Method Article

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi

DOI:

10.3791/63821

⸱

November 4th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden farklılaşan genetik olarak eşleşen epitel ve vasküler endotel hücrelerini entegre ederek böbrek glomerüler filtrasyon bariyerinin yapısını ve işlevini özetleyen kişiselleştirilmiş bir çip üzerinde organ sistemi tasarlamak için bir protokol sunulmaktadır. Bu biyomühendislik sistemi, böbrek hassas tıbbını ve ilgili uygulamaları ilerletebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kronik böbrek hastalığı (KBH), ABD yetişkin nüfusunun% 15'ini etkilemektedir, ancak hedefe yönelik tedavilerin kurulması, insan biyolojik yanıtlarını ve nefrotoksisiteyi doğru bir şekilde tahmin edebilen fonksiyonel modellerin eksikliği ile sınırlandırılmıştır. Böbrek hassas tıbbındaki gelişmeler bu sınırlamaların üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Bununla birlikte, daha önce kurulmuş olan insan böbrek glomerulusunun in vitro modelleri - kan filtrasyonu için birincil bölge ve birçok hastalık ve ilaç toksisitesinin kilit bir hedefi - tipik olarak sınırlı fonksiyonel özelliklere ve eşsiz genetik geçmişlere sahip heterojen hücre popülasyonlarını kullanır. Bu özellikler, hastaya özgü hastalık modellemesi ve terapötik keşif için uygulamalarını önemli ölçüde sınırlar.

Bu yazıda, izojenik ve vaskülarize mikroakışkan böbrek glomerulus çipi mühendisliği için tek bir hastadan insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) hücre kaynaklı glomerüler epitel (podositler) ve vasküler endoteli entegre eden bir protokol sunulmaktadır. Ortaya çıkan glomerulus çipi, soya özgü belirteçleri eksprese eden, bazal membran proteinleri üreten ve böbreğin glomerüler filtrasyon bariyerine benzeyen bir doku-doku arayüzü oluşturan kök hücre kaynaklı endotel ve epitel hücre katmanlarından oluşur. Tasarlanmış glomerulus çipi, molekülleri seçici olarak filtreler ve ilaca bağlı böbrek hasarını özetler. İzojenik hücre tiplerini kullanarak böbrek glomerulusunun yapısını ve işlevini yeniden oluşturma yeteneği, böbrek hastalığını hastaya özgüllükle modelleme ve böbrek hassas tıbbı ve ilgili uygulamalar için çip üzerindeki organların faydasını geliştirme fırsatı yaratır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çip üzerinde organ cihazları, belirli organların yapısını ve işlevini modelleyen doku-doku arayüzleri oluşturmak için moleküler ve mekanik stimülasyonun yanı sıra vaskülarizasyon kullanan dinamik 3D in vitro modellerdir. Böbreğin glomerulusunu (glomerulus çipleri) özetlemeyi amaçlayan daha önce kurulmuş çip üzerinde organ cihazları, hayvan hücre hatları1 veya heterojen kaynakların insan birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarından oluşuyordu 2,3. Genetik olarak heterojen hücre kaynaklarının kullanımı, hastaya özgü yanıtlar ve hastalığın genetiği veya mekanizmaları üzerine yapılan çalışmaları önemli ölçüde sınırlayan varyasyonlar ortaya koymaktadır 4,5. Bu zorluğun ele alınması, in vitro modellerin mühendisliği için daha doğru bir mikro ortam sağlamak için korunmuş moleküler ve genetik profillere sahip belirli bireylerden kaynaklanan izojenik hücre hatlarının mevcudiyetine bağlıdır 2,3,6. İnsan kökenli izojenik hücre hatları, insan iPS hücre kültüründeki ilerlemeler nedeniyle artık kolayca üretilebilir. İnsan iPS hücreleri tipik olarak invaziv olmayan bir şekilde kaynaklandığından, süresiz olarak kendi kendini yenileyebildiğinden ve hemen hemen her hücre tipine farklılaşabildiğinden, glomerulus çipi 7,8 gibi in vitro modellerin kurulması için çekici bir hücre kaynağı olarak hizmet ederler. Glomerüler filtrasyon bariyeri, kan filtrasyonu için birincil bölgedir. Kan önce vasküler endotel, glomerüler bazal membran ve son olarak podositler adı verilen özel epitel yoluyla süzülür. Filtrasyon bariyerinin her üç bileşeni de moleküllerin seçici filtrasyonuna katkıda bulunur. Burada, tek bir insan iPS hücre kaynağından vasküler endotel ve glomerüler epitel ile arayüz oluşturan çip üzerinde organ cihazı oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, glomerüler filtrasyon bariyerini özetlemek için izojenik ve vaskülarize bir çip mühendisliği yapmak için özellikle yararlı olsa da, aynı zamanda diğer kişiselleştirilmiş çip üstü organ türlerini ve izojenik bir 'çip üzerinde vücut' sistemi gibi çok organlı platformları geliştirmek için bir plan sağlar.

Burada açıklanan protokol, insan iPS hücrelerinin iki ayrı soya - lateral mezoderm ve mezoderm hücrelerine - daha sonra sırasıyla vasküler endotel ve glomerüler epitel olarak farklılaşmasıyla başlar. Yanal mezoderm hücreleri üretmek için, insan iPS hücreleri bazal membran matrisi 1 kaplı plakalar üzerine tohumlandı ve Wnt aktivatörü, CHIR 99021 ve güçlü mezoderm indükleyicisi, kemik-morfogenetik 4 (BMP4) ile desteklenen N2B27 ortamında 3 gün boyunca (ortam değişimi olmadan) kültürlendi. Ortaya çıkan lateral mezoderm hücreleri daha önce brachyury (T), karışım çiftli benzeri homeobox (MIXL) ve eomesodermin (EOMES)9 ekspresyonu ile karakterize edildi. Daha sonra, lateral mezoderm hücreleri, manyetik aktive hücre sıralama (MACS) kullanılarak VE-Kadherin ve / veya PECAM-1 ekspresyonuna göre sıralanan vasküler endotel hücrelerini indüklemek için VEGF165 ve Forskolin ile desteklenmiş bir ortamda 4 gün boyunca kültürlendi. Elde edilen vasküler endotel hücreleri (viEC), mikroakışkan cihazda tohumlanmaya hazır olana kadar bazal membran matrisi 3 kaplı şişeler üzerinde kültürlenerek genişletildi.

Mezoderm hücreleri üretmek için, insan iPS hücreleri bazal membran matrisi 2 kaplı plakalar üzerine tohumlandı ve Activin A ve CHIR99021 içeren bir ortamda 2 gün boyunca kültürlendi. Elde edilen mezoderm hücreleri, daha öncetarif edildiği gibi HAND1, goosecoid ve brachury (T) ekspresyonu ile karakterize edildi 2,10,11. Ara mezoderm (IM) hücre farklılaşmasını indüklemek için, mezoderm hücreleri BMP-7 ve CHIR99021 ile desteklenmiş bir ortamda 14 gün boyunca kültürlendi. Elde edilen IM hücreleri, Wilm Tümörü 1 (WT1), eşleştirilmiş kutu geni 2 (PAX2) ve tek atlanan ilişkili protein 1 (OSR-1) 2,10,11'i eksprese eder.

