Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fosfoprotein Analizi için Fare Yüz İşlemleri ve Kültürlenmiş Palatal Mezenkim Hücrelerinden Tüm Hücre Protein Lisatlarının İzolasyonu

2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63834

⸱

1 Nisan 2022

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Protokol, disseke edilmiş fare embriyo yüz süreçlerinden veya kültürlenmiş fare embriyonik palatal mezenkim hücrelerinden tüm hücre protein lizatlarını izole etmek ve fosforile protein seviyelerini değerlendirmek için müteakip batı lekelemesini gerçekleştirmek için bir yöntem sunar.

Özet

Memeli kraniyofasiyal gelişimi, çoklu hücre popülasyonlarının frontonazal iskeleti oluşturmak için koordine olduğu karmaşık bir morfolojik süreçtir. Bu morfolojik değişiklikler, genellikle kinazlar tarafından protein fosforilasyonunu içeren çeşitli sinyal etkileşimleri yoluyla başlatılır ve sürdürülür. Burada, memeli kraniyofasiyal gelişimi sırasında proteinlerin fosforilasyonunu incelemek için fizyolojik olarak ilgili bağlamların iki örneği verilmiştir: fare yüz süreçleri, özellikle E11.5 maksiller süreçler ve E13.5 ikincil damak raflarından türetilen kültürlenmiş fare embriyonik damak mezenkimi hücreleri. Protein izolasyonu sırasında ortak defosforilasyon bariyerini aşmak için, fosfoproteinlerin izolasyonuna izin veren standart laboratuvar yöntemlerine adaptasyonlar ve modifikasyonlar tartışılmaktadır. Ek olarak, tüm hücre protein lizatlarının batı lekelenmesini takiben fosfoproteinlerin uygun analizi ve nicelleştirilmesi için en iyi uygulamalar sağlanmaktadır. Bu teknikler, özellikle farmakolojik inhibitörler ve / veya murin genetik modelleri ile kombinasyon halinde, kraniyofasiyal gelişim sırasında aktif olan çeşitli fosfoproteinlerin dinamikleri ve rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir.

Giriş

Memeli kraniyofasiyal gelişimi, çoklu hücre popülasyonlarının frontonazal iskeleti oluşturmak için koordine olduğu karmaşık bir morfolojik süreçtir. Farede, bu süreç embriyonik günde (E) 9.5'te, frontonazal belirginliğin oluşumu ve her biri göç sonrası kraniyal nöral krest hücreleri içeren maksiller ve mandibuler süreçlerin çiftleri ile başlar. Lateral ve medial burun süreçleri, burun çukurlarının görünümü ile frontonazal belirginlikten kaynaklanır ve sonunda burun deliklerini oluşturmak için kaynaşır. Ayrıca, medial burun süreçleri ve maksiller süreçler üst dudağı oluşturmak için kaynaşır. Aynı zamanda, palatogenez, E11.5'teki maksiller süreçlerin oral tarafından farklı çıkıntıların - ikincil damak raflarının - oluşumu ile başlatılır. Zamanla, damak rafları dilin her iki tarafında aşağı doğru büyür, dilin üzerinde zıt bir konuma yükselir ve sonunda burun ve ağız boşluklarını E16.51 ile ayıran sürekli bir damak oluşturmak için orta hatta kaynaşır.

Kraniofasiyal gelişim boyunca bu morfolojik değişiklikler, genellikle kinazlar tarafından protein fosforilasyonunu içeren çeşitli sinyal etkileşimleri yoluyla başlatılır ve sürdürülür. Örneğin, kemik morfogenetik protein reseptörleri (BMPR'ler) ve çeşitli reseptör tirozin kinaz (RTK) aileleri de dahil olmak üzere dönüştürücü büyüme faktörü (TGF)-β reseptörlerinin alt aileleri gibi hücre zarı reseptörleri, kranial nöral krest hücrelerinde ligand bağlanması ve aktivasyonu üzerine otofosforile edilir 2,3,4 . Ek olarak, G proteinine bağlı transmembran reseptörü Smoothized, kraniyal nöral krest hücrelerinde fosforile olur ve Patched1 reseptörüne bağlanan Sonik kirpi (SHH) ligandının aşağı yönünde kraniyofasiyal ektoderm haline gelir ve siliyer membranda Düzgünleştirilmiş birikim ve SHH yolu aktivasyonu5 ile sonuçlanır. Bu tür ligand-reseptör etkileşimleri, kraniyofasiyal bağlamlarda otokrin, parakrin ve / veya jukstacrin sinyalizasyonu yoluyla ortaya çıkabilir. Örneğin, BMP6'nın kondrosit farklılaşması6 sırasında otokrin bir şekilde sinyal verdiği bilinirken, fibroblast büyüme faktörü (FGF) 8, faringeal ark ektoderminde ifade edilir ve faringeal ark mezenkiminde eksprese edilen FGF RTK ailesinin üyelerine parakrin bir şekilde bağlanır7, 8,9,10. Ayrıca, Kraniofasiyal iskelet gelişimi sırasında hem kondrositlerde hem de osteoblastlarda, transmembran Delta ve / veya Pürüzlü ligandlar komşu hücrelerdeki transmembran Çentik reseptörlerine bağlandığında, daha sonra parçalanan ve fosforile edilen yan yana takrin sinyallemesi yoluyla aktive edilir11. Bununla birlikte, hem otokrin hem de parakrin sinyallemede işlev görme esnekliğine sahip kraniyofasiyal gelişim için önemli olan başka ligand ve reseptör çiftleri de vardır. Örnek olarak, murin diş morfogenezi sırasında, trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF)-AA ligandının, emaye organ epiteli12'deki RTK PDGFRa'yı aktive etmek için otokrin bir şekilde sinyal verdiği gösterilmiştir. Buna karşılık, gebeliğin ortasındaki murin fasiyal süreçlerinde, PDGF-AA ve PDGF-CC ligandlarını kodlayan transkriptler kraniyofasiyal ektodermde eksprese edilirken, PDGFRα reseptörü altta yatan kranial nöral krest kaynaklı mezenkimde eksprese edilir ve parakrin sinyalizasyonu13,14,15,16,17 ile sonuçlanır. . Sinyal mekanizmasından bağımsız olarak, bu reseptör fosforilasyon olayları genellikle mitojenle aktive edilmiş protein kinaz (MAPK) yolu18,19 gibi hücre içi kinaz kaskadlarını başlatmak için sıklıkla fosforile haline gelen adaptör proteinlerinin ve / veya sinyal moleküllerinin işe alınmasıyla sonuçlanır.

