Şişmiş Dokunun Titreşimli Görüntülenmesi ve Analizi ile Sağlanan Etiketsiz Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Özet

Protokol, numune genişletme hidrojel kimyasını etiketsiz kimyasala özgü uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ile birleştirerek, biyolojik numunelerde etiketsiz süper çözünürlüklü hacimsel görüntülemenin nasıl elde edileceğini açıklar. Ek bir makine öğrenmesi görüntü segmentasyon algoritması ile, antikor etiketlemesi olmayan dokularda proteine özgü çok bileşenli görüntüler elde edildi.

Özet

Floresan mikroskobunun evrensel kullanımı, özellikle süper çözünürlüklü mikroskopi, modern biyoloji hakkında büyük ölçüde gelişmiş bilgiye sahiptir. Tersine, floresan tekniklerinde florofor etiketleme gerekliliği, foto ağartma ve floresan probların tek tip olmayan etiketlenmesi ve uzun süreli numune işleme gibi önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu protokolde, şişmiş dokunun titreşimsel görüntülenmesi ve analizi (VISTA) ile ilgili detaylı çalışma prosedürleri sunulmaktadır. VISTA, floroforlarla ilişkili engelleri aşar ve biyolojik numunelerde 78 nm'ye kadar uzaysal çözünürlükle etiketsiz süper çözünürlüklü hacimsel görüntüleme sağlar. Prosedür, hücrelerin ve dokuların hidrojel içine gömülmesi, hidrojel numune hibritinin izotropik olarak genişletilmesi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ile titreşimsel görüntüleme ile endojen protein dağılımlarının görüntülenmesiyle oluşturulur. Yöntem hem hücreler hem de fare beyin dokuları üzerinde gösterilmiştir. Görüntüleme özgüllüklerinin protein kökenini doğrulayan yüksek korelasyonlu VISTA ve immünofloresan görüntüler gözlendi. Bu tür bir korelasyondan yararlanarak, etiketsiz fare beyni görüntülerinden çekirdeklerin, kan damarlarının, nöronal hücrelerin ve dendritlerin çok bileşenli tahminini elde etmek için makine öğrenimi tabanlı bir görüntü segmentasyon algoritması eğitildi. Prosedür ayrıca, hücrelerdeki patolojik poli-glutamin (poliQ) agregatlarını ve yüksek verime sahip beyin dokularındaki amiloid-beta (Aβ) plaklarını araştırmak için uyarlandı ve bu da büyük ölçekli klinik örnekler için potansiyelini haklı çıkardı.

Giriş

Optik görüntüleme yöntemlerinin gelişimi, modern biyoloji anlayışında devrim yaratmıştır, çünkü hücre altı proteinlerden tüm organlara kadar farklı ölçeklerdeki hedeflerin benzeri görülmemiş uzamsal ve zamansal bilgilerini sağlarlar¹. Bunlar arasında, floresan mikroskobu, yüksek sönme katsayılarına ve kuantum verimlerine² sahip geniş bir organik boya paleti, kullanımı kolay genetik kodlanmış floresan proteinleri³ ve nanometre ölçekli yapıları görüntülemek için STED, PALM ve STORM gibi süper çözünürlüklü yöntemler ile en iyi bilinen olanıdır ^4,5. Ek olarak, şişirilebilir polimer hidrojeller ^6,7,8 içine gömülü numuneleri genişleten numune mühendisliği ve koruma kimyasındaki son gelişmeler, geleneksel floresan mikroskoplarda alt kırınım sınırlı çözünürlüğü mümkün kılar. Örneğin, tipik genleşme mikroskobu (ExM), dört kat izotropik numune genişletme⁷ ile görüntü çözünürlüğünü dört kat artırır.