İki kanallı polidimetilsiloksan (PDMS) bazlı mikroakışkan çip, glomerüler filtrasyon bariyerinin yapısını in vitro olarak özetlemek için tasarlanmıştır. İdrar kanalı 1.000 μm x 1.000 μm (g x y) ve kılcal kanal boyutu 1.000 μm x 200 μm (g x y) şeklindedir. Döngüsel gerilme ve gevşeme döngüleri, akışkan kanalların her iki tarafında bulunan içi boş odalar tarafından kolaylaştırıldı. Hücreler, idrar ve kılcal kanalları ayıran esnek, PDMS membranına (50 μm kalınlığında) tohumlandı. Membran, hücreler arası sinyalleşmeyi teşvik etmeye yardımcı olmak için altıgen gözeneklerle (7 μm çaplı, 40 μm aralıklı) donatılmıştır (Şekil 1A)2,12. IM indüksiyonu tamamlanmadan iki gün önce, mikroakışkan çipler bazal membran matrisi 2 ile kaplandı. viEC'ler, IM indüksiyonu tamamlanmadan 1 gün önce Endotel Bakım ortamı kullanılarak mikroakışkan çipin kılcal kanalına tohumlandı ve çip, ECM kaplı PDMS membranının bazal tarafında hücre yapışmasını sağlamak için baş aşağı çevrildi. IM indüksiyonunun tamamlandığı gün, hücreler, çip içinde podosit farklılaşmasını indüklemek için BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 ve tüm trans Retinoik Asit ile desteklenmiş bir ortam kullanılarak mikroakışkan çipin idrar kanalına tohumlandı. Ertesi gün, ortam rezervuarları Podosit İndüksiyon ortamı ve Endotel Bakım ortamı ile dolduruldu ve yongalara 0.4 Hz'de% 10 mekanik gerinim ve sıvı akışı (60 μL / s) uygulandı.

Hücreselleştirilmiş mikroakışkan çipler, Podosit İndüksiyon ortamı (idrar kanalında) ve Endotel Bakım ortamı (vasküler kanalda) kullanılarak 5 gün daha kültürlendi. Elde edilen böbrek glomerulus çipleri, hem podosit hem de endotel hücreleri için bakım ortamında 7 güne kadar kültürlendi. Farklılaşmış podositler, podocin ve nefrin13,14 dahil olmak üzere soya özgü proteinleri pozitif olarak ifade ederken, viEC'ler, hepsi glomerüler filtrasyon bariyerinin bütünlüğünü korumak için gerekli moleküller olan PECAM-1 ve VE-Cadherin'i pozitif olarak ifade etti. . Podositlerin ve viEC'lerin her ikisinin de doku olgunlaşması ve fonksiyonu için de önemli olan en bol glomerüler bazal membran proteini olan kollajen IV'ü salgıladığı bulunmuştur.

Glomerulus yongalarındaki filtrasyon bariyerinin üç bileşenli sisteminin - endotel, bazal membran ve epitel - molekülleri seçici olarak filtrelediği ve kemoterapötik, nefrotoksik ilaç tedavisine yanıt verdiği bulunmuştur. İlaç tedavisinden elde edilen sonuçlar, glomerulus çipinin nefrotoksisite çalışmaları ve hastalık modellemesi için kullanılabileceğini göstermiştir. Bu protokol, izojenik iPS hücre türevlerinden fonksiyonel bir mikroakışkan böbrek glomerulus çipinin mühendisliği için genel kılavuz sağlar. Tasarlanan çipin aşağı akış analizleri, araştırmacı tarafından istenildiği gibi gerçekleştirilebilir. İlaca bağlı glomerüler yaralanmayı modellemek için glomerulus çipinin kullanımı hakkında daha fazla bilgi için, önceki yayınlara bakın 2,12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bodrum membran matris çözeltileri ve kaplamalı substratlar hazırlayın

  1. Bodrum membran matrisi 1'i 4 °C'de buz üzerinde gece boyunca çözün. Aliquot, seyreltme oranı için üreticinin önerisine göre. 50 mL'lik bir konik tüp ve pipet kullanarak, tamamen çözülene ve çözülene kadar uygun miktarda bazal membran matrisi 1'i 25 mL soğuk DMEM/F12'ye iyice karıştırın.
    1. Dondurulmuş bir aliquot'u çözmek için, 25 mL'lik soğuk DMEM / F12'den ~ 200 μL alın ve dondurulmuş aliquot tüpüne aktarın. Matris iyice çözülene ve çözülene kadar pipeti yukarı ve aşağı doğru çekin. Bodrum membranı matrisi 1'in tüm tüp içeriğini soğuk DMEM/F12'nin geri kalanına aktarın.
  2. Pipet 1 mL bazal membran matrisi 1 çözeltisi 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirilir. Kaplanmış plakaları aynı gün kullanmak için, 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    1. Alternatif olarak, kaplanmış plakalar parafilm ile sarılabilir ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir. Depolanan plakayı kullanmaya hazır olduğunda, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. 5 μg/mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için bazal membran matrisi 2'yi 9 mL steril damıtılmış suda seyreltin. Pipet 700 μL bazal membran matrisi 2 çözeltisi 12 delikli bir plakanın her bir kuyuğuna yerleştirilir. Bodrum membran matrisi 2 kaplamalı plakaları parafilm ile sarın ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
  4. Liyofilize bazal membran matrisi 3'ü, üretici tarafından önerildiği gibi fosfat tamponlu salinde (PBS, Ca + 2 ve Mg + 2 içermeyen) 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için yeniden oluşturun. Bir adet 250 μL aliquot'u 9.75 mL PBS'de (Ca+2 ve Mg+2 içermeyen) 25 μg/mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltin. Bir T75 şişesini kaplamak için bu çözeltinin 6 mL'sini kullanın (2 μg /cm2'lik son konsantrasyon). Matris kaplı şişeleri 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.

2. İnsan iPS hücre kültürü

NOT: Bu protokolde kullanılan DU11 hattı test edilmiş ve mikoplazma ve karyotip anormallikleri içermediği bulunmuştur.

  1. Bodrum membran matrisi 1 kaplamalı plakaları 37°C'de 1-2 saat boyunca inkübe edin.
  2. 6 delikli plakanın her bir oyuğunu 3x, 1 mL ılık (37 ° C) DMEM / F12 ile yıkayın. 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 2 mL insan iPS hücre kültürü ortamı (CCM) (Ek Tablo S1) ekleyin. Hücreler aşağıda açıklandığı gibi tohumlama için hazırlanırken plakaları 37 ° C'de inkübe edin.
  3. İnsan iPS hücreleri içeren 6 delikli plakanın her bir kuyusunu 1 mL sıcak DMEM / F12 ile yıkayın.
  4. DMEM/F12'yi aspire edin. 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL sıcak hücre ayrılma tamponu ekleyin. 1 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  5. Hücre kolonisi kenarlarının etrafındaki ayrışma için mikroskop altında her bir kuyuyu görsel olarak inceleyin. Hücre ayrılma tamponunu hücrelerden dikkatlice aspire edin. Her bir kuyucuğu 1 mL ılık DMEM / F12 ile nazikçe yıkayın.
  6. Hücrelerin plakadan tamamen ayrılmadığından veya yanlışlıkla aspire edilmediğinden emin olmak için plakaları mikroskop altında inceleyin.
  7. Hücreli 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 3 mL sıcak insan iPS CCM ekleyin. Bir hücre kaldırıcı kullanarak, kolonileri yavaşça kazıyın. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu her bir kuyucukta bir kez yukarı ve aşağı doğru yavaşça karıştırın.
  8. Yeni bazal membran matrisi 1 kaplamalı plakayı inkübatörden çıkarın. Hücre süspansiyonunun 0,5 mL'sini yeni bazal membran matrisi 1 kaplamalı plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı sekiz rakamlı bir hareketle hareket ettirin. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
  9. Harcanan ortamı aspire edin ve hücreler% 70 kaynaşana kadar (geçişten yaklaşık 4 gün sonra) kültürün her günü 3 mL insan iPS CCM ile değiştirin.