Bu kaskadların terminal hücre içi efektörleri daha sonra transkripsiyon faktörleri, RNA bağlanması, hücre iskeleti ve hücre dışı matriks proteinleri gibi bir dizi substratı fosforile edebilir. Runx220, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24,Gli1-3 25 ve Sox9 26, kraniyofasiyal gelişim bağlamında fosforile edilen transkripsiyon faktörleri arasındadır. Bu translasyonel sonrası modifikasyon (PTM), diğer aktivitelerin yanı sıra alternatif PTM'lere duyarlılığı, dimerizasyonu, stabiliteyi, bölünmeyi ve / veya DNA bağlayıcı afiniteyi doğrudan etkileyebilir20,21,25,26. Ek olarak, RNA bağlayıcı protein Srsf3, kraniyofasiyal gelişim bağlamında fosforile edilir ve nükleer translokasyonuna yol açar27. Genel olarak, RNA bağlayıcı proteinlerin fosforilasyonunun, hücre altı lokalizasyonlarını, protein-protein etkileşimlerini, RNA bağlanmasını ve / veya dizi özgüllüğünü etkilediği gösterilmiştir28. Ayrıca, aktomiyozinin fosforilasyonu, kraniyofasiyal gelişim boyunca sitoiskelet yeniden düzenlemelerine yol açabilir29,30 ve küçük integrin bağlayıcı ligand N'ye bağlı glikoproteinler gibi hücre dışı matriks proteinlerinin fosforilasyonu, iskelet gelişimi sırasında biyomineralizasyona katkıda bulunur 31. Yukarıdaki ve diğer birçok örnekle, kraniyofasiyal gelişim sırasında protein fosforilasyonu için geniş etkileri olduğu açıktır. Ek bir düzenleme seviyesi ekleyerek, protein fosforilasyonu, fosfat gruplarını çıkararak kinazlara karşı koyan fosfatazlar tarafından daha da modüle edilir.

Hem reseptör hem de efektör molekül seviyelerindeki bu fosforilasyon olayları, sinyal yolaklarının yayılması için kritik öneme sahiptir ve sonuçta çekirdekteki gen ekspresyonunda değişikliklere neden olarak, göç, proliferasyon, hayatta kalma ve farklılaşma gibi spesifik hücre aktivitelerini yönlendirerek memeli yüzünün düzgün oluşumuna neden olur. Kinazlar ve fosfatazlarla protein etkileşimlerinin bağlam özgüllüğü, PTM'lerde ortaya çıkan değişiklikler ve bunların hücre aktivitesi üzerindeki etkileri göz önüne alındığında, fosforilasyon olaylarının kraniyofasiyal gelişime katkısının tam olarak anlaşılması için bu parametrelerin fizyolojik olarak ilgili bir ortamda incelenmesi kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin fosforilasyonunu ve dolayısıyla memeli kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyal yolaklarının aktivasyonunu incelemek için iki bağlam örneği verilmiştir: fare yüz süreçleri, özellikle E11.5 maksiller süreçler ve E13.5 ikincil damak raflarından türetilen kültürlenmiş fare embriyonik damak mezenkimi hücreleri - hem birincil32 hem de ölümsüzleştirilmiş33 . E11.5'te, maksiller süreçler lateral ve medial nazal süreçler1 ile kaynaşma sürecindedir, böylece fare kraniyofasiyal gelişimi sırasında kritik bir zaman noktasını temsil eder. Ayrıca, maksiller süreçler ve damak raflarından türetilen hücreler burada seçilmiştir, çünkü ikinci yapılar birincisinin türevleridir, böylece araştırmacılara protein fosforilasyonunu in vivo ve in vitro olarak ilgili bağlamlarda sorgulama fırsatı sunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol alternatif yüz süreçleri ve gelişimsel zaman noktaları için de geçerlidir.