Avantajlarına rağmen, süper çözünürlüklü floresan mikroskobu, florofor etiketlemesinden kaynaklanan sınırlamaları paylaşır. İlk olarak, foto-ağartma ve floroforların inaktivasyonu, tekrarlayan ve kantitatif floresan değerlendirmeleri için kapasiteyi tehlikeye atar. Foto ağartma, ışığın elektronları elektronik olarak uyarılmış durumlara^pompalamaya devam ettiği kaçınılmaz bir olaydır 9. İkincisi, floroforları istenen hedeflere etiketlemek her zaman basit bir iş değildir. Örneğin, immün boyama, uzun ve zahmetli bir numune hazırlama süreci gerektirir ve görüntüleme verimini engeller¹⁰. Ayrıca, özellikle derin iç dokular olmak üzere, homojen olmayan antikor etiketlemesi nedeniyle artefaktlar da ortaya çıkarabilir¹¹. Ayrıca, istenen proteinler için floroforları hedefleyen uygun etiketleme stratejileri az gelişmiş olabilir. Örneğin, Aβ plakları¹² için etkili antikorlar bulmak için kapsamlı taramalar gerekliydi. Kongo kırmızısı gibi daha küçük organik boyalar genellikle sınırlı özgüllüğe sahiptir, sadece Aβ plağının çekirdeğini boyar. Bu nedenle, florofor etiketlemenin dezavantajlarını ortadan kaldıran ve hücrelerden dokulara ve hatta büyük ölçekli insan örneklerine kadar tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan etiketsiz bir süper çözünürlük modalitesinin geliştirilmesi son derece arzu edilir.

Raman mikroskobu, kimyasala özgü yapılar için etiketsiz kontrast sağlar ve uyarılmış titreşim geçişlerine bakarak aksi takdirde görünmez olan kimyasal bağların dağılımını haritalandırır¹³. Özellikle, etiketsiz veya küçük etiketli numuneler üzerinde uyarılmış Raman saçılımı (SRS) görüntülemenin, floresan mikroskobuna benzer hız ve çözünürlüğe sahip olduğu gösterilmiştir^14,15. Örneğin, sağlıklı beyin bölgesi, insan ve fare dokularında tümör infiltrasyonu olan bölgeden kolayca ayırt edilmiştir^16,17. Aβ plakları ayrıca, herhangi bir etiketleme yapılmadan taze donmuş bir beyin dilimi üzerinde protein_CH3 titreşimi (2940 ^cm-1) ve amid I (1660 ^cm-1) hedeflenerek net bir şekilde görüntülendi¹⁸. Bu nedenle Raman saçılması, floroforların sınırlamalarının üstesinden gelen sağlam, etiketsiz kontrast sunar. Daha sonra soru, biyolojik örneklerde nano ölçekli yapısal detayları ve işlevsel çıkarımları ortaya çıkarabilecek Raman saçılımı kullanılarak süper çözünürlük kapasitesinin nasıl elde edilebileceği haline geldi.

Zarif optik enstrümantasyonlarla Raman mikroskobu için süper çözünürlük elde etmek için kapsamlı çabalar sarf edilmiş olsa da, biyolojik numuneler üzerindeki çözünürlük artışı oldukça sınırlı olmuştur 19,20,21. Burada, son çalışmalara^22,23 dayanarak, Şişmiş Dokuların Titreşimsel Görüntülemesi ve Analizi (VISTA) olarak adlandırılan, süper çözünürlüklü etiketsiz titreşimli görüntüleme için bir örnek genişletme stratejisini uyarılmış Raman saçılımı ile birleştiren bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, hücreler ve dokular, optimize edilmiş bir protein-hidrojel hibridizasyon protokolü yoluyla hidrojel matrislerine gömüldü. Hidrojel doku hibritleri daha sonra delipidasyon için deterjan açısından zengin çözeltilerde inkübe edildi, ardından suda genleşme yapıldı. Genişletilmiş numuneler daha sonra, tutulan endojen proteinlerden CH₃ titreşimlerini hedefleyerek düzenli bir SRS mikroskobu ile görüntülendi. VISTA, etiketsiz görüntüleme özelliği sayesinde, florofor etiketlemeden kaynaklanan foto ağartma ve homojen olmayan etiketlemeyi atlayarak, çok daha yüksek numune işleme verimi sağlar. Bu aynı zamanda bildirilen ilk 100 nm altı (78 nm'ye kadar) etiketsiz görüntülemedir. Tipik SRS kurulumu^22,24'ün yanı sıra ek optik enstrümantasyon gerekmez, bu da onu kolayca uygulanabilir hale getirir. Korelasyonlu VISTA ve immünofloresan görüntülerle, tek kanallı görüntülerden proteine özgü multipleks görüntüler oluşturmak için yerleşik bir makine öğrenimi görüntü segmentasyon algoritması^25,26 eğitildi. Yöntem, fare beyin dokularındaki Aβ plaklarını araştırmak için daha da uygulandı ve hücre çekirdeği ve kan damarları ile çevrili plak çekirdeği ve periferik filamentlerin ince görünümlerine dayalı olarak alt fenotipleme için uygun bütünsel bir görüntü sağladı.