3. Gün 0-16: İnsan iPSC'lerinin ara mezoderm hücrelerine farklılaşması

  1. 0-2. Gün: mezoderm indüksiyonu
    1. Bodrum membran matrisi 2 kaplamalı plakaları, depolamadan sonra dengelemek için 4 °C'den 2 saat oda sıcaklığına taşıyın.
    2. Harcanan ortamı, yaklaşık% 70 akan insan iPS hücresi içeren 6 delikli plakanın her bir kuyucuğundan aspire edin. Hücreleri 1 mL ılık DMEM / F12 ile 3 kat nazikçe yıkayın.
    3. DMEM/F12'yi aspire edin. İnsan iPS hücrelerinin 6 delikli plakasının her bir kuyucuğuna 1 mL hücre ayrılma tamponu ekleyin. 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Hücre kolonisi kenarlarının etrafındaki ayrışma için mikroskop altında her bir kuyuyu görsel olarak inceleyin. Bir hücre kaldırıcı kullanarak, kolonileri yavaşça kazıyın.
    5. Hücre süspansiyonlarını 6 delikli plakanın tüm kuyucuklarından 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve iPS hücrelerinin tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipet yapmak için bir P1000 kullanın.
    6. Konik tüpteki hücre süspansiyonunu DMEM / F12 ile 14 mL'ye doldurun. Oda sıcaklığında 200 × g'da 5 dakika santrifüj.
    7. Süper natantı aspire edin. Hücre peletini 14 mL sıcak DMEM / F12 içinde yeniden askıya alın. Santrifüjlemeyi oda sıcaklığında 200 × g'da 5 dakika tekrarlayın.
    8. Süper natantı aspire edin. Hücreleri 1 mL Mezoderm İndüksiyon ortamında yeniden askıya alın (Ek Tablo S1). Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 1 × 105 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için Mesoderm İndüksiyon ortamında seyreltin.
    9. Kaplamayı bodrum membran matrisi 2 kaplamalı plakadan aspire edin. Bodrum membran matrisi 2 kaplamalı plakanın her bir oyuğunu 1 mL sıcak DMEM / F12 ile 2x durulayın.
    10. Hücre süspansiyonunu 2 kat yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Hücre süspansiyonunun 1 mL'sini bodrum membran matrisi 2 kaplı plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı yavaşça sekiz rakamlı bir hareketle hareket ettirin.
    11. Plakayı gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün (1. gün), harcanan ortamı 12 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğundan aspire edin. 1 mL ılık Mesoderm İndüksiyon ortamı ile değiştirin. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. 2-16. Günler: Orta mezoderm indüksiyonu
    1. Harcanan Mesoderm İndüksiyon ortamını aspire edin. 1m L sıcak Orta Mezoderm İndüksiyon ortamı (Ek Tablo S1) ile değiştirin. Harcanan ortamı aspire edin ve 14 gün boyunca her gün 1 mL sıcak Orta Mezoderm İndüksiyon ortamı ile değiştirin.