Fosforile proteinlerin incelenmesinde kritik bir sorun, protein izolasyonu sırasında bol miktarda çevresel fosfatazlar tarafından kolayca fosforilden arındırılmalarıdır. Bu engelin üstesinden gelmek için, fosforile proteinlerin izolasyonuna izin veren standart laboratuvar yöntemlerine adaptasyonlar ve modifikasyonlar tartışılmaktadır. Ek olarak, fosforile proteinlerin uygun analizi ve nicelleştirilmesi için en iyi uygulamalar sağlanmaktadır. Bu teknikler, özellikle farmakolojik inhibitörler ve / veya murin genetik modelleri ile kombinasyon halinde, kraniyofasiyal gelişim sırasında aktif olan çeşitli sinyal yolaklarının dinamikleri ve rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanları içeren tüm prosedürler, Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve kurumsal kılavuzlara ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Embriyo hasadı için 1.5-6 aylıkken ve 21-23 ° C'lik bir termonötr sıcaklıkta barındırılan dişi 129S4 fareler kullanıldı. Protokolün şematik iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar, yazılımlar, reaktifler ve hayvanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. E11.5 fare embriyolarının toplanması

  1. Hamile kadın fareyi, yaklaşık% 50 yer değiştirme (3 odada360'ta 2.95 L / dak) ve maruz kalma süresi için gerekli olan IACUC onaylı CO 2 akış hızı kullanılarak bir CO2 odasında zamanlanmış çiftleşme sırasında vajinal tıkaç tespitinden 11.5 gün sonra ötenazi yapın. İkincil bir ötenazi yöntemi olarak servikal çıkık gerçekleştirin. Hemen diseksiyona devam edin.
  2. Fare gövdesini, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon tahtasına yerleştirin. Fare karnına% 70 etanol püskürtün.
  3. Düz Semken forseps ile cildi vajinal açıklığa kadar sıkıştırıp kaldırarak karın boşluğunu açın ve kaldırılan cildi ve altta yatan katmanları düz bıçak cerrahi makasla her iki tarafta 45 ° açıyla keserek, ön ayaklar ve arka bacaklar arasında kabaca yarı yolda her bir yanal yüzeye uzanan bir "V" şekli oluşturun.
  4. Semken forsepslerini kullanarak, uterus boynuzlarından birini tutun ve cerrahi makasla yumurta kanalının altına ve serviksin üstüne kesin. Rahim boynuzunun tamamen çıkarılmasına izin vermek için mezometriyumu kesin.
  5. Disseke uterus boynuzunu 10 cm'lik bir Petri kabında 10 mL histoloji fosfat tamponlu saline (PBS) [0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH 2 PO 4 monobazik, 10.14 mM Na2HPO 4 dibasic, pH7.4] aktarın.
  6. Karın boşluğunun karşı tarafındaki ikinci uterus boynuzunu 1.4-1.5. adımlarda açıklanan aynı prosedürü kullanarak çıkarın.
  7. Her iki uterus boynuzunu içeren 10 cm'lik Petri kabını, bireysel embriyoların diseksiyonuna hemen ilerlemiyorsa (yani, ikinci bir dişi fare diseke edilecekse) buz üzerine yerleştirin.
  8. Diseksiyon stereo mikroskop altında, her embriyoyu uterus boynuzlarından Dumont # 5 ince forseps ile dikkatlice diseke edin. Miyometriyumu, deciduayı ve koryonu yavaşça çekin. Embriyoyu çevreleyen nispeten şeffaf amniyonun yırtılıp çıkarılması ve embriyonun plasentaya bağlanması göbek kordonunun kesilmesi.
  9. Her disseke edilmiş embriyoyu, kesilmiş bir plastik transfer pipeti veya bir embriyo kaşığı kullanarak buz üzerinde 12 delikli bir hücre kültürü plakasının ayrı bir kuyucuğunda 2.5 mL histoloji PBS'ye aktarın.
    NOT: Birden fazla genotipte embriyo içerebilen bir çöple çalışıyorsanız, her embriyoyu çevreleyen amniyonu, her birini buz üzerinde önceden etiketlenmiş 0,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirerek genotipleme için saklayın.