Protokol

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri, California Institute of Technology Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve protokol prosedürleri ilgili tüm etik düzenlemelere uygundur.

1. Fiksasyon ve numune genişletme için stok çözeltilerinin hazırlanması

1. Önce 12 g akrilamid (% 30 w / v) katıyı 26 mL nükleaz içermeyen suda çözerek 40 mL fiksasyon çözeltisi hazırlayın. Daha sonra karışıma 10 mL %16 PFA stok çözeltisi ekleyin. Son olarak, 4 mL 10x fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ekleyin. Hazırlanan çözelti 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
   NOT: Akrilamid tehlikelidir, bu nedenle akrilamid katısının suda çözülmesi adımı bir davlumbazda yapılmalıdır.
2. 70 mg sodyum akrilat (%7 a/h), 200 mg akrilamid (%20 a/h) ve 50 μL N, N'-metilenbisakrilamid (%0.1 a/h) 420 μL ultra saf suda çözerek jelleşme çözeltisi (stok X) hazırlayın. Sonunda 57 μL steril filtrelenmiş 10x PBS (pH 7.4) ekleyin ve bu solüsyonu -20 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
   NOT: Topaklar oluşturan sodyum akrilat katıdan kaçının; Kullanılan sodyum akrilatın dağıtıcı tozlar şeklinde olduğundan emin olun. Yapılan stok X renksiz bir sıvı olacaktır; Sıvı açık sarı görünüyorsa, yeni sodyum akrilat elde edin.
3. 1 g amonyum persülfatı (APS, %10 a/a) 9 mL nükleaz içermeyen suda çözerek polimerizasyon başlatıcı çözeltisini hazırlayın. Benzer şekilde, 1 g tetrametiletilendiamin (TEMED, %10 a/a) 9 mL nükleaz içermeyen suda çözerek polimerizasyon hızlandırıcı çözelti hazırlayın. Elde edilen çözeltileri ayırın ve -20 °C'de saklayın.
4. 2.88 g sodyum dodesil sülfat (SDS, 200 mM), 0.584 g sodyum klorür (200 mM) ve 2.5 mL 1M Tris-HCl tamponunu (50 mM, pH 8) nükleaz içermeyen suda çözerek 50 mL denatüre edici tampon hazırlayın.
   NOT: SDS konsantrasyonu doyma durumuna yakındır. Tamponda bir miktar kristalleşme normaldir. 37 °C'ye kadar hafifçe ısıtmak, çözeltiyi berrak ve kullanıma hazır hale getirebilir.

2. Memeli hücre örneklerinin hazırlanması

1. 3.5 x 10⁴ HeLa hücrelerini 24 oyuklu bir plakada 12 mm'lik bir borosilikat lamel (# 1.5) üzerine tohumlayın ve daha sonra hücreleri 400 μL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin antibiyotik (tam DMEM) ile 37 ° C'de% 5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir atmosfer altında kültürleyin.
2. Farklı mitotik aşamalarda hücreler elde etmek için, hücreleri %60 birleşmeye kadar tam DMEM'de inkübe edin. Daha sonra, hücre aşamalarını senkronize etmek için hücreleri 20 saat boyunca fetal sığır serumu olmadan DMEM ile tedavi edin. Senkronizasyondan sonra, hücrelerin DMEM'i tamamlaması için ortamı değiştirin ve mitozun çeşitli aşamalarını hedeflemek için 2-6 saat daha inkübe edin.
3. HeLa hücrelerini lameller üzerinde steril PBS ile yıkayın ve daha sonraki işlemlerden önce 37 ° C'de 7-8 saat boyunca fiksasyon solüsyonu (PBS'de% 4 PFA% 30 akrilamid [AA]) ile inkübe edin.
   NOT: Yüksek konsantrasyonda akrilamid ile birlikte daha yüksek fiksasyon sıcaklığı, fiksasyon işlemleri sırasında proteinler arasındaki moleküller arası çapraz bağın söndürülmesine yardımcı olur ve proteinlerin ayrıntılı ultra yapılarını koruduğu bildirilir⁸.
4. PolyQ agregatlarına sahip hücreler için, hücreleri %70-90 birleşmeye ulaşana kadar tam DMEM'de büyütün. Yeni tam DMEM'e geçtikten sonra, mHtt97Q-GFP'yi kodlayan 1 μg plazmiti transfeksiyon ajanı kullanarak hücrelere aktarın (ayrıntılar Malzeme Tablosunda). Üreticinin protokolüne göre transfeksiyon gerçekleştirin.
5. 24-48 saat transfeksiyondan sonra, kültür ortamını çıkarın ve hücreli lamellere 800 μL fiksasyon solüsyonu (% 4 PFA,% 30 AA) ekleyin. Lamelleri 37 °C'de 6-8 saat inkübe edin. Lameli PBS 3x ile yıkayın ve elde edilen hücre numuneleri daha sonraki işlemler için hazırdır.