4. Gün 0-15: İnsan iPSC'lerinin vasküler endotel hücrelerine farklılaşması ve genişlemesi

  1. 0. Gün: insan iPS hücre tohumlaması
    1. ROCK İnhibitörü ile 15 mL insan iPS CCM'si hazırlayın (Ek Tablo S1). 37 °C'de sıcak tutun.
    2. Bir bodrum membran matrisi 1 kaplamalı plakayı 37 ° C'de 1-2 saat boyunca inkübe edin. Bodrum membran matrisini aspire edin 1. 3x'i 1 mL sıcak DMEM/F12 ile yıkayın.
    3. DMEM/F12'yi aspire edin. 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna ROCK İnhibitörü ile 2 mL insan iPS CCM ekleyin. Hücreler aşağıda açıklandığı gibi tohumlama için hazırlanırken plakaları 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Harcanan ortamı, yaklaşık% 70 akan insan iPS hücresi içeren 6 delikli plakanın her bir kuyucuğundan aspire edin. Hücreleri 1 mL ılık DMEM / F12 ile 3 kat nazikçe yıkayın.
    5. DMEM/F12'yi aspire edin. İnsan iPS hücrelerinin 6 delikli plakasının her bir kuyucuğuna 1 mL hücre ayrılma tamponu ekleyin. Hücreleri tek hücrelere ayırmak için 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: iPS hücre hatları arasındaki doğal farklılıklar nedeniyle, kullanıcının optimum inkübasyon süresini belirlemek için 5 dakika sonra hücreleri görsel olarak incelemesi gerekecektir.
    6. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Ayrılma tamponunu nötralize etmek için hücre süspansiyonunu sıcak DMEM / F12 ile 14 mL'ye kadar getirin. Oda sıcaklığında 200× g'da 5 dakika santrifüj.
    7. Süper natantı nazikçe aspire edin. ROCK inhibitörü ile 1 mL İnsan iPS CCM'deki hücreleri yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak toplam hücre sayısını sayın.
    8. Hücreleri 37.000 ila 47.000 hücre /cm2 (355.200 ila 451.200 hücre / 6 delikli bir plakanın kuyusu) arasında tohumlayın. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: iPS hücre hatları arasındaki doğal farklılıklar nedeniyle, kullanıcının optimum tohumlama yoğunluğunu belirlemesi gerekecektir.
  2. 1-3. Gün: lateral mezoderm indüksiyonu
    1. Ertesi gün (1. gün), harcanan ortamı, insan iPS hücrelerinin 6 delikli plakasının her bir kuyucuğundan aspire edin. 6 delikli plakanın her bir kuyucuğunu 5 mL Yanal Mezoderm İndüksiyon ortamı ile değiştirin (Ek Tablo S1). Kültür kabının ölçeğini yükseltirken (örneğin, şişeler), genellikle kültür kabındaki çalışma hacminin 3 katı ile değiştirin.
    2. Bu ortamı 3 gün boyunca değiştirmeyin.
      NOT: Kuyucuklardaki Lateral Mesoderm İndüksiyon Ortamı, hücreler besinleri kullandıkça normalde kırmızıdan sarıya renk değiştirecektir. Bununla birlikte, bakteriyel büyüme ile bulutlu orta veya orta normal değildir ve bu şekilde dekontamine edilmeli ve atılmalıdır.
  3. 4-6. Gün: endotel hücre indüksiyonu
    1. Harcanan ortamı 6 delikli plakanın her bir kuyucuğundan aspire edin. 6 delikli plakanın her bir kuyucuğunu 3 mL sıcak Endotelyal İndüksiyon ortamı ile değiştirin (Ek Tablo S1). Plakayı gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Takip eden 2 gün boyunca (5. ve 6. günler), harcanan ortamı tüm kuyulardan 50 mL'lik bir konik tüpe toplayın. Konik tüpü 4 °C'de saklayın. Hücreleri 3 mL sıcak Endotelyal İndüksiyon ortamı ile doldurun. Plakayı 37 ° C'de inkübe edin.
  4. 7. Gün: Endotel hücresi (viEC) ayıklama
    1. Bodrum membran matrisi 3 şişelerini çıkarın ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
    2. 50 mL MACS arabelleği hazırlayın (Ek Tablo S1).
    3. Hücre dekolmanı tamponu, MACS tamponu, Endotelyal CCM ve PBS'yi (Ca 2+ ve Mg2+ serbest) doku kültürü başlığındaki buz üzerine yerleştirin.
    4. Mıknatısı MACS standına yerleştirin. İki adet 50 mL konik tüp ve bir adet 15 mL konik tüp tutucuya yerleştirin.
    5. MACS standını (mıknatıs takılıyken) ve bir LS sütununu doku kültürü başlığına yerleştirin. Konik tüp tutucuyu (içinde konik tüpler ile) MACS standında, mıknatısın altına yerleştirin (Ek Şekil S1A).
    6. Harcanan ortamı 6 delikli plakanın her bir kuyucuğundan 4.3.2 adımından itibaren 50 mL konik tüpe toplayın. 6 delikli plakanın her bir oyuğunu PBS ile yıkayın (Ca 2+ ve Mg2+ içermez).
    7. PBS'yi aspire edin. 1 mL hücre ayrılma tamponu ekleyin. Hücreleri tamamen ayırmak için 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    8. Hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Soğuk Endotelyal CCM ile hücre süspansiyonunu 15 mL'ye getirin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj.
    9. Süper natantı aspire edin. Hücreleri 1 mL soğuk MACS tamponunda yeniden askıya alın. Hücreleri bir hemositometre ile sayın.
