrotübül, büzülen örtüşme içinde yoğunlaşan GFP-PRC1 molekülleri ve boncukla tutulan serbest rodamin mikrotübülünü gösteren temsili zaman serisi floresan görüntüleri. Kareler arasındaki zaman aralığı = 6 sn; Ölçek çubuğu = 5 μm. (C) Kayma olayı sırasında sürtünme kuvvetini gösteren örnek kuvvet izi, kırılma olayı ve çakışma 0 μm'ye ulaştığında kuvvet sıfıra (~ 55 sn) düşer. (D) Ortalama kuvvetin korelasyonu ve dört farklı kayma hızında örtüşme içindeki entegre GFP yoğunluğu. (E) (D)'deki izlerin ortalama eğimleri ve hesaplanan uyum hataları, PRC1 molekülü başına kuvvetin, kayma hızının bir fonksiyonu olarak doğrusal olarak arttığını ortaya koymaktadır. Bu rakam66'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.