3. Fare beyin örneklerinin hazırlanması

1. Ticari kaynaklardan C57BL/6J fareleri (6 ila 8 haftalık, erkek ve dişi, altı fare) ve Alzheimer fareleri (9 aylık, dişi, üç fare) satın alın (ayrıntılar Malzeme Tablosunda). Standart protokol^27'ye göre karbondioksit narkozu yoluyla ötenazi yapın. Kısacası, fareleri bir odaya yerleştirin ve odayı, oda / dakika hacminin% 30 -% 70'i sırasına göre% 100 CO₂ akışıyla doldurun ve klinik ölümden sonra akışı en az 1 dakika koruyun.
2. İnsancıl ötenaziyi onayladıktan sonra, bir makas kullanarak farelerin başını hızla kesin. Kafatasını, orta hattan aşağı doğru deriden büyük bir kesi ile ortaya çıkarın. Kafatasını tamamen ortaya çıkarmak için cildi hayvanın burnuna doğru çekin.
3. Kafatasını ince bir makasla orta hat boyunca kesin ve kafatasının iki yarısını yana doğru soyun. PBS ile beyni buz üzerinde bir Petri kabına çıkarmak için cımbız kullanın. Taze fare beynini buz gibi soğuk PBS ile yıkayın ve beyni 10 mL fiksasyon tamponuna (%4 PFA, %30 AA) aktarın.
4. Fare beynini fiksasyon tamponunda 4 ° C'de 24-48 saat inkübe edin ve ardından gece boyunca 37 ° C'ye aktarın. Steril PBS ile yıkadıktan sonra, fare beynini bir vibratom kullanarak 150 μm'lik bölümler halinde kesin ve 4 °C'de PBS'de saklayın.