    10. Hücre süspansiyonuna 10 mL MACS arabelleği ekleyin. Oda sıcaklığında 200 × g'da 5 dakika santrifüj.
    11. Süper natantı aspire edin. Hücreleri, 10 milyon hücre başına 80 μL MACS tamponunda yeniden askıya alın. 10 milyon hücre başına 20 μL FcR Bloke Reaktifi, CD31 mikroboncuk ve CD144 mikroboncuk ekleyin. Buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    12. Hücre süspansiyonu inkübe olurken, endotel indüksiyonundan (adım 4.3.2) toplanan ortamı 10 dakika boyunca 200 × g'de santrifüj edin.
    13. Süpernatantı 500 mL 0,22 μm vakum filtresinde toplayın. Endotelyal Şartlandırılmış ortamı hazırlayın (Ek Tablo S1). Ortamı steril koşullar altında filtreleyin ve ortamı 37 ° C'de sıcak tutun.
      NOT: Endotel hücre proliferasyon hızı 3. geçişten sonra azalmaya başlayacaktır. Pasaj 3'ten sonra üstel büyüme elde etmek için, endotel şartlandırılmış ve bakım ortamı, pasaj 1'den itibaren 10 μM TGF-Beta inhibitörü (SB431542) ile desteklenebilir.
    14. Adım 4.4.11'deki 15 dakikalık inkübasyondan sonra, hücre süspansiyonuna 10 milyon hücre başına 10 mL MACS tamponu (maksimum 30 mL MACS tamponu) ekleyin. 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj.
    15. Süper natantı aspire edin. 1 mL MACS arabelleğinde yeniden askıya alın.
    16. LS kolonunu alın ve pistonu şırıngadan dışarı çekin. Pistonu tekrar plastik kılıfa yerleştirin. Sütunu mıknatısın üzerine yerleştirin.
    17. İlk 50 mL konik tüpü sütunun altına yerleştirin. Sütuna 1 mL MACS arabelleği ekleyin. Altındaki 50 mL konik tüpte toplayın.
    18. Kolonun kurumasını önlemek için tamamen olmasa da sıvının akmasına izin verin. Sıvı damlaları yavaşça damlamaya başladığında, hücre süspansiyonunu sütuna ekleyin. Akışı aynı 50 mL konik tüpte toplayın.
    19. Sıvı damlaları yavaşça damlamaya başladığında, bir sonraki 50 mL konik tüpü sütunun altına yerleştirin. İlk akışı (adım 4.4.18) sütuna ekleyin. Altındaki 50 mL konik tüpte toplayın.
    20. Sıvı damlaları yavaşça damlamaya başladığında, sütunu yıkamak için 500 μL MACS tamponu 3x ekleyin.
    21. Sütunu mıknatıstan çıkarın. Kolonu 15 mL konik tüpe yerleştirin. Sütuna 1 mL soğuk PBS ekleyin.
    22. Hücreleri toplamak için, pistonu plastik manşondan alın ve sıkıca sütuna itin.
    23. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. PBS ile hücre süspansiyonunu 5 mL'ye getirin. 200 × g'da 5 dakika santrifüj.
    24. Hücreler santrifüjlemeye tabi tutulurken, hücre tohumlamasına hazırlanmak için bazal membran matrisi 3 kaplı şişeyi 5 mL PBS ile 3x yıkayın. PBS'yi aspire edin ve bazal membran matrisi 3 kaplamalı şişeye 20 mL Endotelyal Şartlandırılmış ortam ekleyin.
    25. Hücreleri santrifüjden çıkarın ve süpernatanı aspire edin. Endotelyal Şartlandırılmış ortamdaki hücreleri 26.000 hücre/ cm2'de (1.95 × 106 hücre / T75 şişe) tohumlanacak şekilde yeniden askıya alın. Hücreleri tohumlayın.
    26. Sıralama verimliliğini ve hücre verimini hesaplamak için, adım 4.4.23'teki hücre sayısını, adım 4.4.9'daki hücre sayısına bölün.
  5. 8-15. günler: viEC'lerin genişletilmesi
    1. Ertesi gün (8. gün), harcanan ortamı şişeden aspire edin. 10 mL Endotelyal Şartlandırılmış ortam ile değiştirin. Endotel Şartlandırılmış ortamı, şişe% 90 akıcı olana kadar veya Endotel Şartlandırılmış orta boy şişe tamamen kullanılana kadar her gün değiştirin.
    2. Harcanan ortamı aspire edin ve sürekli genişleme için her gün 10 mL Endotel Bakım ortamı (Ek Tablo S1) ile değiştirin.
    3. ViEC'leri geçmek için, iki adet bazal membran matrisi 3 kaplamalı T75 şişe hazırlayın. Şişeleri oda sıcaklığında 1 saat bekletin. Taze hazırlanmış şişeleri 5 mL PBS ile 3x iyice yıkayın.
    4. PBS'yi aspire edin. Taze hazırlanmış her şişeye 10 mL sıcak Endotel Bakım ortamı ekleyin. Hücreler aşağıda açıklandığı gibi tohumlama için hazırlanırken plakaları 37 ° C'de inkübe edin.
    5. %90 birleşik T75 şişesi viECs'ye 5 mL hücre ayırma tamponu ekleyin. 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 5 mL sıcak DMEM/F12 ekleyin. 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj.
    6. Süper natantı aspire edin. 1 mL sıcak Endotel Bakım ortamında yeniden askıya alın. Yeni hazırlanmış T75 şişelerinin her birine 500 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
    7. Ertesi gün, harcanan ortamı aspire edin. 10 mL Endotel Bakım ortamı ile değiştirin. Harcanan ortamı aspire edin ve şişe% 90 birleşene kadar her gün 10 mL Endotel Bakım ortamı ile değiştirin.