2. E11.5 fare embriyolarından maksiller süreçlerin diseksiyonu

  1. 10 mL histoloji PBS içeren üç adet 10 cm'lik Petri kabı hazırlayın ve embriyolar arasında rotasyonda kullanılmak üzere buz üzerinde tutun.
  2. Bir embriyoyu, 12 kuyucuklu hücre kültürü plakasının bireysel bir kuyucuğundan, kesilmiş bir plastik transfer pipeti veya bir embriyo kaşığı kullanarak buz üzerinde histoloji PBS'li 10 cm'lik Petri kaplarından birine aktarın.
  3. Diseksiyon mikroskobu altında, ince forsepsleri kullanarak her maksiller işlemi yüzden ayırın. İlk olarak, lateral burun sürecini ve maksiller süreci ayıran doğal girinti boyunca bir maksiller işlemin ön tarafını kesin (Şekil 2A).
  4. İkincisi, maksiller sürecin arka tarafını, maksiller süreci ve mandibuler süreci ayıran doğal girinti boyunca kesin (Şekil 2A).
  5. Üçüncüsü, maksiller süreci tamamen ayırmak için, maksiller sürecin göz tarafında, maksiller sürecin ön tarafından arka taraflarına, yukarıda belirtilen doğal girintilerin sona erdiği dikey bir kesim yapın (Şekil 2A-C).
  6. Yüzün karşı tarafındaki maksiller işlem için bu üç kesimi tekrarlayın.
  7. 2 mL küçük lateks ampul ile 9" Pasteur pipet kullanarak, disseke edilmiş maksiller işlem çiftini ve yaklaşık 30 μL histoloji PBS'den oluşan küçük bir damlacığı buz üzerinde etiketli 35 mm Petri kabına aktarın (Şekil 2D).
  8. Her embriyo için 2.3-2.7 adımlarını izleyin, embriyolar arasında buz üzerinde histoloji PBS içeren üç adet 10 cm'lik Petri kabını döndürün. Disseke edilmiş maksiller işlemlerin bireysel çiftlerini buz üzerine ayrı 35 mm Petri kaplarına yerleştirin.
    NOT: Maksiller proses ektodermi ve mezenkimin ayrılması (adım 2.9-2.17), çöpteki tüm embriyoların maksiller süreçlerinin diseksiyonundan sonra gerçekleştirilebilir. Hem ektoderm hem de mezenkimi içeren sağlam maksiller işlemler isteniyorsa, aşağıdaki adım 2.18'e geçin.
  9. Doku kültürü PBS'de 250 μL taze% 2 tripsin ve doku kültürü PBS'de 250 μL% 10 fetal sığır serumu (FBS) hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
  10. 35 mm Petri kabına, maksiller süreçleri içeren ilk, küçük histoloji PBS damlacığından ayrı olarak, yaklaşık 30 μL% 2 tripsin ikinci, küçük bir damlacık yerleştirin. Maksiller işlem çiftini, Pasteur pipet kullanarak %2'lik tripsin küçük damlacığına aktarın (Şekil 2D).
  11. Yemeği 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  12. 35 mm Petri kabını buzdan çıkarın ve diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
  13. İnce forsepsleri kullanarak, her maksiller işlemden ektoderm tabakasını yavaşça ve dikkatlice çıkarın (Şekil 2E).
    NOT: Ektoderm sağlam bir tabakada mezenkimden ayrılmıyorsa, ayırmaya devam etmeden önce oda sıcaklığında (RT) %2 tripsin içinde 5 dakikaya kadar inkübe edin. Doku% 2 tripsinde parçalanmaya başlarsa, tripsini nötralize etmek ve ektoderm ve mezenkimin ayrılmasını bitirmek için maksiller süreçleri aşağıda açıklandığı gibi% 10 FBS'ye taşıyın.
  14. Maksiller proses ektodermi ve mezenkim ayrıldıktan sonra (Şekil 2F), istenen dokuları maksiller işlem çiftinden Pasteur pipet kullanarak yaklaşık 30 μL% 10 FBS'lik üçüncü, küçük bir damlacığa aktarın (Şekil 2D).
  15. Tripsinizasyonu durdurmak için 35 mm'lik Petri kabını buzun üzerine yerleştirin.
  16. Maksiller proses dokularını buz üzerinde% 10 FBS'de 1-2 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra dokuları her iki maksiller işlemden Pasteur pipet kullanarak buz üzerinde yaklaşık 30 μL önceden soğutulmuş histoloji PBS'nin dördüncü, küçük bir damlacığına aktarın (Şekil 2D).
  17. Histoloji PBS'deki maksiller proses dokularını 1 dakika boyunca inkübe ederken, tüm FBS'nin dokudan durulanmasını sağlamak için histoloji PBS'yi maksiller proses dokularının etrafında Pasteur pipetinin ucuyla hafifçe döndürün.
  18. Maksiller proses dokularının çiftini, Pasteur pipet kullanarak buz üzerinde etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve histoloji PBS'nin transferini en aza indirin. 1,5 mL mikrosantrifüj tüpündeki fazla histoloji PBS'sini Pasteur pipet ile çıkarın.
  19. Maksiller süreçleri çöpteki her embriyodan ayırmak için yukarıdaki adımları izleyin.
  20. Tüm hücre protein lizatlarını izole etmek için numuneleri hemen işleyin (aşağıda) veya -80 ° C'de uzun süreli saklayın. Uzun süreli depolamadan önce, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünü kuru buz üzerinde% 100 EtOH'luk bir banyoda 5 dakika boyunca anında dondurun.