4. Hücre ve doku örneklerinin hidrojel gömülmesi, denatürasyonu ve genişletilmesi

1. Numunelerin yukarıda belirtildiği gibi gereken süre boyunca sabitleme tamponunda inkübe edildiğinden emin olun. Stok X, serbest radikal başlatıcı ve hızlandırıcı stok çözeltilerini çözün ve tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.
   NOT: Yetersiz inkübasyon süresi, hidrojel hibrid üzerinde tutulan protein sayısının azalmasına ve bu nedenle sinyalde bir azalmaya neden olabilir.
2. Lameli hücrelerle birlikte alın ve cımbız kullanarak bir cam slayt üzerine yerleştirin. Beyin dilimlerini (150 μm kalınlığında) toplayın ve düz olduklarından emin olarak yumuşak yün bir boya fırçası kullanarak başka bir cam kaydırağın üzerine yerleştirin. Numunelerle birlikte gelen fazla sıvıdan kurtulun.
3. İki lamel (#1.5), aralarına su damlaları ekleyerek, bir jelleşme odası yapmak için numunenin her iki tarafına cam slayt üzerinde istifleyin. Cam slaytı, numune yukarı bakacak şekilde buz gibi soğuk bir ısı bloğunun üzerine yerleştirin ve 4 dakika boyunca 1 °C'ye soğutun.
4. Stok X'e %10 (a/a) TEMED ve ardından %10 APS çözeltisi ekleyin. Hızlı bir şekilde girdap yapın ve karıştırdıktan sonra 1 dakika içinde, elde edilen çözeltiyi, hava kabarcıklarını önleyerek numunenin yüzeyini kaplamak için numunelerin üzerine yavaşça hazneye bırakın. Numuneye eklemeden önce jel oluşumunu (yüksek derecede polimerizasyon) önlemek için çözeltiyi ve numuneleri buz (veya buz gibi soğuk bir ısı bloğu) üzerinde tutun.
5. Numune çözeltiye tamamen daldırıldıktan sonra, numune için bir kapak olarak numunenin üzerine düz, şeffaf, film kaplı bir lamel yerleştirin. Nemlendirme inkübatörünü 37 °C'de 30 dakika inkübe etmeden önce hazneyi 1 dakika daha buz veya buz gibi soğuk bir ısı bloğu üzerinde bırakın.
6. 37 °C inkübatörden cam slayt üzerindeki jelleşme odasını çıkarın. Kapak çıkarıldıktan sonra şeffaf olmayan bir jel gözlenmelidir. Jiletle keserek jeli geri alın veya alternatif olarak cam slaytı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca denatüre edici tampona koyun. Jel kendini cam slayttan ayıracaktır.
7. Daha fazla denatürasyon ve delipidasyon elde etmek için izole edilmiş jeli ısı koşulları altında denatüre edici tamponda inkübe edin. Hücre örnekleri için 95 °C'de 1 saat denatüre edin. 150 μm kalınlığındaki beyin dilimleri için 70 °C'de 3 saat, ardından 95 °C'de 1 saat denatüre edin.
   NOT: Jel, oda sıcaklığında denatüre edici tampon ile ilk kez inkübe edildiğinde kıvırcık hale gelebilir. Bu normaldir ve yüksek sıcaklıkta denatürasyondan sonra düz hale gelecektir. Daha kalın doku örnekleriyle çalışırken, daha uzun bir denatürasyon süresine ihtiyaç vardır.
8. Isıl işlemden sonra denatüre edilmiş numuneyi 3x PBS ile 10 dakika yıkayın. Bu noktada, jel orijinal boyutun yaklaşık 1.5 katına kadar genişlemiş olmalıdır. Daha yüksek bir genleşme oranı elde etmek için yıkanmış jeli büyük bir kapta (jel hacminin en az 20 katı) ultra saf su ile inkübe edin. Suyu her 1 saatte bir 3 kez değiştirin ve numuneyi gece boyunca karanlıkta bırakın. Elde edilen jel görüntülenmeye hazırdır.
   NOT: Genleşme oranı büyük ölçüde orijinal numunenin mekanik özelliklerine bağlıdır. Hücre örnekleri için 4.2 kat genişleme ve beyin dokusu örneği için 3.4 kat genişleme elde edildi.