5. Gün 14: Hücre kültürü için mikroakışkan organ çip cihazlarının hazırlanması

  1. Plazma işleme ve bazal membran matris 2 kaplama
    1. Bodrum membran matrisi 2 çözeltisini hazırlayın (adım 1.3). Bir kenara koyun.
    2. Steril bir doku kültürü davlumbazında, steril 100 mm x 15 mm yuvarlak Petri kabını ambalajından çıkarın. Petri kabının üst kısmını, aşağı bakacak şekilde, Petri kabının alt kısmının altına yerleştirin (Ek Şekil S1B).
    3. Cımbız kullanarak, mikroakışkan çipleri paketten çıkarın ve Petri kabının içine yerleştirin. Petri kabını, kapağı tabağın altından kullanarak kapatın.
    4. Plazma asherinde, Petri çanağı kapağını kabın altına, üstten aşağıya bakacak şekilde yerleştirin ve bunları tek bir birim olarak bir arada tutun. Petri çanak ünitesini plazma asher odasına yerleştirin. Plazma asherini 100 W, 15 SCCM, 30 s'de oksijenle başlatın.
    5. Zamana duyarlı: Tedavi tamamlandıktan sonra, Petri kabı ünitesini plazma asherinden çıkarın. Petri kabı kapağını, laboratuvar mendili üzerine püskürtülen% 70 etanol ile hızlı ve hafif bir şekilde silin. Petri kabını kapağıyla örtün.
    6. Petri kabını steril doku kültürü başlığına getirin. Çipin idrar (üst) kanalına nazikçe 25 μL bazal membran matris 2 çözeltisi ekleyin. Çipin kılcal (alt) kanalına 20 μL bazal membran matrisi 2 çözeltisi ekleyin.
    7. İki steril 15 mL konik tüp kapağı alın ve steril damıtılmış suyla (~ 500 μL) doldurun. Talaş kanallarının ve membranın kurumasını önlemek için kapağı Petri kabına yerleştirin. Kapağı tabağın üzerine yerleştirin. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.

6. ViEC'lerin ve ara mezoderm hücrelerinin mikroakışkan cihazlara tohumlanması

  1. 15. Gün: viECs
    1. Ortamı, %90 akıcılı viEC'ler içeren T75 şişelerinden aspire edin. 5 mL hücre ayrılma tamponu ekleyin ve 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 5 mL DMEM/F12 ekleyin. 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj.
      NOT: Yaklaşık %90 birleşik viEC'ye sahip her T75 şişesi ~3 milyon hücre üretecektir.
    3. Süper natantı aspire edin. Yaklaşık 2 milyon hücre / 300 μL elde etmek için 300 μL Endotel Bakım ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu bir kenara koyun.
    4. Mikroakışkan çipleri içeren Petri kabını doku kültürü başlığına aktarın. Bir aspiratörün ucuna bir P200 bariyer ucu takın.
    5. Mikroakışkan çipin hem üst hem de alt kanallarını 200 μL DMEM/F12 ile yıkayın ve aynı anda çıkışın çevresini aspire edin.
    6. Aspiratöre bağlı P200 bariyer ucu ile çipi alt kanalın çıkışından uzakta sıkıca tutun. Yaklaşık 134.000 hücreli viEC süspansiyonunun 20 μL'sini çipin kılcal (alt) kanalına sıkıca enjekte edin. Ortamı çıkışın çevresinden dikkatlice aspire edin.
    7. Mikroskop altında kabarcıklar veya düzensiz bir viEC tohumlama yoğunluğu olup olmadığını kontrol edin.
    8. ViEC'lerin esnek PDMS membranının bazal tarafına yapışabilmesi için çipi ters çevirmek üzere yavaşça ters çevirin. Çipi tutucu kartuşa yerleştirin. Membranın kurumasını önlemek için talaş tutucu kartuşa 3 mL PBS ekleyin. Çipi 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    9. Mikroskop altındaki alt kanalda, esnek PDMS membranına bağlı birleşik bir viECs katmanı olup olmadığını kontrol edin. Alt kanalın girişine 200 μL Endotel Bakım ortamı bırakın ve kılcal (alt) kanal çıkışının çevresinden dikkatlice aspire olurken bağlanmamış endotel hücrelerinin kanalını yıkamak için kanaldan akmasına izin verin.
    10. Çipi tekrar tutucu kartuşa takın. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. 16. Gün: ara mezoderm (IM) hücreleri
    1. Kılcal (alt) kanalı 200 μL Endotel Bakım ortamı ile nazikçe yıkayın ve çıkış portunun çevresini dikkatlice aspire edin.
    2. İdrar (üst) kanalını 200 μL DMEM/F12 ile yıkayın ve çıkışın çevresini dikkatlice aspire edin. Giriş ve çıkış portlarına ~50 μL DMEM/F12 bırakın.
    3. Orta Mezoderm İndüksiyon ortamını 12 delikli plakanın her bir kuyucuğundan aspire edin.
      NOT: Farklılaşmanın sonundaki her kuyucuk yaklaşık 1,5 milyon IM hücresi verir.
    4. 12 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL Tripsin-EDTA ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    5. Bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri nazikçe kazıyın ve bir P1000 kullanarak hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı pipet yapın. Her bir kuyucuğa 2 mL Tripsin Nötralizasyon çözeltisi (Ek Tablo S1) ekleyin. Hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. DMEM/F12 ile hücre süspansiyon hacmini 50 mL'ye getirin ve 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın.
    6. Süper natantı aspire edin. Yaklaşık 3 milyon hücre / 500 μL elde etmek için 500 μL Ara Mezoderm İndüksiyon ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.
    7. Çipi, aspiratöre bağlı P200 bariyer ucu ile idrar (üst) kanalının çıkışından uzakta sıkıca tutun. Yaklaşık 112.500 IM hücreli 25 μL hücre süspansiyonunu çipin idrar (üst) kanalına sıkıca enjekte edin ve ortamı çıkışın çevresinden dikkatlice aspire edin.
    8. Mikroskop altında kabarcıklar veya düzensiz bir IM hücre tohumlama yoğunluğu olup olmadığını kontrol edin. Çip tutucu kartuşuna 3 mL PBS ekleyin. 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    9. Her iki kanalı da kendi hücre kültürü ortamlarından 200 μL ile yıkayın, harcanan ortamın ve hücre kalıntılarının geriye doğru akışını önlemeye yardımcı olmak için talaş çıkışlarının çevresini dikkatlice aspire edin.
    10. Boş P200 bariyer uçlarını idrar ve kılcal kanalların her iki çıkışına da takın. 200 μL Endotel Bakım Ortamı pipeti ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın, böylece kanalın hem girişi hem de çıkışı artık ortamla doldurulmuş pipet uçlarına tutturulacaktır.
    11. Pipet 200 μL IM bakım ortamı ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın, böylece kanalın hem girişi hem de çıkışı artık ortamla doldurulmuş pipet uçlarına tutturulacaktır. Talaşları gece boyunca 37 ° C'ye gömülü uçlarla inkübe edin.
  3. Sıvı akışı ve mekanik gerinim uygulamak için çipleri Organ Çipi Biyoreaktörüne bağlayın.
    1. P200 uçlarını idrar ve kılcal kanallardan çıkarın. Kurumayı önlemek için idrar ve kılcal kanalların giriş ve çıkışına ilgili ortamın damlacıklarını ekleyin.
    2. İdrar giriş haznesine 3 mL sıcak Podosit İndüksiyon ortamı (Ek Tablo S1) ekleyin. Kılcal giriş rezervuarına 3 mL sıcak Endotel Bakım ortamı ekleyin.
    3. Doğrudan çıkış portu üzerindeki idrar kanalı çıkış rezervuarına 300 μL sıcak Podosit İndüksiyon ortamı ekleyin. Doğrudan çıkış portu üzerindeki kılcal kanal çıkış rezervuarına 300 μL sıcak Endotel Bakım ortamı ekleyin.
    4. Baklaları tepsiye ve Organ Çipi Biyoreaktörüne kaydırın.
    5. Prime Cycle'ı (2 dk) seçmek ve başlatmak için Organ Çipi Biyoreaktörü üzerindeki Döner Kadranı kullanın. Bölmenin alt tarafında, dört akışkan bağlantı noktasının tümünde küçük damlacıklar olup olmadığını görsel olarak kontrol edin.
    6. Pod'un alt tarafı ile mikroakışkan çip bağlantı noktaları arasında sıvı-sıvı teması sağlamak için, çip taşıyıcısını yavaşça Pod'un içine kaydırın. Çip taşıyıcı tırnağını yavaşça içeri ve yukarı doğru bastırın. Talaş yüzeyinden fazla ortamı aspire edin.
    7. Organ Çipi Biyoreaktörü akış hızını 60 μL/s olarak ayarlayın. Döngüsel gerinimi 0,4 Hz'de %10'a ayarlayın. Organ Çipi Biyoreaktörü üzerindeki Döner Kadranı kullanarak Düzenleme Döngüsünü seçin ve 2 saat boyunca çalıştırın.
    8. Çıkış rezervuarlarını ortam seviyesinde bir artış olup olmadığını görsel olarak inceleyin.
    9. Düzenleme döngüsünü seçmek için Organ Çipi Biyoreaktörü üzerindeki döner kadranı kullanın.