3. Tüm hücre proteini lizatlarının fare maksiller süreçlerinden izole edilmesi

  1. Maksiller işlemler daha önce -80 ° C'de dondurulmuşsa, bunları buz üzerinde çözün.
  2. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri (1x tam mini proteaz inhibitörü kokteyli [suda çözülmüş; -20 °C'de depolanmış], 1 mM PMSF [suda çözülmüş; -20 °C'de depolanmış], 1 mM PMSF [izopropanolde çözülmüş; 4 °C'de depolanmış], 0,1 mL buz gibi soğuk NP-40 lizis tamponu (20 mM NaCl, %10 gliserol, %1 Nonidet P-40, 2 mM EDTA; 4 °C'de depolanmış) ekleyin, 10 mM NaF [-20 °C'de depolanır; donma/çözülmeden kaçının], 1 mM Na3VO 4 [-20 °C'de depolanır], 25 mM β-gliserofosfat [4 °C'de depolanır]) buz üzerinde kullanılmadan hemen önce eklenir.
    NOT: Hücre fraksiyonasyonu alternatif olarak sitoplazmik, nükleer, membran veya mitokondriyal protein fraksiyonlarını izole etmek için yapılabilir.
  3. Pipet, 200 μL pipetman ile 10 kez yukarı ve aşağı indir.
  4. 10 sn boyunca vorteks yapın ve ardından 200 μL pipetman ile 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Kabarcık oluşturmaktan kaçının.
  5. Bir tüp tabanca ile 1,5 mL/2 mL kürek kullanarak uçtan uca dönerken 2 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  6. Numuneleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 13.500 × g'de santrifüj yapın.
  7. Süpernatantı 200 mL'lik bir pipetman ile buz üzerinde yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplayın.
  8. Deneysel numuneler için 10 μL protein lizat + 10 μL NP-40 lizis tamponu ve protein standartları olarak 0.25-2.0 mg / mL aralığında NP-40 lizis tamponunda 3-5 seyreltilmiş sığır serum albümini (fraksiyon V) (BSA) kullanarak protein konsantrasyonunu protein tahlil kiti ile ölçün.
  9. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) (adım 5) ile devam edin veya kalan lizatları kuru buz üzerinde hızlı bir şekilde dondurun ve -80 ° C'de uzun süre saklayın.

4. Tüm hücre proteini lizatlarının birincil ve / veya ölümsüzleştirilmiş fare embriyonik palatal mezenkimi (MEPM) hücrelerinden izole edilmesi

NOT: E13.5 fare embriyolarından ve ölümsüzleştirilmiş MEPM hücrelerinden primer MEPM hücrelerinin izolasyonu ve kültürü daha önce32,33,34 olarak tanımlanmıştır. Hücrelerin büyüme faktörü ile uyarılması (adım 4.1-4.7) hücre lizisinden önce yapılabilir. Uyarılmamış hücreler isteniyorsa, aşağıdaki adım 4.8'e geçin.

  1. Bir vakum sistemine bağlı 5.75" Pasteur pipet kullanarak, büyüme ortamını [Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) 50 U / mL penisilin, 50 μg / mL streptomisin, 2 mM L-glutamin,% 10 FBS] ile MEPM hücrelerinden ~% 70 birleşimde aspire edin.
  2. Hücreleri 1 mL doku kültürü PBS ile yıkayın.
  3. 37 °C su banyosunda önceden ısıtılmış 3 mL serum açlık ortamı [50 U / mL penisilin, 50 μg / mL streptomisin, 2 mM L-glutamin,% 0.1 FBS içeren DMEM] ekleyin.
  4. 37 °C'de ve 23 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
  5. Serum açlık ortamını 3 mL taze, önceden ısıtılmış serum açlık ortamı ile değiştirin.
  6. 37 °C'de ve 1 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
  7. Hücreleri, istenen süre boyunca ampirik olarak belirlenmiş bir konsantrasyonda tercih edilen büyüme faktörü ile uyarın.
  8. Bir vakum sistemine bağlı 5,75" Pasteur pipet kullanarak ortamı MEPM hücrelerinden %80-%100 birleşimde aspire edin.
  9. Hücreleri buz gibi soğuk doku kültürü PBS (6 cm'lik bir hücre kültürü kabı için 1 mL) ile iki kez yıkayın; Tüm doku kültürü PBS'nin aspire edildiğinden emin olmak için son yıkama sırasında plakayı yana doğru eğin.
  10. Buz üzerinde kullanımdan hemen önce eklenen proteaz ve fosfataz inhibitörleri (6 cm'lik bir hücre kültürü kabı için 0.1 mL) ile buz gibi soğuk NP-40 lizis tamponu ekleyerek hücreleri lize edin.
  11. Plakanın tam olarak kaplanmasını sağlamak için plakayı yaklaşık her dakika dönerek 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  12. Önceden soğutulmuş bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri plakadan kazıyın ve hücre süspansiyonunu buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  13. Tüp tabancalı 1,5 mL/2 mL'lik bir kürek kullanarak uçtan uca dönerken, hücre süspansiyonunu 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  14. Yukarıda açıklanan 3.6-3.9 arası adımlarla devam edin.