5. Genişlemiş hücre ve doku örneklerinde endojen protein dağılımının etiketsiz görüntülenmesi

1. Görüntüleme işlemi sırasında genişletilmiş jel örneklerini suda tutun. Jel genleşmeden sonra kırılgandır, bu nedenle dikkatli kullanılmalıdır. Genişletilmiş numune taşıyan jeli, suyla doldurulmuş, uygun açıklık boyutlarına ve derinliklerine sahip bir mikroskop ara parçası ile bir mikroskop lamına (1 mm kalınlığında) yerleştirin. Ara parçayı bir lamel (#1.5) ile örtün ve numune hareketini önlemek için düzgün şekilde kapatıldığından emin olun.
2. Numuneyi, genişletilmiş hücre veya doku ile birlikte, lamel objektife bakacak şekilde motorlu sahneye yerleştirin. Işık yolunu parlak alana değiştirmek ve manuel bir düğme kullanarak z konumunu ayarlamak için yazılımda Oküler'e tıklayın.
3. Numunenin üstüne daldırma yağı ekleyin ve objektiften 25x büyütme ile parlak alan altında izlerken kondansatörü Köhler aydınlatması için doğru konuma ayarlayın. 2940 ^cm-1'de protein CH₃ titreşimini hedeflemek için lazer panelindeki OPO dalga boyu penceresine 791,3 nm girin.
4. LSM düğmesine tıklayarak mikroskobun ışığını parlak alandan (göz merceği) lazer tarama moduna geçirin ve lazer kontrol panelindeki Deklanşör düğmesine basarak SRS lazer deklanşörünü açın. Gerçek zamanlı görüntü alımını başlatmak için mikroskop yazılımındaki CANLI düğmesine basın.
5. Kısa piksel bekleme süresi (12,5 μs/piksel) ve düşük görüntü çözünürlüğü (256 piksel x 256 piksel) altında SRS görüntüsüne bakarken z'yi değiştirerek doğru odağı bulun. İdeal z konumu bulunduğunda, mikroskop yazılımındaki ilgili çubuğu çekerek tarama boyutunu ve piksel bekleme süresini değiştirin.
6. Kilitli amplifikatörün zaman sabitiyle eşleşen daha uzun bir piksel bekleme süresine (1024 μs/piksel) sahip süper örnekleme koşulunu (1024 piksel x 1024 piksel) kullanarak LSM düğmesine basarak görüntüyü elde edin. Z yönünde 1 μm'lik bir adım boyutuna sahip bir z-yığını toplayarak hacimsel görüntüler elde edin. Kaydedilen OIR dosyasını ImageJ kullanarak yazılımdan işleyin ve analiz edin.
   NOT: Detaylı SRS kurulumu yakın zamanda Mutlu ve ^ark.24'te bildirilmiştir. Burada, pompa (770-990 nm) ve stokes (1031.2 nm) için 80 MHz tekrarlama oranına ve 2 ps bant genişliğine sahip ayarlanabilir bir pikosaniye lazer, bir lazer taramalı konfokal mikroskoba yönlendirildi ( Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Saf D₂O ile sinyaller için iki ışının zamansal ve uzamsal örtüşmesini optimize edin. Parlak alan altında genleşmiş numune için doğru z'yi bulmak biraz çaba gerektirir çünkü kırılma indisi jel boyunca çok homojendir.
7. Hem 25x objektif hem de 60x objektif kullanarak polistiren boncukların (100 nm) SRS görüntüsünü alarak VISTA'nın çözünürlüğünü belirleyin. Pompa lazerini, aromatik C-H'nin karakteristiği olan 3050 ^cm-1'lik Raman kaymasına karşılık gelen 784,5 nm'ye ayarlayın, polistirenin titreşimlerini gerer.
   NOT: Burada kullanılan pompa lazer dalga boyu, proteinler için VISTA'da kullanılana benzer.
8. 60x objektif ile, boncuk görüntüsünün deneysel tam dalga yarı maksimumu (genliğin yarısındaki çizgi şeklinin genişliği olan FWHM) 276.17 nm idi. Boncuk nesnesinin işlevini yarım daire olarak modelleyin.
   NOT: PSF Gauss fonksiyonu c (σ) = 269 nm/2.35 olduğunda, kıvrımlı boncuk görüntüsünün ölçülen FWHM'si 276.17 nm olacaktır. Sonuç olarak, SRS sisteminin çözünürlüğü Rayleigh Kriteri ile 269 nm × 1.22 = 328 nm'dir. VISTA, hücre örneklerinde ortalama 4.2 kat genişlemeye sahip olduğundan, etkin çözünürlük 328 nm/4.2 = 78 nm'ye düşmektedir.

6. İmmüno-etiketli ve genişletilmiş doku örneklerinin korelasyon VISTA ve floresan görüntülemesi