7. 17-21 ve sonraki günler: podosit indüksiyonu ve talaş bakımı

  1. Ortamı idrar kanalı çıkış rezervuarlarından çapraz olarak limandan uzağa aspire edin, ancak kültürün her günü rezervuarda bir miktar ortam bulundurun. İdrar kanalı giriş rezervuarını 5 gün boyunca her 2 günde bir 3 mL'ye kadar Podosit İndüksiyon ortamı ile doldurun.
    1. 5 gün sonra, ortamı idrar kanalından aspire edin, ancak rezervuarda bir miktar ortam tutun. İdrar kanalı giriş haznesini günlük 3 mL Podosit Bakım ortamı ile doldurun.
  2. Ortamı kılcal kanal çıkış rezervuarlarından çapraz olarak limandan uzağa aspire edin, ancak kültürün her günü rezervuarda bir miktar ortam tutun. Kılcal kanal giriş haznesini günlük olarak 3 mL'ye kadar Endotel Bakım ortamı ile doldurun.

8. Fonksiyonel tahlil ve immünofloresan görüntüleme

NOT: Akış sitometrisi analizi, talaş atık suyu için ELISA ve mRNA izolasyonu hakkında ayrıntılar için Ek Dosya 1'e bakın.

  1. İnülin ve albümin kullanarak fonksiyonel tahlil (moleküler filtrasyon)
    1. Ortamı kılcal kanal çıkış rezervuarından çapraz olarak limandan uzağa aspire edin, ancak rezervuarda bir miktar ortam tutun. 6 saat boyunca inülin ve albümin (Ek Tablo S1) ile desteklenmiş 3 mL Endotel Bakım ortamı ile değiştirin.
    2. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, idrar kanalından ortamın hacmini (mL cinsinden) ölçün ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Işıktan korumak ve florofor konjuge inülin ve albüminin fotobeyazlatmasını en aza indirmek için tüpü alüminyum folyoya sarın. Rezervuarı 3 mL Podosit Bakım ortamı ile doldurun.
    3. Podosit Bakım ortamında bir stok inülin çözeltisi hazırlayın. 25 μg / mL İnülinden başlayarak, Podosit Bakım ortamında 2x seri seyreltme yoluyla sekiz inülin standardı hazırlayın.
    4. Benzer şekilde, Podosit Bakım ortamında bir albümin stok çözeltisi hazırlayın. 150 μg/mL albüminden başlayarak, Podosit Bakım ortamında 2x seri seyreltme yoluyla sekiz standart albümin hazırlayın.
    5. Her standart inülin konsantrasyonunun 100 μL'sini siyah, 96 delikli bir plakanın (veya toplam 16 inülin kuyucuğunun) her bir kuyucuğuna kopyalayan pipet. Her standart albümin konsantrasyonunun 100 μL'sini aynı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna (toplam 16 albümin kuyucuğu) kopyalayan pipet. Boş olarak kullanılmak üzere 100 μL Podosit Bakım ortamındaki pipet (veya Podosit Bakım ortamının toplam iki kuyucuğu).
    6. Pipet, idrar kanalından aynı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL atık su ortamını çoğaltın. Kılcal kanaldan 100 μL atık su ortamını çoğaltın.
    7. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve albümin için floresanı 550 nm uyarma ve emisyon 615 nm'de ölçün. İnülin için aynı plakayı 513 nm uyarımda ve emisyon 577 nm'de ölçün.
    8. Oluşturulan verilerden, yinelenen ölçümlerin ortalaması (çip başına). Bu plaka okumasına karşılık gelen boş değeri, sayfadaki verilerin geri kalanından çıkarın.
    9. X ekseninde konsantrasyon [μg / mL] ve y ekseninde floresan ile standart bir eğri oluşturmak için albümin standartlarına karşılık gelen değerleri çizin. X ekseninde konsantrasyon [μg / mL] ve y ekseninde floresan ile standart bir eğri oluşturmak için inülin standartlarına karşılık gelen değerleri çizin.
    10. Çiplerden atık su ortamında sırasıyla idrar inülin ve albümin konsantrasyonunu belirlemek için istatistiksel bir analiz yazılım paketi ve doğrusal enterpolasyon kullanın.
    11. (1)2 denklemini kullanarak çiplerden inülin/albüminin idrar klerensini belirleyin:
      İdrar Klirensi = ([U] × UV) / [P] (1)
      [U] 'nun 8.1.10 adımındaki idrar konsantrasyonu olduğu durumlarda, UV 8.1.2 adımından toplanan idrar kanalı atık suyunun hacmidir ve [P] inülin veya albüminin kılcal konsantrasyonudur (10 μg / mL inülin veya 100 μg / mL albümin).
  2. İmmünofloresan görüntüleme
    1. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına boş bir P200 ucu enjekte edin. Hücreleri sabitlemek için, 200 μL% 4 formaldehit pipeti yapın ve yarısını alt kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın.
    2. Pipet 200 μL% 4 formaldehit ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın, böylece kanalın hem girişi hem de çıkışı artık fiksatif ile doldurulmuş pipet uçlarına tutturulacaktır.
    3. Cipsleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
    4. 20 dakika sonra tüm pipet uçlarını atın. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına temiz, boş P200 uçları enjekte edin. Hücreleri geçirgenleştirmek için, %0,125 Triton X-100/PBS'nin 200 μL'lik pipetini alın ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın.
    5. %0,125 Triton X-100/PBS'lik 200 μL pipet ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın. Çipi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
    6. Tüm pipet uçlarını atın. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına temiz, boş P200 uçları enjekte edin. Hücreleri bloke etmek için, %0.125 Triton X-100/PBS'de 200 μL %1 sığır serum albümini (BSA) pipetleyin ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın.
    7. %0.125 Triton X-100/PBS'de 200 μL %1 BSA pipet ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
    8. Tüm pipet uçlarını atın. Her kanala %0,125 Triton X-100/PBS'lik 200 μL pipetleme yaparak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe ederek her iki kanalı da 3 kat yıkayın.
    9. % 0.125 Triton X-100 / PBS'de üretici tarafından önerilen seyreltme ile kanal başına 100 μL birincil antikor hazırlayın. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına temiz, boş P200 uçları enjekte edin. Pipet 100 μL primer antikor ve yarısını ilgili kanallara enjekte edin. Pipet ucunu girişin içinde serbest bırakın.
    10. Oda sıcaklığında 1 saat veya daha iyi sonuçlar için 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.
      NOT: Aynı anda birden fazla primer antikor uygulanabilir; Bununla birlikte, birincil antikor çözeltisi üreticinin talimatlarına göre seyreltilmelidir.
    11. Kanalları adım 8.2.8'de açıklandığı gibi 3 x 10 dakika yıkayın.
    12. % 0.125 Triton X-100 / PBS'de üretici tarafından önerilen seyreltme faktörü ile kanal başına 100 μL ikincil antikor hazırlayın. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına temiz, boş P200 uçları enjekte edin. Pipet 100 μL sekonder antikor ve yarısını ilgili kanallara enjekte edin. Pipet uçlarını girişin içinde serbest bırakın. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
      NOT: Her sekonder antikor ayrı ayrı uygulanmalıdır. Adım 8.2.8'e göre her uygulama arasında en az 3 x 10 dakika yıkayın.
    13. Kanalları adım 8.2.8'de açıklandığı gibi 3 x 10 dakika yıkayın.
    14. Her iki kanalı da 200 μL damıtılmış su ile bir kez yıkayın ve artık sıvıyı talaş çıkış portlarının çevresinden emin.
    15. Temiz, boş P200'ü idrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına enjekte edin. Hücreleri boyamak için, 200 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, damıtılmış suda 1:1.000 seyreltme) pipeti yapın ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içine bırakın ve 200 μL DAPI pipeti ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin. Pipet ucunu girişin içine bırakın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    16. Tüm pipet uçlarını atın. İdrar ve kılcal kanalların çıkış portlarına temiz, boş P200 uçları enjekte edin. Hücreleri boyamak için, 200 μL falloidin pipeti (Ca 2+ve Mg 2+ olmadan PBS'de 1:1.000 seyreltme) ve yarısını kılcal kanal girişine enjekte edin ve pipet ucunu girişin içine bırakın. Pipet 200 μL falloidin (Ca 2+ve Mg 2+ olmadan PBS'de 1:1.000 seyreltme) ve yarısını idrar kanalı girişine enjekte edin ve pipet ucunu girişin içine bırakın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
    17. Kanalları Ca 2+ve Mg 2+ olmadan 200 μL PBS ile 3 kat yıkayın ve çıkış portlarının çevresinden fazla sıvıyı aspire edin.
    18. Çipleri görselleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, glomerulusun fonksiyonel bir 3D in vitro modelinin, izojenik bir insan iPS hücresi kaynağından vaskülarize edilebileceğini ve epitelize edilebileceğini gösteriyoruz. Spesifik olarak, bu protokol, insan iPS hücre teknolojisinin, özellikle de özel hücre tiplerine farklılaşma yeteneklerinin, insan böbreğinin yapısını ve işlevini hastaya özgü düzeyde modellemek için mikroakışkan cihazlarla entegre edilebilen böbrek glomerüler epiteli (podositler) ve vasküler endotel (viECs) üretmek için nasıl uygulanacağına ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, izojenik bir insan iPS hücre hattından vasküler endotel ve glomerüler epitel (podositler) elde etmek için bir protokol ve bu hücrelerin böbrek glomerulusunun yapısını, doku-doku arayüzünü ve moleküler filtrasyon fonksiyonunu taklit eden bir çip üzerinde 3D organ sistemi oluşturmak için kullanımını özetlemekteyiz. Bu glomerulus çipi, birlikte seçici filtre moleküllerine bir bariyer sağlayan endotel ve glomerüler epitel ile donatılmıştır.