5. Fosfoproteinler için fare yüz işlemlerinden ve / veya MEPM hücrelerinden tüm hücre proteini lizatlarının batı lekelenmesi

  1. SDS-PAGE için tüm hücre proteini lizat örnekleri hazırlayın.
    1. Dokudaki/hücredeki protein bolluğuna bağlı olarak yüklenecek protein miktarını belirlemek; 12.5 μg, tüm hücre protein lizatlarındaki sağlam eksprese proteinler için genellikle yeterlidir.
    2. Kullanımdan hemen önce eklenen% 10 β-merkaptoetanol eklenmiş eşit hacimli 2x Laemmli tamponu [% 20 gliserol,% 4 SDS,% 0.004 bromofenol mavisi, 0.125 M Tris HCl pH 6.8] ekleyin.
      DİKKAT: β-merkaptoetanol cilt veya göz aşındırıcıdır, toksiktir, yutulduğunda tehlikelidir ve suda toksik toksisiteye sahiptir. Eldiven, laboratuvar önlüğü, yüz siperliği ve kimyasal duman başlığında güvenlik gözlükleri giyin. Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine göre bertaraf edin.
    3. Vorteks yaparak karıştırın.
    4. Numuneleri mini kuru banyoda 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
    5. Vorteksleme ile karıştırın ve örnekleri buzun üzerine yerleştirin.
    6. 4 °C'de 5 dakika boyunca 9.400 × g'da santrifüj.
    7. SDS-PAGE jeline yüklemeden önce numuneleri kısa bir süre buz üzerine yerleştirin veya -20 °C'de uzun süre saklayın.
  2. SDS-PAGE'i% 4 -% 15 prekast protein jeli ve elektroforez tamponu 35 içeren bir elektroforez hücresi kullanarakgerçekleştirin.
  3. Kullanımdan hemen önce eklenen %0-20 metanol (100 kDa'dan büyük proteinler için %0-%10; 100 kDa'dan küçük proteinler için %20) içeren transfer tamponu kullanarak proteinleri bir poliviniliden florür (PVDF) membranına elektrotransferedin 35.
  4. Membranı bloke edin ve ilgilenilen fosfoprotein için prob.
    1. Aktarımı takiben, membranı batı leke kutusunda 5 dakika boyunca 1x tris tamponlu salin (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] içinde yıkayın.
    2. Membranı 5 mL bloke tamponunda [1x TBS,% 0.1 Ara 20,% 5 w / v BSA; iyice karıştırılır ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda 1 saat boyunca luer uçlu 10 mL'lik bir şırınga kullanılarak 0,2 μm gözenekli 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzülür].
      NOT: Fosfoproteinleri karakterize ederken sütü bloke edici bir ajan olarak kullanmayın, çünkü fosfoprotein kazein içerir, bu da yüksek, spesifik olmayan bir arka plan sinyaline neden olabilir.
    3. Membranı TBS-T [1x TBS, %0,1 Tween 20] içinde her biri 5 dakika boyunca üç kez, yörüngesel çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda yıkayın.
    4. Membranı, tüp tabancalı 50 mL'lik bir kürek kullanarak 50 mL'lik bir konik tüp içinde gece boyunca 4 ° C'de bloke edici tamponda seyreltilmiş 5 mL birincil antikor içinde inkübe edin.
      NOT: Batı lekelenmesi için uygun konsantrasyon için antikor veri sayfasına bakın.
    5. Membranı RT'de her biri 5 dakika boyunca üç kez, bir orbital çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda TBS-T'de yıkayın.
    6. Membranı, orbital çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda 1 saat boyunca bloke edici tamponda seyreltilmiş 5 mL'lik uygun yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonjuge sekonder antikoru içinde inkübe edin.
    7. Membranı, TBS-T'de her biri 5 dakika boyunca üç kez, yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda yıkayın.
    8. Membranı 1 dakika boyunca gelişmiş kemilüminesans (ECL) batı lekeleme substratında [1 ve 2 numaralı şişelerden eşit hacimlerde karıştırma; büyük (8,6 cm x 6,7 cm) membranlar için her birinin 0,5 mL'si] içinde inkübe ederek tüm membranın sürekli olarak ECL batı lekeleme substratına maruz kalmasını sağlayın.
    9. Fazla ECL batı lekeleme substratının zarını boşaltın ve hemen bir kemilüminesans görüntüleyici kullanarak geliştirin.
  5. Zarı sıyırın ve ilgilenilen toplam protein için problayın.
    1. PVDF membranını, kullanımdan hemen önce 8 μL/mL β-merkaptoetanol eklenmiş 5 mL sıyırma tamponu [% 2 SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] içeren polietilen astarlı şeffaf bir torbaya yerleştirin.
    2. Dakikada 11 devirde hibridizasyon fırınında sallanarak 30 dakika boyunca 50 °C'de inkübe edin.
    3. Membranı RT'de her biri 5 dakika boyunca üç kez, bir orbital çalkalayıcı üzerinde ajitasyonlu bir batı leke kutusunda TBS-T'de yıkayın.
    4. Yukarıda açıklanan 5.4.2-5.4.9 adımlarıyla devam edin.
  6. ImageJ yazılımını kullanarak batı leke bandı yoğunluklarını sayısallaştırın, ilgilenilen fosforile proteinin seviyelerini ilgilenilen toplam proteinin seviyelerine normalleştirin36.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fare yüz süreçlerinden ve / veya kültürlenmiş damak mezenkim hücrelerinden izole edilen proteinlerin fosforilasyonunu karakterize etmeye çalışırken, temsili sonuçlar ideal olarak, karşılık gelen toplam protein bandının yüksekliğinde veya yakınında çalışan bir anti-fosfoprotein antikoru ile batı lekelenmesini takiben farklı, tekrarlanabilir bir bant ortaya çıkaracaktır (Şekil 3 ). Bununla birlikte, proteinin geniş fosforilasyonu meydana gelirse, fosfoprotein bandının toplam protein bandına kı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, araştırmacıların kraniyofasiyal gelişim sırasında kritik fosforilasyona bağımlı sinyal olaylarını sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde araştırmalarını sağlar. Bu protokolde, verilerin uygun şekilde toplanmasını ve sonuçların analizini sağlayan birkaç kritik adım vardır. Fosfoproteinleri fare yüz süreçlerinden ve / veya kültürlenmiş damak mezenkim hücrelerinden izole etmek olsun, tüm reaktifleri ve malzemeleri belirtildiğinde buz üzerinde tutarken hızlı ve verimli bir şekilde hareket etmek zoru...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