1. Denatürasyondan sonra, hidrojel gömülü numuneleri (örn., 150 μm beyin koronal bölümü) 15 dakika boyunca% 1 (h / h) Triton X-100 (PBST) içinde ön inkübe edin. İnkübasyon tamponunu 1:100 seyreltmede birincil antikor ile PBST'ye geçirin. Multipleks görüntüleme için birden fazla protein hedefine ihtiyaç duyulursa, farklı hedefler için ilgili birincil antikorları aynı kokteylde uygun konsantrasyonlara seyreltin ve örneklerle aynı anda inkübe edin.
2. Jelleri seyreltilmiş birincil antikorlarla 37 ° C'de 80 rpm'de 16-18 saat boyunca hafifçe çalkalayın, ardından 37 ° C'de 1-2 saat boyunca PBST ile 3x kapsamlı yıkama yapın. Burada ve sonraki tüm inkübasyonlarda homojen olmayan antikor etiketlemesini önlemek için inkübasyon sırasında jeli ters çevirin.
3. Numuneleri, ışıktan korunarak 37 ° C'de 12-16 saat boyunca PBST ile 1:100 seyreltmede karşılık gelen tür hedeflerinin ikincil antikorları ile inkübe edin. Etiketli hidrojel numunelerini 3x PBST ile 37 °C'de 1-2 saat hafifçe çalkalayarak yıkayın.
4. DAPI'yi PBS'de 3 μM nihai konsantrasyona seyreltin. Jelin çözeltiye daldırılması için numune hidrojeline yeterli miktarda DAPI çözeltisi ekleyin. 80 rpm'de hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin. Numuneyi 3x PBS ile yıkayın.
5. İmmüno-etiketli jel örneklerini büyük miktarda çift deiyonize H₂O ile inkübe ederek genişletin. Suyu her 1 saat 3 kez değiştirin ve örnekleri gece boyunca ışıktan koruyarak H₂O'da inkübe edin. Etiketleme sırasında jel, PBS tamponuna kıyasla 1,5 kat genleşmelidir.
6. Görüntüleme örneğini adım 5.1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Görüntüleme örneğini, floresan görüntüleme için 25x, 1.05 NA, suya daldırma objektifi ile lazer taramalı konfokal mikroskobu yerleştirin.
7. Mikroskop yazılımındaki açılır menüde hedeflenen antikorlara göre ilgili uyarma lazeri (405 nm, 488 nm, 561 nm ve 640 nm) ve PMT çifti ile uygun kanalı seçin. Gerçek zamanlı görüntü alımı için CANLI düğmesine basın.
8. Gerçek zamanlı floresan sinyaline dayalı olarak manuel bir düğme ile odak konumunu ayarlayın. Loş bir sinyali veya aşırı doygunluğu önlemek için mikroskop yazılımındaki lazer gücünü, piksel bekleme süresini ve PMT kazancını gerçek zamanlı floresan sinyaline göre optimize edin.
   NOT: Potansiyel antikor çapraz reaktivitelerini ortadan kaldırmak ve farklı floresan kanalları arasındaki karışmayı önlemek için farklı antikorların bildirilen yapılarına dayalı olarak görünümü ve özellikleri değerlendirin.
9. Bağıntılı SRS ve flüoresan görüntüleri almaya başlamak için LSM düğmesine basın. İlk olarak, immün etiketli numuneler üzerinde hacimsel floresan görüntüleri toplayın. Floresan görüntüleme bittiğinde, mikroskop ışık yolunu kızılötesi (IR) şeffaf duruma getirin.
10. Mikroskop yazılımında algılama kanalını floresan PMT'den SRS'ye değiştirin. SRS lazer için deklanşörü açın ve aynı z aralığına sahip aynı numunenin görüş alanında SRS hacimsel görüntüleme gerçekleştirin. Normal aralık 100-200 μm arasındadır ve 700 μm'ye kadar çıkabilir.
    NOT: Uyarma lazerlerindeki dalga boyu farkı nedeniyle floresan görüntüler ile SRS görüntüleri arasında z-konumunda bir kaymaya neden olan hafif renk sapması vardır. SRS ve floresan z-yığını görüntüleri arasında manuel yan yana karşılaştırma gereklidir. Z konumunu tam olarak eşleştirmek için hem SRS'den hem de floresan kanalından tam eşleşen özellikleri arayın.

7. U-Net mimarisinin oluşturulması, eğitimi ve doğrulanması

NOT: Linux'ta kurulum önerilir. >10 GB RAM'e sahip bir grafik kartı gereklidir.

1. Ortamın kurulması
   1. Anaconda veya Miniconda'yı bir 3-5.3.0-linux-x86_64 yükleyin. Aşağıdaki dosyaları klonlayın veya indirin: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Aşağıdaki komut satırını kullanarak platform için bir Conda ortamı oluşturun:
      conda env create -f environment.yml
2. Tahmin modelini eğitme
   1. Karşılık gelen SRS görüntülerinin dizinlerini bir csv dosyasındaki temel doğruluk görüntüleriyle eşleştirin. SRS görüntülerinin dizinlerini path_signal altına yerleştirin ve gerçek görüntüleri path_target sütunların altına yerleştirin.
   2. Csv dosyasını data/csvs klasörüne koyun. Gerekirse betiklerde/train_model_2d.sh yapılandırmada değiştirin. Komut satırını kullanarak ortamı etkinleştirin:
      Conda FNET'i Etkinleştir
   3. Komut satırını kullanarak model eğitimini başlatın:
      ./scripts/train_model_2d.sh 0
      Daha sonra eğitim başlayacaktır. Her yineleme için kayıplar komut satırında gösterilir ve modelle birlikte csv dosyası için save_models/ klasörüne kaydedilir.
3. Komut satırını kullanarak eğitim kümesindeki ve test kümesindeki görüntüleri doğrulayın:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Tahmin sonuçları, csv dosyasının results/ klasörüne kaydedilir.