Bu protokolü uyarlamak isteyen araştırmacılar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SM, insan iPS hücrelerinden podosit farklılaşması ile ilgili bir patent üzerinde mucittir. Diğer yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Duke Üniversitesi'ndeki Pratt Mühendislik Okulu, Duke Tıp Bölümü'ndeki Nefroloji Bölümü, Biyomedikal Araştırmalarda Whitehead Bursu ve S. Musah için Genentech Araştırma Ödülü tarafından desteklenmiştir. Y. Roye, Duke Üniversitesi-Alfred P. Sloan Vakfı Bursu ve Duke Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nden William M. "Monty" Reichert Yüksek Lisans Bursu'na sahiptir. DU11 (Duke Üniversitesi klon #11) iPS hücre hattı, Duke iPSC Çekirdek Tesisi'nde üretildi ve bize Duke Üniversitesi'ndeki Bursac Laboratuvarı tarafından sağlandı. Yazarlar N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya ve Y. Zhou'ya teknik yardım ve yararlı tartışmalar için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Musah Lab üyelerine makale hakkındaki yararlı yorumları için teşekkür eder. Yazarlar, Segura Lab'a bir Acuri C6 akış sitometresinin hediyesi için teşekkür ediyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antikorlar< / güçlü >
Alexa Fluor 488- ve Alexa Fluor 594 konjuge ikincil antikorlarThermo / Life TechnologiesA32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Kollajen IVTermo / Yaşam Teknolojileri14-9871-82
NefrinProgenGP-N2
PECAM-1R& D SistemleriAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherinSanta Cruzsc-9989
bazal membran matrisleri
Corning Fibronektin, İnsanCorning356008Bazal membran (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) parçasıIwai Kuzey AmerikaN8922012Bazal membran matrisi (2)
Matrigel hESC onaylı matris, 5 mL'lik flakonBD Biosciences354277Bazal membran matrisi (1); partiden partiye varyasyon gösterebilir
Hücreler
DU11 insan iPS hücreleriDU11 (Duke Üniversitesi klonu # 11) iPS hücre hattı, Duke iPSC Çekirdek Tesisinde üretildi ve bize Duke Üniversitesi'ndeki Bursac Laboratuvarı tarafından sağlandı. Hat test edildi ve mikoplazma (Kasım 2021'deki son test) ve karyotip anormallikleri (Temmuz 2019)
Kültür ortamı büyüme faktörleri ve ortam takviyeleri
0.5M EDTA, pH 8.0Invitrojen15575020
2-MerkaptoetanolTermo/Yaşam Teknolojileri21985023
Sığır serumundan Albümin, Texas Red konjugeThermo / Life TechnologiesA23017
All-trans retinoik asit (500 mg)Kök Hücre Teknolojileri72262
B27 serumsuz takviyeThermo / Life Technologies17504044
A Vitamini içermeyen B-27 takviyesi (50x)Thermo / Life Technologies12587010
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004Partiden partiye değişiklik gösterebilir
CultureBoost-RHücre Sistemleri4Z0-500-RPodosit bakım ortamı
DMEM/F12Termo/Yaşam Teknolojileri12634028
GlutaMAX takviyeli DMEM/F12Termo/Yaşam Teknolojileri10565042Glutaminli
DMEM/F12Forskolin (Adenilil siklaz aktivatörü)Abcamab120058
GlutaMAX takviyesiThermo/Life Technologies35050061glutamin takviyesi
Isı ile inaktive edilmiş FBSThermo/Life Technologies10082147
Heparin solüsyonuKök Hücre Teknolojileri7980
İnsan Aktivin ATermo/Yaşam TeknolojileriPHC9544
İnsan BMP4Preprotech120-05ET
İnsan BMP7Termo/Yaşam TeknolojileriPHC9544
İnsan VEGFTermo/Yaşam TeknolojileriPHC9394
Inulin-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 ortaKök Hücre Teknolojileri05850İnsan iPS hücre kültürü ortamı (CCM). Üreticiye göre 5x takviye ekleyin. İnsan iPS CCM, -20 ° C'de 6 aya kadar saklanabilir.
N-2 Takviyesi (100x)Termo/Yaşam Teknolojileri17502048
Nörobazal ortamTermo/Yaşam Teknolojileri21103049Lateral mezoderm bazal ortam
PBS (Fosfat tamponlu salin)Thermo/Life Technologies14190-250
Penisilin-streptomisin, sıvı (100x)Thermo/Life Technologies15140-163
KAYA inhibitör (Y27632)Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011Endotel hücre kültürü ortamı (CCM). Üreticiye göre ek ekleyin. Endotelyal CCM, 4 ° C'de iki haftaya kadar saklanabilir; C veya -20 derece & derece; 6 aya kadar C.
TGF-Beta inhibitörü (SB431542)Kök Hücre Teknolojileri72234
Enzimler ve diğer reaktifler
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501Hücre ayırma tamponu
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Etanol çözeltisi, %70 (hacim/hacim), biyoteknoloji sınıfıVWR97065-058
Paraformaldehit (PFA)Termo/Yaşam Teknolojileri28906
Steril damıtılmış suTermo/Yaşam Teknolojileri15230162
Triton X-100VWR97062-208
Ekipman
Tripsin EDTA, %0.05Termo/Yaşam Teknolojileri25300-120
(Orb) Hub modülüORB-HM1'itaklit et
100 mm x 15 mm yuvarlak petri kabıFisherbrandFB087579B
120 x 120 mm kare hücre kültürü kabıVWR688161
Accuri C6BD Biosciences
Aspirasyonlu pipetler, ayrı ayrı sarılmışCorning29442-462
Aspirasyon ÜnitesiSP Bel-ArtF19917-0150
Avanti J-15R SantrifüjBeckman CoulterB99516
Konik santrifüj tüpü, 15 mLCorning352097
Konik santrifüj tüpü, 50 mLCorning352098
EVOS M7000Thermo/Life TechnologiesAMF7000Sabit ve lekeli görüntülerin alınması için floresan mikroskop Hücre.
HemositometreVWR100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 inkübatörüThermo/Life Technologies51030403
AxioCam 503 kamera ile donatılmış Ters Zeiss AxioGözlemcisi Carl Zeiss Mikroskopi491916-0001-000 (mikroskop) ; 426558-0000-000(kamera)
Kimberly-Clark nitril eldivenVWR40101-346
Kimwipes, büyükVWR21905-049
Leoca SP8 Dik Konfokal Mikroskop
Medya rezervuarı (POD Taşınabilir Modül)POD-1'iedin
Mikroplaka çalkalayıcıVWR12620-926
Organ çipiTaklitS-1 Çip
Organ çipi tutucuAK-CCR
P10'u taklit edin hassas bariyerli pipet uçlarıDenville ScientificP1096-FR
P100 bariyerli pipet uçlarıDenville ScientificP1125
P1000 bariyerli pipet uçlarıDenville ScientificP1121
P20 bariyerli pipet uçlarıDenville ScientificP1122
P200 bariyerli pipet uçlarıDenville ScientificP1122
Plazma AsherQuorum teknolojisiK1050X RFBu Plazma Aşındırıcı/Asher/Temizleyici, Duke Üniversitesi'nin Paylaşılan Malzeme Enstrümantasyon Tesisi'nin (SMiF) bir parçası olarak kullanıldı.
Hücre süzgeci geçmeli kapaklı yuvarlak tabanlı polistiren test tüpüCorning352235
Serolojik pipet, 10 mL, ayrı ayrı sarılmışCorning356551
Serolojik pipet, 25 mL, ayrı ayrı sarılmışCorning356525
Serolojik pipet, 5 mL, ayrı ayrı sarılmışCorning356543
Steriflip, 0.22 & mikro; m, PESEMD MilliporeSCGP00525
Steril Mikrosantrifüj tüpleriThomas Scientific1138W14
T75cm2 havalandırma kapaklı hücre kültürüşişesi Corning430641U
Doku kültürü ile tedavi edilmiş 12 oyuklu plakalarCorning353043
Vakum modülatörü ve perstaltik pompa (Zoe Kültür Modülü)ZOE-CM1Organ Çipi BiyoreaktörünüTaklit Edin
VE-Cadherin CD144 anti-insan antikoru - APC konjugeMiltenyi Biotec130-126-010
Geniş eğimli hücre kaldırıcıCorning3008
MACS
CD144 MicroBeads, insanMiltenyi Biotec130-097-857
CD31 Mikro Boncuk Kiti, insanMiltenyi Biotec130-091-935
LS sütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401
içermediği bulundu ile eksiksiz orta kit taklit Doku kültürü ile tedavi edilmiş 6 oyuklu plakalar Corning 353046

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
  3. Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656(2019).
  4. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12(2011).
  5. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  6. Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812(2013).
  7. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  10. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  11. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).
  12. Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967(2021).
  13. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
  14. Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
  15. Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  16. Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010(2012).
  17. Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394(2021).
  18. Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
  19. Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kidney Glomerulus ChipInduced Pluripotent Stem CellsIsogenic Organ ChipGlomerular Filtration BarrierPodocyte DifferentiationVascular Endothelial CellsMicrofluidic ChipNephrotoxicity TestingPrecision MedicinePatient Specific Disease Modeling

Related Articles