129S4 fareleri, Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'nden Dr. Philippe Soriano'nun bir hediyesiydi. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) / Ulusal Diş ve Kraniofasiyal Araştırma Enstitüsü (NIDCR) R01 DE027689 ve K02 DE028572'den K.A.F.'ye, F31 DE029976'dan M.A.R.'ye ve F31 DE029364'ten B.J.C.D.'ye sağlanan fonlarla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Ekipman< / mini
blokAraştırma Ürünleri International Corp400783
ChemiDoc XRS+ görüntüleme sistemi Image Lab yazılımı ileBio-Rad1708265kemilüminesans görüntüleyici
CO2< / sub> inkübatör, hava ceketiVWR10810-902
Diseksiyon tahta, 11 x 13 inçFisher Scientific09 002 12
Elektroforez hücresi, 4 jelli, mini trans-blot modüllü mini prekast jeller içinBio-Rad1658030
Hibridizasyon fırınıFisher ScientificUVP95003001
F45-24-11 rotorlu mikrosantrifüj 5415 D (Eppendorf)Sigma AldrichZ604062
Mini kuru banyoAraştırma Ürünleri International Corp400780
Orbital çalkalayıcıVWR89032-092
pH metreVWR89231-662
SDS-PAGEBio-Rad1645050
Dikdörtgen buz tavası, maxi 9 LFisher Scientific07-210-093
Stemi 508 stereo mikroskop standlı K LAB, LED halka ışıkZeiss4350649020000000diseksiyon mikroskobu
ZamanlayıcıVWR62344-641
Tüp tabancaFisher Scientific11 676 341
Vorteks karıştırıcıFisher Scientific02 215 414
Su banyosuVWR89501-472
Batı leke kutusuFisher ScientificNC9358182
Malzemeler
Hücre kültürü kapları, 6 cmFisher Scientific12-565-95
Hücre kültürü plakaları, 12 kuyuluFisher Scientific07-200-82
Hücre kaldırıcılarFisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
Konik borular, polipropilen, 50 mLFisher Scientific05-539-13
Dumont #5 ince forsepsGüzel Bilim Araçları11254-20
Embriyo kaşığıGüzel Bilim Araçları10370-17
Mikrosantrifüj tüpleri, 0.5 mLVWR89000-010
Mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 mLVWR20170-038
Pasteur pipeti, 5.75"Fisher Scientific13-678-6A
Pasteur pipeti, 9"VWR14672-380
Petri kapları, 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Petri kapları, 35 mmFisher ScientificFB0875711YZ
Torbalar, şeffaf, polietilen astarFisher Scientific01-812-25B
PVDF membranFisher BilimselIPVH00010
Semken forsepsGüzel Bilim Araçları11008-13
Küçük lateks ampul, 2 mLVWR82024-554
Cerrahi makasGüzel Bilim Araçları14002-12
Şırınga filtresi, 25 mm, 0.2 & mu; m gözenek boyutuFisher Scientific09-740-108
Luer uçlu şırınga, 10 mLVWRBD309604
Transfer pipetiFisher Scientific13-711-22
Western blot kaset açma koluBio-Rad4560000
Whatmann 3MM chr kromatografi kağıdıFisher Scientific05-714-5
Reaktifler
4-15% Prekast protein jelleri, 10 oyuklu, 30 ve mikro; LBio-Rad4561083
ve beta; - gliserofosfat disodyum tuzu hidratSigma AldrichG5422-25Gstok konsantrasyonu 1 M
ve beta; -merkaptoetanolSigma AldrichM3148-100ML
Sığır serum albümini, fraksiyon V, ısı şoku test edildiFisher ScientificBP1600-100
Bromofenol mavisiFisher Scientific
Komple mini proteaz inhibitörü kokteyliSigma Aldrich11836153001stok konsantrasyonu 25x
DC protein test kiti IIBio-Rad500-0112
DMEM, yüksek glikozGibco11965092
E7, fare monoklonal beta tübülin birincil antikoru, konsantre 0.1 mLGelişimsel Çalışmalar Hibridoma BankasıE71: 1.000
ECL batı kurutma substratıFisher ScientificPI32106düşük pikogram aralığı
ECL batı kurutma substratıGenesee Scientific20-302Bdüşük femtogram aralığı
Elektroforez tamponu, 5 LBio-Rad1610772stok konsantrasyonu 10x
Etanol, 200 kanıt, 1 galonDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
Etilendiamintetraasetik asit, Di Na tuzu dihidr. (Kristal güç/elektrofor.)Fisher ScientificBP120-500EDTA
Fetal sığır serumu, karakterize, ABD menşeli, 500 mLHyCloneSH30071.03
Gliserol (sertifikalı ACS)Fisher ScientificG33-4
HRP konjuge ikincil antikor, keçi anti-fare IgGJackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları115-035-1461:20.000
HRP konjuge ikincil antikor, keçi tavşan önleyici IgGJackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları111-035-0031:20.000
Hidroklorik asit çözeltisi, 6N (sertifikalı)Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 iyonik olmayan deterjanFisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
İzopropanol (HPLC)Fisher ScientificA451-1
L-glutaminGibco25030081stok konsantrasyonu 200 mM
MetanolFisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) birincil antikorHücre Sinyalizasyon Teknolojisi9102S1:1.000; anti-Erk1/2
PDGF-BB rekombinant ligand, sıçanFisher Scientific520BB050
PDGF Reseptörü ve beta; birincil antikorHücre Sinyalizasyon Teknolojisi3169S1:1.000
&Penisilin-StreptomisinGibco15140122; g/mL
Fenilmetansülfonil florür, %99Fisher ScientificAC215740100PMSF; stok konsantrasyonu 100 mM
Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) primer antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi9101S1:1.000, anti-fosfo-Erk1/2
Fosfo-PDGF Reseptörü ve alfa; /PDGF Reseptörü ve beta; birincil antikorHücre Sinyal Teknolojisi3170S1:1.000
Potasyum klorür (beyaz kristaller)Fisher ScientificBP366-500KCl
Potasyum fosfat monobazik (beyaz kristaller)Fisher ScientificBP362-500KH2PO4
SDS çözeltisi, %10Bio-Rad161-0416
Sodyum klorür (kristal/biyolojik,sertifikalı)Fisher ScientificS671-3NaCl
Sodyum florür (toz/sertifikalı ACS)Fisher ScientificS299-100NaF; bir kerelik kullanım için alikot; stok konsantrasyonu 1 M
Sodyum ortovanadat, %99Fisher ScientificAC205330500 Na3VO4; stok konsantrasyonu 100 mM
Sodyum fosfat dibazik susuz (granül veya toz/sertifikalı ACS)Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
Doku kültürü PBSFisher Scientific21-031-CV
Transfer tamponu, 5 LBio-Rad1610771stok konsantrasyonu 10x
Tris bazı (beyaz kristaller veya kristal toz/moleküler biyoloji)Fisher ScientificBP152-1
TripsinBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Western blot moleküler ağırlık işaretleyiciBio-Rad1610374
Software
ImageJ yazılımıUlusal Sağlık Enstitüleri
Animals
Dişi 129S4 farelerSina Dağı'ndaki Icahn Tıp Okulu'ndan Dr. Philippe Soriano'nun hediyesi
kuru banyo için güçlü > için güç kaynağıAC403140050Stok konsantrasyonu 100 U/mL, 100