8. Etiketsiz görüntülerde proteine özgü çoklayıcılık için U-Net tahminleriyle birleştirilmiş VISTA

1. csv dosyasını csv dosyasının data/csvs//test.csv içinde değiştirin. Hem path_signal hem de path_target dizinlerini yeni SRS görüntülerinin diziniyle değiştirin.
2. csv dosyasının results/ olan tahmin sonuçlarını eğitimden kaldırın. Komut satırını kullanarak tahminleri çalıştırın:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Tahmin sonuçları, csv dosyasının/test dosyasının results//test kaydedilir.

Sonuçlar

Görüntüleme ve analiz yönteminin çalışma prensibi oluşturulduktan sonra, numune işleme sırasında genleşme oranının değerlendirilmesi ve izotropik genleşmenin sağlanması için görüntü kaydı yapılmıştır (Şekil 1A,B). Hem işlenmemiş hem de VISTA numuneleri, endojen proteinlerin CH_3'ünden kaynaklanan 2940 ^cm-1'deki bağ titreşimi hedeflenirken görüntülendi. İşlem görmemiş örneklerde, çekirdekler gibi protein açısından zengin yapılar, çevre dokulardan gelen ez...

Tartışma

Özetle, hücre ve dokuların protein açısından zengin hücresel ve hücre altı yapılarını görüntülemek için etiketsiz bir modalite olan VISTA protokolünü sunuyoruz. Hidrojel gömülü hücre ve dokulardaki proteinlerden endojen CH_3'ü hedef alan yöntem, biyolojik numunelerde 78 nm'ye kadar etkili bir görüntüleme çözünürlüğü elde eder ve Aβ plaklarındaki Huntingtin agregatları ve fibrillerindeki küçük ekstrüzyonu çözer. Bu teknik, etiketsiz görüntüleme modaliteleri için 100 nm'nin altın...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
%16 Paraformaldehit	Elektron mikroskobu bilimi	15710	PBS'de %4'e seyreltilmiş
25x suya daldırma objektifi	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Fareler	Mutant Fare Kaynak ve Araştırma Merkezleri ve Jackson Laboratuvarı	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/mmjax	Alzheimer beyin
60x suya daldırma hedefi	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
Akrilamid	Sigma-Aldrich	A9099
amonyum persülfat	Sigma-Aldrich	A3678
anti-MAP2	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	8707
anti-NeuN	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	24307
borosilikat lamel # 1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL / 6J Fareler	Jackson Laboratuvarı (JAX)	664	Normal fareler
D2O	SRS kalibrasyonu için	Sigma-Aldrich	151882
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
cam sürgü 3 "x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
keçi anti-tavuk IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
keçi anti-fare IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
keçi anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
keçi anti-sıçan IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal silikon izolatörler	Sigma-Aldrich	GBL664108	mikroskobu ara parçası
Htt-97Q-GFP Plazmid	Prof. R. Kopito ve Prof. F.-U.Hartl'dan Hediye.
Lazer tarama mikroskobu	Olympus	FV3000	lazer taramalı konfokal mikroskop
lipofektamin 3000	Thermo Fisher	L3000001	transfeksiyon ajanı
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight > 594 (lektin)	Vektör Laboratuvarları	DL-1177-1
Mikroskop ara parçası	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-metilenbisakrilamid (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	suda% 2'lik çözelti olarak satın alındı
Nükleaz içermeyen su	Thermo Fisher	10977-015
Penisilin-Streptomisin	GIBCO	15140-122
karakterizasyonu için	poli-stren boncuklar	Sigma-Aldrich	43302
Sodyum Akrilat	Sigma-Aldrich	408220
sodyum dodesil sülfat	Sigma-Aldrich	71725
yumuşak yün boya fırçası #3	TANIS	000333
SRS Lazer	APE	picoEmerald	2ps darbe genişliği
tetrametiletilendiamin	Sigma-Aldrich	T9281
Doku kültürü şişesi 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Ara-20	Sigma-Aldrich	P9416
cımbız	Güzel Bilim Aracı	11295-51
Vibrotom	Leica		VT1200S vibratom