Kaynaklar

  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).
  3. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).
  4. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time. Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).
  5. Xavier, G. M., et al. Hedgehog receptor function during craniofacial development. Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).
  6. Grimsrud, C. D., et al. BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).
  7. MacArthur, C. A., et al. FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development. Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).
  8. Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch. Development. 126 (1), 51-61 (1999).
  9. Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch. Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).
  10. Tabler, J. M., et al. Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes. Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).
  11. Pakvasa, M., et al. Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development. Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).
  12. Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro. Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).
  13. Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells. Development. 115 (1), 133-142 (1992).
  14. Orr-Urtreger, A., Lonai, P. Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo. Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).
  15. Ding, H., et al. The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis. Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).
  16. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  17. He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).
  18. Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 103 (2), 211-225 (2000).
  19. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  20. Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).
  21. Firulli, B. A., Firulli, A. B. Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical. Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).
  22. Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).
  23. Jeong, H. M., et al. Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).
  24. Seo, J. H., et al. Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).
  25. Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation. Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).
  26. Schock, E. N., LaBonne, C. Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development. Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).
  27. Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme. Development. 148 (14), (2021).
  28. Stamm, S. Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).
  29. Szabo, A., Mayor, R. Mechanisms of neural crest migration. Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).
  30. Kindberg, A. A., Bush, J. O. Cellular organization and boundary formation in craniofacial development. Genesis. 57 (1), 23271(2019).
  31. Faundes, V., et al. Raine syndrome: an overview. European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).
  32. Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
  33. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).
  34. Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).
  35. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).
  36. Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/ (2010).
  37. Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
  38. Wang, Y., et al. Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation. Scientific Reports. 5, 15709(2015).
  39. Sharma, S. K., Carew, T. J. Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies. Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).
  40. Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
  41. Hooper, J. E., et al. Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme. Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).
  42. Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. Serum contains a platelet-derived transforming growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).
  43. Swaisgood, H. E. Review and update of casein chemistry. Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).
  44. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).
  45. Salinovich, O., Montelaro, R. C. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Protein Lizat zolasyonuKraniyofasiyal Geli imProtein FosforilasyonuWestern BlotFosfataz nhibit rleriH cre Lizis TamponuSinyal letimi
Fosfoprotein Analizi için Fare Yüz İşlemleri ve Kültürlenmiş Palatal Mezenkim Hücrelerinden Tüm Hücre Protein Lisatlarının İzolasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.